以全管柱偵測法探討液相層析之波峰壓縮效應

國立交通大學

應用化學研究所

碩士論文

以全管柱偵測法探討液相層析之波峰壓縮效應

Peak Compression Effects in Liquid Chromatography

Examined Using Whole-Column Detection

研 究 生：周宜儒

指導教授：余 艇 博士

以全管柱偵測法探討液相層析之波峰壓縮效應

Peak Compression Effects in Liquid Chromatography

Examined Using Whole-Column Detection

研 究 生：周宜儒 Student：Yi-Ru Chou

指導教授：余 艇 博士 Advisor：Dr. Tiing Yu

國立交通大學

應用化學研究所

碩 士 論 文

A Thesis

Submitted to Department of Applied Chemistry College of Science

National Chiao Tung University in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master In

Applied Chemistry June 2011

Hsinchu, Taiwan, Republic of China.

以全管柱偵測法探討液相層析之波峰壓縮效應

學生：周宜儒 指導教授：余 艇 國立交通大學應用化學研究所 摘要 樣品甫注入液相層析管柱時，會產生波峰壓縮效應，另一種波峰 壓縮效應則發生於梯度沖提時，於兩溶劑強度不同之移動相交界處。 本研究以全管柱偵測(whole-column detection, WCD)系統觀察以上兩 種波峰壓縮效應，全管柱偵測系統可直接觀察梯度沖提過程中的以空 間與以時間為座標軸之波峰變化。 在管柱入口處樣品波峰寬度和滯留因子 k 有很高的相關性，在管 柱入口約一公分處，樣品波峰在空間座標之標準差和 1/(1+k)成線性 關係，在填充效率較好之管柱中，使用溶劑強度較小之移動相沖提， 會產生較大的 k 值，當樣品分子位移至管柱末端時，其波峰寬度比使 用溶劑強度較大之移動相沖提可能會較狹窄；然而，使用填充效率較 差之管柱，以較大 k 值移動相沖提，當樣品波峰位移至管柱末端時， 波峰寬度則可能會較寬。以連續式沖提，其理論板數之增加會超過使 用階梯式沖提之理論板數增加。在本研究中，我們以樣品移動速率為 基礎來計算梯度沖提之理論板數，和傳統方式計算理論板數相比，其

Peak Compression Effects in Liquid Chromatography

Examined Using Whole-Column Detection

Student：Yi-Ru Chou Advisor：Tiing Yu Institute of Applied Chemistry

National Chiao Tung University

Abstract

Peak compression occurred when a sample solution was injected into a liquid chromatographic column. Another compression phenomenon took place at the interface of the two mobile phases with different solvent strengths under a gradient elution. We examined both effects using a whole-column detection (WCD) system which enabled direct observations of both the spatial and temporal peak profiles during the elution.

The sample peak width at the column inlet was highly related to the retention factor k. The peak standard deviation on the spatial coordinate was linearly proportional to 1/(1+k) at the column position ~1 cm. The peak width might stay narrower at the column outlet for a chromatographic run of a large k compared with a run of a small k with the use of a column with good efficiency. However, the peak width of a large k might become wider at the column outlet with the use of a low-efficiency column. The plate number increase of the continuous gradient prevailed over that of the stage-wise gradient. Plate numbers for gradient elutions were calculated in this study based on analyte moving

rates. The results gave significant improvements, up to four folds in some experiments, compared with the use of conventional equations.

誌謝 二年的研究所生涯以及新竹生活將在此告一段落，回想起這期間 的點滴，開心與難過時光，都將成為人生中美好的回憶。 首先感謝恩師余艇教授，在實驗與研究上的指導，使我可以順利 完成碩士學位，接著感謝口試委員白書禎教授與謝有容教授，能抽空 來參加我的口試，並對於我的研究與論文內容提出糾正和指點，使我 的論文內容及研究成果更臻完美。 超級感謝淑慧學姊，總是不厭其煩的教導我，總能在我迷惘時為 我解惑。也感謝育國學長、典祐學長以及伶宜學姊在實驗上的熱心幫 助，也謝謝實驗室夥伴詩軒與士峯，帄日的幫忙與協助，還有感謝沛 穎、俐揚、泓哲以及柏森替我張羅口試相關的東西，也為實驗室增添 歡樂的氣氛，祝你們明年都順利畢業。感謝鈴宛、佑勳、芝綺與姝怡 在新竹的陪伴，有你們真好！再來感謝台中的知己們，家琪、涵菁、 文慈、家慧、有妏、韻茜以及孟臻，總是讓我回到台中好快樂，也感 謝大學的麻吉們琬祺、鈺堯、舒涵、漪彤、哲宇、佩琪與鼎瑋帄日的 支持與打氣，最後感謝我的同鄉們千惠、小凡、品卉以及宥儒在家鄉 給我的溫暖。 當然最最最重要的是感謝我的家人，因為有你們的支持與關心， 我才能無後顧之憂的專心完成碩士學位。 宜儒畢業了！即將告別學生身分，返回台中，進入人生下一個階 段。

目錄

中文摘要 ... i 英文摘要 ... iii 誌謝 ... v 目錄 ... vi 圖目錄 ... x 表目錄 ... xiii 第一章 緒論... 1 1.1 前言 ... 1 1.2 研究動機 ... 2 第二章 研究背景與文獻回顧 ... 4 2.1 層析法發展簡介... 4 2.2 帄板理論 ... 7 2.3 全管柱偵測系統發展簡介 ... 16 2.4 波峰壓縮效應 ... 20 2.4.1 樣品注入管柱入口端之波峰壓縮效應 ... 20 2.4.2 非線性層析之波峰壓縮效應 ... 22 第三章 實驗... 24 3.1 實驗藥品 ... 24

3.2 儀器裝置 ... 24 3.3 儀器組裝及各裝置介紹 ... 25 3.3.1 管柱 ... 25 3.3.1.1 自製 HPLC 管柱－管柱 1、2 ... 25 3.3.1.2 玻璃管柱－管柱 3 ... 30 3.3.2 WCD 系統 ... 30 3.3.3 WCD 系統操作界面設定 ... 34 3.4 數據類型定義 ... 36 3.5 實驗流程 ... 40 3.6 實驗步驟 ... 41 3.6.1 等位沖提 ... 41 3.6.2 梯度沖提 ... 41 3.6.2.1 階梯式沖提 ... 43 3.6.2.2 連續式沖提 ... 44 第四章 結果與討論（一）－樣品注入管柱入口端之波峰壓縮效應 45 4.1 數據處理 ... 45 4.2 波形參數指標 ... 45 4.3 數據結果討論 ... 47 4.3.1 管柱外 UV/Vis 偵測器數據討論 ... 47

