層析法發展簡介

層析法為從複雜之混合物中，利用其在移動相與固定相中分佈程 度不同，進而將各別化合物予以分離、辨識之分析技術，一般移動相 可為氣體、液體或是超臨界流體，固定相則可為液體或固體。層析法 為在 1903 年[20]，由俄羅斯植物學家 Mikhail Tswett，首次發表了有 關層析的演說，當時他利用一支填充有細顆粒的碳酸鈣管柱，分離出 綠色葉子中的葉綠素與葉黃素等各種植物色素，其實驗操作方法，為 將不同植物色素化合物之混合溶液通過細顆粒之碳酸鈣管柱，而被分 離的物種在管柱中顯現出有顏色的層帶，這也是它命名此法為「層析 法」的由來，由於在當時，尚未發展出線上偵測(on-line detection)技 術，故當時的科學家僅能倚靠肉眼來觀察樣品在管柱中分離的情形。

若使用之移動相為液體，固定相為固體支持物，則稱為液相層析 法(liquid chromatography, LC)，於早期的液相層析法，為以直徑 1 到 5 公分，填充固定相長度約 50 至 500 公分之玻璃管柱進行分析操作，

而其固定相為塗佈有吸附性液體之固態顆粒，而使用此種固定相，為 獲得合理之流速，固定相之粒徑則需採用 150 到 200 μm 之粒徑較大 顆粒；而在層析法發展初期，科學家們早已了解減小固定相粒子的尺 寸可以增加管柱效率，於 1960 年中，發展出利用粒徑 50 μm 固定相

材料所填充而成之管柱，在 1960 年末，製造及應用直徑小至 3-10 μm 固定相的技術才被發展出來[21-23]。在過去 40 年裡，液相層析法所 用之固定相材料已發展出許多改進方式使達更加之分離效果，例如從 固定相合成與化學修飾法改進[24]、改變固定相間不同化學鍵結方式 以增加選擇性[25]、增加固定相之化學穩定性[26]、使用直徑小於 2 μm 之固定相材料[27-30]以及將所用固定相形狀改為規則球狀等方式 [31-33]，利用以上所發展出之固定相，可大幅減短分析所需時間，並 可提供更佳之分離效率。然而欲使用以上固定相製作出分離效率較佳 之管柱，則需要可耐高壓條件下操作的儀器設備，因而，古典液相層 析法所使用的簡單玻璃管柱便以不鏽鋼管等耐高壓管柱取代[34-36]，

同時，線上偵測樣品流動訊號的偵測系統便也開始發展起來[37]。除 改良固定相材料外，近年來有許多研究使用管柱內徑較小之管柱，目 前常用的管柱內徑為 4.6 毫米，而為了減少沖提溶劑以及固定相材料 之使用，增加質量靈敏度，以及與質譜儀相容性更高，則發展出使用 窄內徑(narrow-bore)2.1 毫米或 1.0 毫米之之管柱[38-42]，雖然使用窄 內徑管柱具上述之優點，然而有文獻指出[43]，在使用窄內徑時，其 效率卻不如使用內徑 4.6 毫米管柱，因此目前分離常用管柱內徑仍以 4.6 毫米為主。然而在使用上述所提到使用直徑小於 2 μm 之固定相材 料，雖可使分離效率提高，以及可提供較快之分離速度，使得分離所

需時間大幅減短，但此種粒徑小之固定相，卻會造成分離時背壓(back pressure)增大之缺點，根據文獻[44-45]，當粒徑尺寸降低 2 倍時，其 增加之背壓會上升至 4 倍，甚至在填充效率極佳之管柱，當粒徑尺寸 降低 2 倍時，其增加之背壓則會高達 8 倍[46]；傳統之液相層析儀器 設備可提供在約 414 bar(6000 psi)壓力條件下操作，在使用固定相直 徑小於 2 μm 時，則頇搭配可提供更高壓 1000 bar(14500 psi)條件下操 作之儀器設備[47-50]。除背壓問題外，使用粒徑尺寸小之固定相，其 高流速之優點卻伴隨著溫度升高之問題[29,51-52]，以及由儀器與管 路等原因產生之管柱外效應(extra-column effect)[53-56]所造成之波峰 變寬，因此，目前液相層析法發展之重點，除致力於提升管柱分離效 率，並提供較短之分析時間外，解決管柱外效應問題，實驗條件之溫 度與壓力控制，以及儀器設備之改良，皆為重要考量因素。

液相層析法一般所用的偵測器，屬於單通道偵測器，通常銜接於 管柱出口，流經偵測器的樣品訊號通常以「時間對訊號強度值」的方 式記錄。在以上所述的耐高壓之不鏽鋼管柱開始使用後，液相層析管 柱就如同個黑盒子似的，將樣品、移動相以及固定相包覆於其內，分 離的結果仰賴樣品流出管柱抵達管柱外偵測器時所接收到的訊號，然 後再對所得訊號進行研究與探討，故樣品在管內的真實流動情形便無 法直接觀察到了。在操作者無法直接觀察到液相層析管柱中的分離情

形之下，爾後所發展出來解釋樣品分離現象的說法，可能因此而產生 錯誤。