第二章 研究背景與文獻回顧
2.2 帄板理論
在層析的發展史中，有許多解釋區帶擴張的理論被提出來，其中 最廣泛被應用的理論為在 1941 年由諾貝爾獎得主 Martin 和 Synge 所 提出的帄板理論(plate theory)[57]，他們將層析管柱視為類似蒸餾塔，
由無數個獨立但呈現連續的薄層所組成，並將此薄層命名為理論帄板 (theoretical plates)。在每一個帄板中，假設分析物會在分佈在移動相 與固定相之間且可達成帄衡狀態，而分析物在管柱中往下移動，可視 為分析物由一個已達成帄衡之移動相，經由一個帄板以階梯式轉移至 下一個帄板，並不斷地形成新的帄衡。此帄板之高度即為理論板高 (plate height, H or height equivalent to one theoretical plate, HEPT)，此 參數與另一相關參數理論板數(theoretical plate, N)之關係式如下：
N L
H
L：管柱固定相之長度
理論板數N與理論板高H，兩數值常用於評估管柱效率之參數，而N 與H值其原始定義如下式2-2與式2-3(見圖2-1)：
(2-1)
2
H (s)
L
圖 2-1 (a)理論板高之定義 (b)以時間為橫軸之典型層析圖譜
圖(a)中，L 為管柱固定相之長度，(s)為空圖波峰之標準偏差值。理 論板高原始定義為：
圖(b)中，tR：分析物滯留時間，分析物從注入管柱後至抵達管柱外偵 測器所需時間，tM：移動相或無滯留之物種抵達管柱外偵測器所需時 間，在層析峰的兩側轉折點做切線延長，其與層析峰之基線交會長度 即為 W(t)，且 W(t)=4(t)，(t)為時圖波峰標準偏差值。
一分析物A之k值計算方式為： A R M
M
t t k t
2
可將式2-5代入式2-4，可得式2-6
提升層析分離效能的方法除了改善管柱填充條件外，可對分析物 之滯留因子(retention factor, k)做最佳化調整。
對於一分析物A，其k值之可定義如式2-11所示：
KA：分析物A在移動相與固定相之分佈常數(distribution constant)，KA 之定義如式2-12所示：
L：管柱固定相之長度
tR：分析物滯留時間(retention time)，分析物從注入管柱後至抵達管柱 外偵測器所需時間
力，故所選用之移動相會隨著其極性增加而使得其溶劑強度降低。水 為極性較強之溶劑，然而在逆相層析中則屬於溶劑強度較弱的；在逆 相層析分離操作中，常使用水與其他極性有機溶劑混合，以得到不同 溶劑強度的移動相，常用的有機溶劑有甲醇、乙腈(acetonitrile)以及四 氫夫喃(tetrahydrofuran, THF)，其中水在移動相中組成比例越低，移 動相之沖提能力則越強，可減少分析物之滯留時間。
在液相層析中，可搭配等位沖提(isocratic elution)或梯度沖提 (gradient elution)，亦可達到提升分離效率的目標。在沖提過程中，採 用固定移動相組成的沖提過程稱為等位沖提，而在沖提過程中，改變 移動相之組成則為梯度沖提；文獻指出[59-61]，利用梯度沖提可大幅 提高分離效率，常見之梯度沖提有階梯式沖提(stepwise elution)與連續 式沖提(continuous elution)兩種模式，以下將簡單介紹兩梯度沖提模 式。
1. 階梯式沖提(stepwise elution)
此種沖提方式為先使用溶劑強度較弱的移動相沖提，而在某一瞬 間，轉變為溶劑強度較強之移動相，如圖2-2(a)所示，於1974年由 Jandera與Churacek等人提出一系列研究[60,62-66]，將階梯式沖提應用 在液相層析法上，然而此方法發展至今未被廣泛應用之原因為，由於
(a)
(b)
圖 2-2 (a)階梯式沖提示意圖 (b)連續式沖提示意圖