4.3.2 管內空時圖數據討論 ... 47 4.3.2.1 空時差異 ... 52 4.3.2.2 樣品注入管柱入口端之波峰壓縮效應 ... 61 4.3.2.3 波峰寬度對應管柱位置 ... 64 第五章 結果與討論（二）－非線性層析之波峰壓縮效應 ... 73 5.1 梯度沖提結果 ... 73 5.1.1 階梯式沖提 ... 74 5.1.2 連續式沖提 ... 77 5.2 理論板數討論 ... 81 5.3 樣品移速計算 ... 84 5.3.1 階梯式沖提樣品移速計算... 85 5.3.2 連續式沖提樣品移速計算... 86 5.4 理論板數計算 ... 90 5.4.1 階梯式沖提理論板數計算... 94 5.4.2 連續式沖提理論板數計算... 94 5.5 理論板數比較 ... 98 5.5.1 梯度沖提與等位沖提實驗，空間單位理論 _{板數 N 值比較 ... 98} 5.5.2 梯度沖提與等位沖提實驗，時間單位理論

_{板數 N} t值比較 ... 104 5.5.3 梯度沖提實驗，空間單位理論板數 N 值比較 ...104 5.5.4 梯度沖提實驗，時間單位理論板數 Nt值比較 ... 108 5.5.5 梯度沖提實驗，管外時圖之時間單位理論 板數 Nt與 Nt*值比較 ... 110 第六章 結論... 112 參考文獻 ... 114 附錄 ... 123

圖目錄

圖 2-1 (a)理論板高之定義 (b)以時間為橫軸之典型層析圖譜 ... 8 圖 2-2 (a)階梯式沖提示意圖 (b)連續式沖提示意圖 ... 14 圖 3-1 實驗裝置圖... 26 圖 3-2 管柱 1、2 結構圖 ... 29 圖 3-3 管柱 3 結構圖 ... 31 圖 3-4 詳細實驗裝置圖 ... 33 圖 3-5 電腦操作界面圖 ... 35 圖 3-6 管外時圖和管內空圖的定義 ... 37 圖 3-7 遷移路徑圖與遷移曲線之定義 ... 39 圖 3-8 梯度沖提所設計之兩種實驗模式 ... 44 圖 4-1 三管柱於等位沖提實驗中，管外時圖結果 ... 48 圖 4-2 三管柱於等位沖提實驗中，樣品之遷移路徑圖 ... 50 圖 4-3 管柱 1 於等位沖提實驗中，管內空圖結果 ... 53 圖 4-4 管柱 2 於等位沖提實驗中，管內空圖結果 ... 54 圖 4-5 管柱 3 於等位沖提實驗中，管內空圖結果 ... 55 圖 4-6 管柱 1 於等位沖提實驗中，管內時圖結果 ... 56 圖 4-7 管柱 2 於等位沖提實驗中，管內時圖結果 ... 57 圖 4-8 管柱 3 於等位沖提實驗中，管內時圖結果 ... 58

圖 4-9 三管柱等位沖提實驗中，管外時圖與管柱內 17 公分處 管內空時圖波寬比例關係圖 ... 59 圖 4-10 三管柱在等位沖提實驗中，不同 k 值的條件以 1/(1+k) 對空間波峰寬度(s)作圖 ... 63 圖 4-11 三管柱在等位沖提實驗中，以空間波峰寬度(s) 2_， 對於管柱位置作圖 ... 65 圖 4-12 三管柱在等位沖提實驗中，以時間波峰寬度(t) 2_， 對於管柱位置作圖 ... 67 圖 4-13 樣品在填充效率較差之管柱流動情形示意圖 ... 71 圖 4-14 樣品在填充效率較佳之管柱流動情形示意圖 ... 72 圖 5-1 階梯式沖提實驗中，管內空圖結果 ... 75 圖 5-2 階梯式沖提實驗中，管內時圖結果 ... 76 圖 5-3 階梯式沖提實驗中，樣品之遷移路徑圖 ... 78 圖 5-4 連續式沖提實驗中，管內空圖結果 ... 79 圖 5-5 連續式沖提實驗中，管內時圖結果 ... 80 圖 5-6 連續式沖提實驗中，樣品之遷移路徑圖 ... 82 圖 5-7 等位沖提實驗中，所計算出之三種理論板數 ... 91 圖 5-8 階梯式沖提 4 組實驗中，所計算出之理論板數 ... 95 圖 5-9 連續式沖提 4 組實驗中，所計算出之理論板數 ... 99

表目錄

表 3-1 本實驗所使用三種管柱之詳細規格 ... 27 表 3-2 等位沖提實驗中，移動相組成比例與數據取點間距時間 ... 42 表 3-3 兩種梯度沖提實驗中，數據取點間距時間 ... 43 表 4-1 等位沖提實驗中，樣品於三管柱之管外時圖波形指標 ... 49 表 4-2 等位沖提實驗中，三管柱遷移曲線斜率與管外時圖 所計算而得的樣品移速之數據比較 ... 51 表 4-3 等位沖提實驗中，三管柱之樣品在不同 k 值條件下， 管外時圖與管柱內 17 公分處管內空時圖波比例數據 ... 60 表 4-4 等位沖提實驗中，三管柱之空間波峰寬度 ... 66 表 4-5 等位沖提實驗中，三管柱之時間波峰寬度 ... 68 表 5-1 等位沖提實驗中，在不同移動相下的樣品移速 ... 85 表 5-2 階梯式沖提實驗中，樣品在管柱不同位置之移動速度 與樣品在管柱中之帄均移動速度，以及差異值計算 ... 87 表 5-3 連續式沖提實驗中，樣品在管柱不同位置之移動速度 與樣品在管柱中之帄均移動速度，以及差異值計算 ... 89 表 5-4 等位沖提實驗 1 至 4 所算出之理論板數與差異值 ... 92 表 5-5 等位沖提實驗 5 至 7 所算出之理論板數與差異值 ... 93 表 5-6 階梯式沖提實驗 1 及 2 所計算出之理論板數與差異值 ... 96

表 5-7 階梯式沖提實驗 3 及 4 所計算出之理論板數與差異值 ... 97 表 5-8 連續式沖提實驗 1 及 2 所計算出之理論板數與差異值 ... 100 表 5-9 連續式沖提實驗 3 及 4 所計算出之理論板數與差異值 ... 101 表 5-10 階梯式沖提與等位沖提實驗，空圖理論板數 N 值比較 ... 102 表 5-11 階梯式沖提與等位沖提實驗，時圖理論板數 Nt值比較 ... 103 表 5-12 連續式沖提與等位沖提實驗，空圖理論板數 N 值比較 ... 105 表 5-13 連續式沖提與等位沖提實驗，時圖理論板數 Nt值比較 ... 106 表 5-14 梯度沖提實驗，管外時圖理論板數 Nt與 Nt*值比較 ... 111 附錄 A-1 等位沖提實驗，管內空圖之波峰位置所對應取點時間 ... 123 附錄 A-2 梯度沖提實驗，管內空圖之波峰位置所對應取點時間 ... 124 附錄 A-3 三管柱在等位沖提實驗中，以空間波峰寬度(s) 2_{，對於管柱} 位置作圖所得線性斜率與 R2_{值 ... 125} 附錄 A-4 三管柱在等位沖提實驗中，以時間波峰寬度(t) 2_{，對於管柱} 位置作圖所得線性斜率與 R2_{值 ... 126}

第一章 緒論 1.1 前言 層析法(chromatography)是一種可應用到各科學部門的分離方法， 由於有許多新型層析技術的發展，使得其應用在過去五十年間有巨幅 的成長。這些方法對科學界的巨大衝擊，可由1952年諾貝爾獎頒發給 Martin和Synge以獎勵他們在此領域的貢獻而得到佐證，更令人印象 深刻的是，在1937年到1972年間可列出12個諾貝爾獎，在他們的研究 工作中層析法扮演重要的角色[1]，可以見得層析法對科學界的重要 性。 在液相層析法(liquid chromatography, LC)中，為利用樣品在固定

相(stationary phase)以及移動相(mobile phase)間作用力不同，而在移動

相與固定相間分佈之差異，造成各成分物被沖提的速率不同，而達到 區帶分離的目的。 液相層析法一般所用的偵測器，屬於單通道偵測器(single-channel detector)類型，即為一種將管柱流出物中之樣品成分含量與含量變化 轉換成訊號輸出的裝置。根據Pai所發表之文獻[2-3]指出：「由一般單 通道偵測器所獲得以時間單位為橫軸的圖譜，並非樣品在層析管柱中 的真實空間分佈，進而使得測量結果與樣品在管柱內瞬間空間分佈有

一定差異。」此差異稱為「空時差異」，即在忽略時間效應(temporal

effect)的情況下，會對一般偵測器所收集到的訊號產生錯誤的解釋，

且Pai認為，此種空時差異的現象普遍地存在於採用一般單通道偵測

器流動形系統內，不僅在流動注入分析系統(flow injection analysis,

FIA)[4-7]，亦會發生於被廣泛使用的層析系統裡[8]。在Pai所發表之 文獻中，亦暗示傳統層析理論需要做修正，並且陸續發展出一系列模 擬層析行為之理論公式，要證實其公式之正確性，除了必頇得到一般 樣品流經管柱後之層析圖譜訊號，亦必頇獲得在沖提過程中，於管柱 內 的 樣 品空 間分佈 訊 號 ，故 本研究 室 設 計出 一套全 管 柱 型偵 測 (whole-column detection, WCD)系統，具大範圍觀測視窗(長達21公分)， 可完整記錄層析管柱內樣品波形分佈，結合單通道偵測器，組成一套 完整的多功能偵測系統，能同步觀察管柱內、外之樣品流析訊號，獲 得管柱內空間及時間之實驗數據，並透過全管柱偵測系統，研究層析

波峰壓縮效應(peak compression effect)之現象，對部分有疏失之層析

理論進行修正[3,9-10]。

1.2 研究動機

在文獻中提及[11-13]，樣品在注入管柱入口端時，會產生波峰壓

空間波峰寬度(s)會與 成正比之關係，即在k值較大之條件下， 其管柱入口端之空間波峰寬度(s)會呈現較窄之情況，然而文獻中則 缺乏詳細實驗數據可佐證此一關係式，故啟發了本研究之實驗動機； 我們以自行填充之玻璃管柱，搭配本實驗室所開發出之全管柱偵測系 統，來觀察樣品在玻璃管柱中之完整流動訊號，並觀察樣品在管柱入 口端之波峰壓縮效應。文獻指出[14-16]，在進行非線性層析系統下， 當變換移動相組成使其溶劑強度改變時，亦會產生波峰壓縮效應之現 象，在文獻[17-19]中提出非線性層析系統下之理論板數計算，但所提 出之計算公式，需要考量許多參數，公式相當複雜且艱澀難懂，因此 在本研究中利用全管柱偵測系統，觀察在非線性層析系統中波峰壓縮 效應之現象，並提出較正確與簡單的方式，計算出非線性層析系統下 之理論板數。 1 1 k

第二章 研究背景與文獻回顧 2.1 層析法發展簡介 層析法為從複雜之混合物中，利用其在移動相與固定相中分佈程 度不同，進而將各別化合物予以分離、辨識之分析技術，一般移動相 可為氣體、液體或是超臨界流體，固定相則可為液體或固體。層析法 為在 1903 年[20]，由俄羅斯植物學家 Mikhail Tswett，首次發表了有 關層析的演說，當時他利用一支填充有細顆粒的碳酸鈣管柱，分離出 綠色葉子中的葉綠素與葉黃素等各種植物色素，其實驗操作方法，為 將不同植物色素化合物之混合溶液通過細顆粒之碳酸鈣管柱，而被分 離的物種在管柱中顯現出有顏色的層帶，這也是它命名此法為「層析 法」的由來，由於在當時，尚未發展出線上偵測(on-line detection)技 術，故當時的科學家僅能倚靠肉眼來觀察樣品在管柱中分離的情形。 若使用之移動相為液體，固定相為固體支持物，則稱為液相層析 法(liquid chromatography, LC)，於早期的液相層析法，為以直徑 1 到 5 公分，填充固定相長度約 50 至 500 公分之玻璃管柱進行分析操作， 而其固定相為塗佈有吸附性液體之固態顆粒，而使用此種固定相，為 獲得合理之流速，固定相之粒徑則需採用 150 到 200 μm 之粒徑較大 顆粒；而在層析法發展初期，科學家們早已了解減小固定相粒子的尺 寸可以增加管柱效率，於 1960 年中，發展出利用粒徑 50 μm 固定相