圖(a)階梯式沖提模式中，先以溶劑能力較弱之移動相A進行沖提，在 沖提至3分鐘時，瞬間變化為溶劑能力較強之移動相B
圖(b)連續式沖提模式中，先以溶劑能力較弱之移動相A進行沖提，在 沖提至3分鐘時，以線性方式將移動相成分隨時間變化，並在變化時 間1分鐘後，變換為溶劑能力較強之移動相B
其無法提供較令人滿意之分離情況，故此方法常頇與連續式沖提模式 相結合應用[67-70]，此種沖提模式曾用於分離蛋白質之親和性層析應 用上[71]，首先利用溶劑強度較弱的移動相將樣品帶入親和性管柱中，
故目標物及其類似物會被固定相吸附，其他雜質被沖出管柱，隨後改 變沖提條件，將目標物及其類似物逐一沖出管柱，同時達到萃取、純 化、分離及檢測目標物及其類似物的目的。
2. 連續式沖提(continuous elution)
此種沖提方式為先使用溶劑強度較弱的移動相沖提，而在某一時 間，將移動相成分以線性或非線性隨時間變換成溶劑強度較強的之移 動相，如圖2-2(b)所示，此種模式為梯度沖提較常使用之模式，可成 功用於複雜之混合物分離，例如分離天然物之分離[59,72-74]。
根據上述文獻可總結使用梯度沖提之優點：
(1) 可增強混合物的全面分離能力，提升解析度。
(2) 透過縮短分析物之滯留時間，可大幅減少分析所需時間。
(3) 改善層析圖譜上的波形。
(4) 增加偵測之靈敏度。
2.3 全管柱偵測(whole-column detection, WCD)系統發展簡介
在進行各類的流體實驗如流動注入分析法，液相層析、氣相層析 (gas chromatography, GC)和毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE) 時，一般使用銜接於管柱出口之單通道偵測器來對通過之樣品進行偵 測。流經偵測器的樣品訊號通常以「時間對訊號強度值」的方式記錄，
然後再對所得訊號進行研究與探討。然而，有些科學家認為以上所述 的單通道偵測器並非唯一觀察流體行為之偵測系統，因此開始發展出 多通道偵測(multi-channel detection, MCD)系統，亦即全管柱偵測系統，
這種系統可以瞬間同時的偵測大範圍的樣品訊號，若要完整的研究層 析分離行為的話，全管柱型的偵測器比單通道偵測器更為恰當。
於1988年由Evans和McGuffin，發表第一篇有關多通道偵測系統之 研究[75]，其利用雙通道偵測器來觀察螢光樣品在毛細管中的流動行 為，藉著觀察分析物在2偵測點間的趨勢，可排除分析管柱中所謂的 管柱外效應對樣品產生的影響。之後，Rowlen等人設計了一組解析度 更高的多通道偵測系統[11,76]，將14組紫外光感二極體(UV-sensitive photodiode)架設在玻璃材質的層析管柱外，用來即時觀察樣品在層析 管柱中進行沖提時的遷移分佈情形，對這種偵測系統，作者命名其為 全管柱偵測(whole-column detection, WCD)系統，但在這套偵測系統 開發出來前，作者在1986年便以電腦模擬的方法來表現全管柱偵測器
觀察流體行為的結果[77]，並且提出使用全管柱偵測系統的優點及其 潛力等論述；延續電腦模擬的研究之後，作者著手開發WCD系統，
並 且 以 實 驗 數 據 來 證 實 使 用 WCD 的 確 對 高 效 能 液 相 層 析 (high-performance liquid chromatography, HPLC)有相當地優勢與價值，
其列舉出來可能的優勢如下：
(1) WCD 系統可以真實的記錄樣品於管柱前端、尾端等不同位置的 分佈與流析時間。
(2) 藉由 WCD 系統所獲得的數據，可在尚未進行樣品沖提前幫助準 確預測實驗結果。
(3) 更精確的得到滯留因子。
(4) 可測量移動相與固定相間帄衡的速度。
(5) 可透過實驗證明滯留因子在線性層析(linear chromatography)或非 線性層析(non-linear chromatography)過程中的改變狀況。