材料所填充而成之管柱，在 1960 年末，製造及應用直徑小至 3-10 μm 固定相的技術才被發展出來[21-23]。在過去 40 年裡，液相層析法所 用之固定相材料已發展出許多改進方式使達更加之分離效果，例如從 固定相合成與化學修飾法改進[24]、改變固定相間不同化學鍵結方式 以增加選擇性[25]、增加固定相之化學穩定性[26]、使用直徑小於 2 μm 之固定相材料[27-30]以及將所用固定相形狀改為規則球狀等方式 [31-33]，利用以上所發展出之固定相，可大幅減短分析所需時間，並 可提供更佳之分離效率。然而欲使用以上固定相製作出分離效率較佳 之管柱，則需要可耐高壓條件下操作的儀器設備，因而，古典液相層 析法所使用的簡單玻璃管柱便以不鏽鋼管等耐高壓管柱取代[34-36]， 同時，線上偵測樣品流動訊號的偵測系統便也開始發展起來[37]。除 改良固定相材料外，近年來有許多研究使用管柱內徑較小之管柱，目 前常用的管柱內徑為 4.6 毫米，而為了減少沖提溶劑以及固定相材料 之使用，增加質量靈敏度，以及與質譜儀相容性更高，則發展出使用 窄內徑(narrow-bore)2.1 毫米或 1.0 毫米之之管柱[38-42]，雖然使用窄 內徑管柱具上述之優點，然而有文獻指出[43]，在使用窄內徑時，其 效率卻不如使用內徑 4.6 毫米管柱，因此目前分離常用管柱內徑仍以 4.6 毫米為主。然而在使用上述所提到使用直徑小於 2 μm 之固定相材 料，雖可使分離效率提高，以及可提供較快之分離速度，使得分離所

需時間大幅減短，但此種粒徑小之固定相，卻會造成分離時背壓(back pressure)增大之缺點，根據文獻[44-45]，當粒徑尺寸降低 2 倍時，其 增加之背壓會上升至 4 倍，甚至在填充效率極佳之管柱，當粒徑尺寸 降低 2 倍時，其增加之背壓則會高達 8 倍[46]；傳統之液相層析儀器 設備可提供在約 414 bar(6000 psi)壓力條件下操作，在使用固定相直 徑小於 2 μm 時，則頇搭配可提供更高壓 1000 bar(14500 psi)條件下操 作之儀器設備[47-50]。除背壓問題外，使用粒徑尺寸小之固定相，其 高流速之優點卻伴隨著溫度升高之問題[29,51-52]，以及由儀器與管 路等原因產生之管柱外效應(extra-column effect)[53-56]所造成之波峰 變寬，因此，目前液相層析法發展之重點，除致力於提升管柱分離效 率，並提供較短之分析時間外，解決管柱外效應問題，實驗條件之溫 度與壓力控制，以及儀器設備之改良，皆為重要考量因素。 液相層析法一般所用的偵測器，屬於單通道偵測器，通常銜接於 管柱出口，流經偵測器的樣品訊號通常以「時間對訊號強度值」的方 式記錄。在以上所述的耐高壓之不鏽鋼管柱開始使用後，液相層析管 柱就如同個黑盒子似的，將樣品、移動相以及固定相包覆於其內，分 離的結果仰賴樣品流出管柱抵達管柱外偵測器時所接收到的訊號，然 後再對所得訊號進行研究與探討，故樣品在管內的真實流動情形便無 法直接觀察到了。在操作者無法直接觀察到液相層析管柱中的分離情

形之下，爾後所發展出來解釋樣品分離現象的說法，可能因此而產生 錯誤。 2.2 帄板理論(plate theory) 在層析的發展史中，有許多解釋區帶擴張的理論被提出來，其中 最廣泛被應用的理論為在 1941 年由諾貝爾獎得主 Martin 和 Synge 所 提出的帄板理論(plate theory)[57]，他們將層析管柱視為類似蒸餾塔， 由無數個獨立但呈現連續的薄層所組成，並將此薄層命名為理論帄板 (theoretical plates)。在每一個帄板中，假設分析物會在分佈在移動相 與固定相之間且可達成帄衡狀態，而分析物在管柱中往下移動，可視 為分析物由一個已達成帄衡之移動相，經由一個帄板以階梯式轉移至 下一個帄板，並不斷地形成新的帄衡。此帄板之高度即為理論板高

(plate height, H or height equivalent to one theoretical plate, HEPT)，此

參數與另一相關參數理論板數(theoretical plate, N)之關係式如下： L N H  L：管柱固定相之長度 理論板數N與理論板高H，兩數值常用於評估管柱效率之參數，而N 與H值其原始定義如下式2-2與式2-3(見圖2-1)： (2-1)

2 (s) H L   圖 2-1 (a)理論板高之定義 (b)以時間為橫軸之典型層析圖譜 圖(a)中，L 為管柱固定相之長度，(s)為空圖波峰之標準偏差值。理 論板高原始定義為： 圖(b)中，tR：分析物滯留時間，分析物從注入管柱後至抵達管柱外偵 測器所需時間，tM：移動相或無滯留之物種抵達管柱外偵測器所需時 間，在層析峰的兩側轉折點做切線延長，其與層析峰之基線交會長度 即為 W(t)，且 W(t)=4(t)，(t)為時圖波峰標準偏差值。 一分析物A之k值計算方式為： A R M M t t k t  

2 2 (s) L N   2 (s) H L   N：理論板數 H：理論板高 L：管柱固定相之長度 (s)：空間波峰標準偏差 層析管柱之分離效率隨著理論板數的增加以及理論板高的減小 而增加，然而通常管柱效率有明顯的差異之原因為管柱形式、移動相 與固定相選擇不同所導致[58]，然而一般常用之偵測器，所得之訊號 是以時間為橫軸之典型層析圖譜，據文獻指出[58]，樣品在抵達層析 管柱末端之空間波峰標準偏差(s)與所層析圖譜獲得之時間波峰準偏 差(t)之關係如式2-4所示： (s) (t) R / L t    L/tR：分析物在管柱中之移動速度，L/tR=um 然而在高斯波形下，時間波峰標準偏差(t)與波峰寬度W(t)有如式2-5 之關係 (t)

4

(t)

W





(2-2) (2-3) (2-4) (2-5)

可將式2-5代入式2-4，可得式2-6 (t) (s) R 4 LW t   將式2-6代入式2-2與式2-3即得到式2-7與式2-8 2 R (t) 16 ( t ) N W   2 (t) 2 R 16 LW H t  N：以時間單位計算所得理論板數 W(t)：層析時圖所得到波峰底部寬度(見圖2-1) tR：分析物滯留時間(retention time)，分析物從注入管柱後抵達管柱外 偵測器所需時間 藉由上述速度的轉換，可將空間計算理論板數方式轉換為時間計 算理論板數，即可透過式2-7及式2-8計算出理論板數以及理論板高。 另一種求得理論板數與理論板高的方法為使用W1/2(t)這個參數，此為 波峰最大高度之一半位置處的兩側波峰寬度總和。故理論板數與理論 板高可以式2-9及式2-10求得： 2 R 1/2(t) 5.54 ( t ) N W   1/2(t) 2 2 R ( ) 5.54 W L H t  W1/2(t)：層析時圖上波峰最大高度之一半位置處的兩側波峰寬度總和 (2-7) (2-8) (2-9) (2-10) (2-6)

提升層析分離效能的方法除了改善管柱填充條件外，可對分析物 之滯留因子(retention factor, k)做最佳化調整。 對於一分析物A，其k值之可定義如式2-11所示： A S M K V k V  VS：管柱中固定相之體積 VM：管柱中移動相之體積 KA：分析物A在移動相與固定相之分佈常數(distribution constant)，KA 之定義如式2-12所示： S A M C K C  CS：分析物A在固定相的莫耳分析濃度值 CM：分析物A在移動相的莫耳分析濃度值 另外可利用將分析物在管柱中之移動速率表示成移動相速率之分率 形式[52]，如式2-13所示： 0 0 1 1 1 1 m L u u k t k       um：分析物在管柱中之移動速率 u0：移動相在管柱中之移動速率, u0=L/t0 (2-11) (2-12) (2-13)

L：管柱固定相之長度 tR：分析物滯留時間(retention time)，分析物從注入管柱後至抵達管柱 外偵測器所需時間 t0：移動相或無滯留之物種抵達管柱外偵測器所需時間 可透過式2-13轉換，獲得另一k之計算方式，如式2-14所示： R 0 0 t t k t   tR與t0值都可透過由管柱外偵測器所獲得之層析圖譜中觀測到，因此 可藉由層析圖譜中來計算一分析物之k值(見圖2-1)。 在液相層析中，要調整k值之大小，最簡單的方法為透過改變移 動相之溶劑組成，不同的移動相具有不同的溶劑強度(solvent strength)， 所謂的溶劑強度是指溶劑與溶質間的作用力程度，與溶質具強烈作用 力之溶劑，通常稱為「強」溶劑，當移動相的溶劑強度大時，表示在 沖提過程中，樣品受到移動相的作用力大，因此樣品較不容易受固定 相滯留，因此可透過改變移動相組成使其溶劑強度改變，使分析物之 滯留時間產生變化，藉此調控k值大小。在逆相層析法(reversed-phase chromatography)中，採用非極性之固定相，為矽氧烷類之官能基所組 成 ， 其 中 所 用 烷 類 取 代 基 常 為 C18鏈 ， 此 類 型 固 定 相 名 為 Octadecylsilane(ODS)；分析物與固定相之作用力主要為非極性之分散 (2-14)

力，故所選用之移動相會隨著其極性增加而使得其溶劑強度降低。水 為極性較強之溶劑，然而在逆相層析中則屬於溶劑強度較弱的；在逆 相層析分離操作中，常使用水與其他極性有機溶劑混合，以得到不同 溶劑強度的移動相，常用的有機溶劑有甲醇、乙腈(acetonitrile)以及四 氫夫喃(tetrahydrofuran, THF)，其中水在移動相中組成比例越低，移 動相之沖提能力則越強，可減少分析物之滯留時間。 在液相層析中，可搭配等位沖提(isocratic elution)或梯度沖提 (gradient elution)，亦可達到提升分離效率的目標。在沖提過程中，採 用固定移動相組成的沖提過程稱為等位沖提，而在沖提過程中，改變 移動相之組成則為梯度沖提；文獻指出[59-61]，利用梯度沖提可大幅 提高分離效率，常見之梯度沖提有階梯式沖提(stepwise elution)與連續 式沖提(continuous elution)兩種模式，以下將簡單介紹兩梯度沖提模 式。 1. 階梯式沖提(stepwise elution) 此種沖提方式為先使用溶劑強度較弱的移動相沖提，而在某一瞬 間，轉變為溶劑強度較強之移動相，如圖2-2(a)所示，於1974年由 Jandera與Churacek等人提出一系列研究[60,62-66]，將階梯式沖提應用 在液相層析法上，然而此方法發展至今未被廣泛應用之原因為，由於

(a) (b) 圖 2-2 (a)階梯式沖提示意圖 (b)連續式沖提示意圖 圖(a)階梯式沖提模式中，先以溶劑能力較弱之移動相A進行沖提，在 沖提至3分鐘時，瞬間變化為溶劑能力較強之移動相B 圖(b)連續式沖提模式中，先以溶劑能力較弱之移動相A進行沖提，在 沖提至3分鐘時，以線性方式將移動相成分隨時間變化，並在變化時 間1分鐘後，變換為溶劑能力較強之移動相B

其無法提供較令人滿意之分離情況，故此方法常頇與連續式沖提模式 相結合應用[67-70]，此種沖提模式曾用於分離蛋白質之親和性層析應 用上[71]，首先利用溶劑強度較弱的移動相將樣品帶入親和性管柱中， 故目標物及其類似物會被固定相吸附，其他雜質被沖出管柱，隨後改 變沖提條件，將目標物及其類似物逐一沖出管柱，同時達到萃取、純 化、分離及檢測目標物及其類似物的目的。 2. 連續式沖提(continuous elution) 此種沖提方式為先使用溶劑強度較弱的移動相沖提，而在某一時 間，將移動相成分以線性或非線性隨時間變換成溶劑強度較強的之移 動相，如圖2-2(b)所示，此種模式為梯度沖提較常使用之模式，可成 功用於複雜之混合物分離，例如分離天然物之分離[59,72-74]。 根據上述文獻可總結使用梯度沖提之優點： (1) 可增強混合物的全面分離能力，提升解析度。 (2) 透過縮短分析物之滯留時間，可大幅減少分析所需時間。 (3) 改善層析圖譜上的波形。 (4) 增加偵測之靈敏度。