當WCD系統的用法及優勢被提出後，相當多的分離科學者開始 改良這套偵測系統，捨棄先前所使用的分離式光能轉換器(discrete photon transducer)，改以電荷耦合元件(charge-coupled device, CCD)為 訊號接受器，CCD為一種陣列式的光電耦合檢像器，上有許多排列整 齊的電容能感應光線，並將影像轉變成數位訊號，在擷取影像時，有 類似傳統底片的感光作用，常被應用於數位相機、光學掃描器與攝影
機等感光元件。CCD的使用大幅增進了WCD系統的效能，其陣列式 的電路排列除了大幅提升偵測器空間解析度外，影像擷取的效果還可 以讓使用者觀察到更生動真實的樣品流動過程，但是由於市售CCD 尺寸上的限制，所以在這套技術發展初期，是用於觀察小範圍毛細管 內 的 樣 品 流 動 情 形 ， 其 中 又 以 觀 察 毛 細 管 導 電 聚 焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF)實驗中樣品流體行為之研究最為常見。第一 次以WCD系統來觀察毛細管等電聚焦系統的科學家是Wu等人[78]，
作者以雷射光源激發管內樣品使其放光，然後以全管柱影像偵測 (whole-column imaging-detection, WCID)技術獲得樣品在毛細管內的 分佈影像，其觀察視窗為15 mm；隨後，作者以不同的偵測機制來觀 察CIEF的實驗結果，以提升WCID的應用性，例如螢光偵測法及吸收 光偵測法[79-84]。在WCD系統的發展史中，CCD的裝置與使用方法 多有不同，有些學者是以CCD直接收集光訊號然後轉換成電訊號來進 行研究分析，有些則是將CCD搭配光學設計的零件來獲得更寬廣之觀 察範圍的訊號，例如使用數位攝影鏡頭來收集樣品移動影像，Nilsson 等人就是以CCD攝影機來記錄毛細管電泳實驗中的DNA片段的螢光 影像[85-86]。甚至有科學家使用WCD系統來獲得部分實驗參數後，
透過5 cm之觀察視窗，便可預測在CIEF實驗中，分離150種樣品之混 合物的分析結果[87]。
在液相層析的發展初期，為以具透光性之玻璃材質的層析管柱來 進行分離實驗，因此在WCD技術開始發展後，便有科學家使用錄影 影像(video-imaging)擷取的偵測方法來觀察填充固定相後的玻璃管柱 內樣品位移的情形，Tamura等人以CCD攝影鏡頭來直接記錄發螢光 樣 品 在 逆 相 高 效 能 層 析 (reversed-phase high performance liquid chromatography)玻璃管柱中的分離過程影像[88-89]。Guiochon等人也 設計了一套WCD系統，用來收集層析系統中樣品沖提過程中的影像 訊號[90-92]，並且指出一般HPLC管柱中常用來防止固定相流失的擋 板(frit)也會對樣品在空間上的波形產生影響。以上所介紹的這些 WCD系統，都是以影像收集的方法獲得在玻璃管柱內樣品位移過程 中的空間濃度分佈，然後再進一步地將影像結果透過軟體轉換成數位 訊號來進行分析處理，這樣的技術較先前所提的以光能轉換器為訊號 收集器的偵測方法，大幅提升了其空間解析度，並且可以獲得物質遷 移過程中的三維資訊：樣品遷移時間、樣品濃度強度(peak height)、
樣品分佈範圍(peak width)，藉由獲得更多樣品在層析過程中的動態層 析資訊(dynamic chromatography information)，將有助於分析管柱內所 發生的層析流體行為，進而改善實驗條件來達到分離效率提升的目
樣品分佈範圍(peak width)，藉由獲得更多樣品在層析過程中的動態層 析資訊(dynamic chromatography information)，將有助於分析管柱內所 發生的層析流體行為，進而改善實驗條件來達到分離效率提升的目