2.3 全管柱偵測(whole-column detection, WCD)系統發展簡介

在進行各類的流體實驗如流動注入分析法，液相層析、氣相層析

(gas chromatography, GC)和毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)

時，一般使用銜接於管柱出口之單通道偵測器來對通過之樣品進行偵 測。流經偵測器的樣品訊號通常以「時間對訊號強度值」的方式記錄， 然後再對所得訊號進行研究與探討。然而，有些科學家認為以上所述 的單通道偵測器並非唯一觀察流體行為之偵測系統，因此開始發展出 多通道偵測(multi-channel detection, MCD)系統，亦即全管柱偵測系統， 這種系統可以瞬間同時的偵測大範圍的樣品訊號，若要完整的研究層 析分離行為的話，全管柱型的偵測器比單通道偵測器更為恰當。 於1988年由Evans和McGuffin，發表第一篇有關多通道偵測系統之 研究[75]，其利用雙通道偵測器來觀察螢光樣品在毛細管中的流動行 為，藉著觀察分析物在2偵測點間的趨勢，可排除分析管柱中所謂的 管柱外效應對樣品產生的影響。之後，Rowlen等人設計了一組解析度 更高的多通道偵測系統[11,76]，將14組紫外光感二極體(UV-sensitive photodiode)架設在玻璃材質的層析管柱外，用來即時觀察樣品在層析 管柱中進行沖提時的遷移分佈情形，對這種偵測系統，作者命名其為 全管柱偵測(whole-column detection, WCD)系統，但在這套偵測系統 開發出來前，作者在1986年便以電腦模擬的方法來表現全管柱偵測器

觀察流體行為的結果[77]，並且提出使用全管柱偵測系統的優點及其

潛力等論述；延續電腦模擬的研究之後，作者著手開發WCD系統，

並 且 以 實 驗 數 據 來 證 實 使 用 WCD 的 確 對 高 效 能 液 相 層 析

(high-performance liquid chromatography, HPLC)有相當地優勢與價值，

其列舉出來可能的優勢如下： (1) WCD 系統可以真實的記錄樣品於管柱前端、尾端等不同位置的 分佈與流析時間。 (2) 藉由 WCD 系統所獲得的數據，可在尚未進行樣品沖提前幫助準 確預測實驗結果。 (3) 更精確的得到滯留因子。 (4) 可測量移動相與固定相間帄衡的速度。 (5) 可透過實驗證明滯留因子在線性層析(linear chromatography)或非 線性層析(non-linear chromatography)過程中的改變狀況。 當WCD系統的用法及優勢被提出後，相當多的分離科學者開始 改良這套偵測系統，捨棄先前所使用的分離式光能轉換器(discrete

photon transducer)，改以電荷耦合元件(charge-coupled device, CCD)為

訊號接受器，CCD為一種陣列式的光電耦合檢像器，上有許多排列整

齊的電容能感應光線，並將影像轉變成數位訊號，在擷取影像時，有

機等感光元件。CCD的使用大幅增進了WCD系統的效能，其陣列式

的電路排列除了大幅提升偵測器空間解析度外，影像擷取的效果還可

以讓使用者觀察到更生動真實的樣品流動過程，但是由於市售CCD

尺寸上的限制，所以在這套技術發展初期，是用於觀察小範圍毛細管

內 的 樣 品 流 動 情 形 ， 其 中 又 以 觀 察 毛 細 管 導 電 聚 焦 (capillary

isoelectric focusing, CIEF)實驗中樣品流體行為之研究最為常見。第一

次以WCD系統來觀察毛細管等電聚焦系統的科學家是Wu等人[78]，

作者以雷射光源激發管內樣品使其放光，然後以全管柱影像偵測

(whole-column imaging-detection, WCID)技術獲得樣品在毛細管內的

分佈影像，其觀察視窗為15 mm；隨後，作者以不同的偵測機制來觀 察CIEF的實驗結果，以提升WCID的應用性，例如螢光偵測法及吸收 光偵測法[79-84]。在WCD系統的發展史中，CCD的裝置與使用方法 多有不同，有些學者是以CCD直接收集光訊號然後轉換成電訊號來進 行研究分析，有些則是將CCD搭配光學設計的零件來獲得更寬廣之觀 察範圍的訊號，例如使用數位攝影鏡頭來收集樣品移動影像，Nilsson 等人就是以CCD攝影機來記錄毛細管電泳實驗中的DNA片段的螢光 影像[85-86]。甚至有科學家使用WCD系統來獲得部分實驗參數後， 透過5 cm之觀察視窗，便可預測在CIEF實驗中，分離150種樣品之混 合物的分析結果[87]。

在液相層析的發展初期，為以具透光性之玻璃材質的層析管柱來

進行分離實驗，因此在WCD技術開始發展後，便有科學家使用錄影

影像(video-imaging)擷取的偵測方法來觀察填充固定相後的玻璃管柱

內樣品位移的情形，Tamura等人以CCD攝影鏡頭來直接記錄發螢光

樣 品 在 逆 相 高 效 能 層 析 (reversed-phase high performance liquid

chromatography)玻璃管柱中的分離過程影像[88-89]。Guiochon等人也 設計了一套WCD系統，用來收集層析系統中樣品沖提過程中的影像 訊號[90-92]，並且指出一般HPLC管柱中常用來防止固定相流失的擋 板(frit)也會對樣品在空間上的波形產生影響。以上所介紹的這些 WCD系統，都是以影像收集的方法獲得在玻璃管柱內樣品位移過程 中的空間濃度分佈，然後再進一步地將影像結果透過軟體轉換成數位 訊號來進行分析處理，這樣的技術較先前所提的以光能轉換器為訊號 收集器的偵測方法，大幅提升了其空間解析度，並且可以獲得物質遷 移過程中的三維資訊：樣品遷移時間、樣品濃度強度(peak height)、 樣品分佈範圍(peak width)，藉由獲得更多樣品在層析過程中的動態層

析資訊(dynamic chromatography information)，將有助於分析管柱內所

發生的層析流體行為，進而改善實驗條件來達到分離效率提升的目

標。

解析度」、「大範圍觀測視窗」等裝置優勢之WCD系統，並設計一耐

高壓玻璃管柱，可大範圍(21 cm)的觀察分析物在一般常用的HPLC實

驗條件下之分離過程，藉由同時獲得管柱內、外之實驗數據，並可獲

得管柱內空間及時間之實驗數據，對部分有疏失之層析理論進行修正

[8,9]，並透過WCD系統，觀測於非線性層析實驗條件下，層析波峰

壓縮效應(peak compression effect)之現象[10]。

2.4 波峰壓縮效應

液相層析法發展至今，目前普遍以耐高壓之不鏽鋼管柱作為層析

分離管柱，且僅能由管柱外偵測器所接收之訊號來衡量管柱效能，在

無法直接觀測到分析物在層析管柱中的流動情形下，因此一些隱藏在

管柱中之層析現象常被忽視，在層析管柱中所發生的波峰壓縮效應

(peak compression effect)現象即為其中之一，然而波峰壓縮效應又可

以分為兩種：一為，樣品在初注入管柱時，由於樣品同時受移動相與 固定相之作用因而產生波峰壓縮效應之現象，二為，使用梯度沖提之 非線性層析系統中，由於移動相組成之變化而造成之波峰壓縮效應。 以下將介紹兩種波峰壓縮效應現象。 2.4.1 樣品注入管柱入口端之波峰壓縮效應 文獻[93-95]指出，當一樣品注入至分離管柱入口端時，樣品受到

溶劑強度較小(為與溶解樣品之溶劑相比)之移動相沖提時，會發生濃

縮 (concentrated)或聚集 (focused)之情形，稱此現象為「 On-column

focusing」，並指出此原因為樣品在初注入至管柱入口端時，受固定 相之吸附因而產生較窄之波峰。文獻指出[96]，在液相層析法發展出 窄內徑之管柱，未能普遍被使用，其中因素為，相對於一般內徑4.6 毫米而言，其僅能注入少量樣品分析，若樣品量太多則為由於進樣體 積過量(overloaded)而使分析效能變差，然而利用On-column focusing 之壓縮現象，則可改善進樣體積過量之情況。於1991年Rowlen等人提 出[11]，當樣品注入管柱時，會受到滯留能力不同而使得聚集(focusing)

程度不同，並稱此現象為「Effect of solvent on focusing」，在其研究

中為利用其設計之WCD系統獲得樣品在管柱內的波峰寬度，根據其 研究指出，樣品在管柱入口端之空間波峰寬度(s)會與 成 正比 之關係，即在k值較大之條件下，其管柱入口端之空間波峰寬度(s)會 呈現較窄之情況。在近年研究中，根據文獻[12]指出，樣品在層析管 柱內位移過程中，其空間波峰寬度之變化至少受三種力量所影響：第 一，樣品在注入管柱的起始狀態；第二，樣品受擴張效應之影響，第 三樣品受滯留效應所影響，並指出樣品在注入管柱後的空間波峰寬度 (s)，其應與 成正比關係。於2010年，由Gritti等人提出[13]可 1 1 k 1 1 k

分別計算空間與時間為單位之波峰寬度公式，並指出樣品初注入管柱 之空間波峰變異係數(peak variance)(s) 2_{會與 成正比之關係，} 亦指出在k值較大之條件下，其樣品注入管柱會受到固定相強烈之濃 縮作用，使得樣品在管柱入口端之波峰較窄，即以溶劑能力較弱(水 含量較高)之移動相沖提樣品，其產生之波峰壓縮效應會較明顯，並 說明此種波峰壓縮效應現象，類似於在使用梯度沖提時變換移動相組 成所產生之壓縮現象。 2.4.2 非線性層析之波峰壓縮效應 Snyder等人發表一系列有關於梯度液相層析法的理論模擬系統 [14-17]，在其研究中提到當在進行非線性層析系統時，移動相的組成 變化，會使空間中的波峰發生變化，當後端移動相使用溶劑強度較強 的移動相時，樣品會在兩移動相交界面處，因前後端移動相對樣品作 用力不同，而使樣品在前後端移動相中的移動速度不同，處於管柱出 口端溶劑強度較弱移動相中的樣品分子，移動速度比起處於管柱入口 端的樣品分子慢，而造成交界面後端樣品擠壓的現象，產生樣品分子 在移動相交界面處波寬變窄，等後端移動相完全通過樣品後，樣品之 空間波寬再隨時間漸漸變寬，樣品在移動相之交界面，由於後面移動 相中的樣品產生擠壓的情形而使樣品波寬變窄，此種樣品在移動相交 界面處波峰變窄之現象，稱之為波峰壓縮效應。Tamura等人以CCD 2 1 ( ) 1 k

攝影鏡頭來記錄螢光樣品在玻璃層析管柱中分離過程，也發現有此現 象[88-89]，Yamamoto於1995年發表文獻指出，在離子交換層析系統 中，以梯度沖提模式對蛋白質進行分離時，理論板高可藉由一系列實 驗參數來進行修正[97]，之後提出更多在不同沖提模式下的理論板高 修正理論[98-100]。文獻[14]提及波峰壓縮效應對理論板數的計算也 會有所影響，而後Snyder等人對層析波峰標準偏差以及理論板高進行 修正[14-16]，且在文獻[17]特別對層析波峰壓縮效應進行理論板數探 討與修正，並使用ㄧ些常見偵測器來佐證其模擬數據，Gritti等人提 出一系列公式用於計算非線性條件下之理論板數計算[18-19]。本實驗 室亦透過自行設計之WCD系統，觀測於非線性層析實驗條件下，層 析波峰壓縮效應之現象[9,10]，並指出在梯度沖提之非線性層析系統 中，以時間單位為定義的理論板高H值與理論板數N值並不適用。其 主要原因由於式2-7~2-10是建構在樣品移動速度固定之下發展而成 的公式，但在非線性層析系統中，由於移動相之組成會隨時間改變， 樣品在不同時間會受到不同溶劑強度影響，而使樣品移動速度有所改 變，導致式2-7~2-10無法使用，故頇將此層析公式作修正才能獲得較 正確的理論板高H值以及理論板數N值。

第三章 實驗

3.1 實驗藥品 (a)實驗藥品:

Anthrarufin(1,5-Dihydroxyanthraquinone)，C14H8O4，分子量 240.21，

純度 90%，購自於 Alfa aesar (Ward, MA, USA)，最大吸收波長 425 nm，

溶於丙酮中使成為樣品溶液，濃度為 215 mg L-1_{，丙酮屬 HPLC 級溶}

劑(99.9%)，購自 Aldrich。

(b)移動相組成:

移動相組成為甲醇與去離子水。甲醇 HPLC 級溶劑(99.9%)，購

自 Aldrich。實驗用水為經過 Millipore(Beford, MA, USA) Milli-Q 處理

的 18.2 M去離子水。

3.2 儀器裝置

(a) 往復式梯度沖提幫浦(Reciprocating Pump)

Series 4(購自 Lab Alliance, PA, USA)，輸出體積流速範圍 0.01 mL

min-1~9.99 mL min-1。

(b) 進樣閥門(Sample injection valve)

進樣用的六向閥，購自 Valco(Houston, TX, USA)。

(d) 管柱(Column)

自製 HPLC 管柱以及玻璃管柱。

(e) UV/Vis 偵測器

Waters 486(購自 Milford, MA, USA)。

(f) 全管柱偵測(whole-column detection, WCD)系統 包含光學盒、光源、管柱、XYZ 軸調整機座以及用來處理訊號 之個人電腦。 3.3 儀器組裝及各裝置介紹 本實驗詳細儀器裝置示意圖如圖3-1所示。以下將詳細介紹實驗 所使用之管柱以及WCD系統。 3.3.1 管柱 利用兩充填壓力不同之自製 HPLC 管柱(管柱 1、2)，以及自行填 充之玻璃管柱(管柱 3)進行實驗，三管柱詳細規格於表 3-1。 3.3.1.1 自製 HPLC 管柱－管柱 1、2 本實驗室委託新北市彥宏開發科技有限公司設計製造此管柱本 體，使其盡量吻合一般 HPLC 不鏽鋼管柱之使用條件，管柱結構如圖

圖 3-1 實驗裝置圖

包含光源、光學盒、管柱等零件架設於 XYZ 軸調整機座上之 WCD

系統。此實驗裝置即可利用 WCD 系統及 UV/Vis 偵測器同時獲得之

表 3-1 本實驗所使用三種管柱之詳細規格 管柱 1 管柱 2 管柱 3 填充壓力 103 bar 41 bar 常壓下自行填充 管柱內徑 3.0 mm 3.0 mm 6.6 mm 固定相種類 Kromasil 100-10 C18 Kromasil 100-10 C18 Nucleosil 100-10 C18 粒徑大小 10 μm 10 μm 10 μm

粒徑形狀 spherical spherical spherical

孔徑大小 110 Å 110 Å 100 Å

比表面積 330 m2 g-1 330 m2 g-1 350 m2 g-1 Carbon

loading 20 % 20 % 14 %

3-2 所示。首先將一長度 20 公分、外徑 2 公分、內徑 8 毫米的不鏽鋼 管柱兩側切割出長 15 公分，寬 4 毫米的開口，然後將長 18 公分、外 徑 8 毫米、內徑 3 毫米的玻璃管柱放入上述之不鏽鋼管柱中，在此設 計下，光線可以從不鏽鋼管其中一側的開口進入，穿透過玻璃管柱後， 再從另外一側的開口出來，抵達偵測器。玻璃管與外接不鏽鋼管接合 方式為在玻璃管兩端末端切面處放置 Viton 材質的 O 型環，然後兩旁

鎖上 Swagelok 的 male nuts(內徑 6.35 毫米，如圖 3-2A)，此 male nuts

內嵌有一外徑 6.35 毫米、內徑 3 毫米的不鏽鋼管，當 male nuts 擠壓

O 型環時，此不鏽鋼管會透過 O 型環與玻璃管柱連結成一內徑 3 毫

米、長度 25 公分之空心管路，如此一來，便可將層析系統中所使用

之固定相填充於其內；而為了使固定相不會流失，不鏽鋼管末端必需

先接上一 Swagelok nut(圖 3-2B)，然後連接內含擋板(frit，2 μm)的

external column end connector(圖 3-2C)，此即完成自製 HPLC 管柱本

體。 當管柱本體製作完成後，以往復式針式幫浦或針式幫浦測試其耐 壓程度，測試結果為此種設計之玻璃管柱能承受至少 159 bar(2300 psi) 之壓力不會產生洩漏，且不會造成玻璃管柱之損壞，於一般 HPLC 實 驗條件中，壓力鮮少超過此限，故可確定此種設計之管柱可進行往後 層析實驗條件。而後委託台北市建宏層析企業股份有限公司分別以高

圖 3-2 管柱 1、2 結構圖

管柱規格：總長度 25 公分、內徑 3 毫米。其中，中間 18 公分長度範

壓 41 bar(600 psi)及 103 bar(1500 psi)之填充壓力，將 10 μm ODS 固定 相注入管柱中，便完成了長 25 公分，內徑 3 毫米，填充 10 μm ODS 作為固定相的兩支管柱。 3.3.1.2 玻璃管柱－管柱 3 玻璃管柱購自於Omnifit(Danbury, CT, USA)，具有可調端之組件 (圖3-3A)，即可自行調整固定相所需填充長度，利用自行填充之方式， 填充10 μm ODS作為固定相。自行填充方式為採用乾式填充法，直接 將乾粉狀之固定相逐次微量填充至玻璃管柱中，填充過程不時輕敲管 壁以減少空隙並且讓固定相帄整而緊密，因若固定相上端表面不帄整、 管柱中有空隙，會破壞分離區帶的帄整，使分離效果變差。填充完成 後，利用甲醇以適當流速沖洗管柱，而後再旋轉玻璃管柱之可調端組 件，藉此使填充之固定相更為緊密，便完成了固定相填充長度16公分， 內徑6.6毫米，填充10 μm ODS作為固定相之玻璃管柱，管柱結構如圖 3-3所示。 3.3.2 WCD 系統 系統包含光學盒、光源、XYZ 軸調整機座以及處理訊號用的個 人電腦。光學盒為新竹市虹光精密工業股份有限公司所提供的光學掃 描器(型號 CanoScan 5000)拆解下來，內部包含三組帄面鏡和一片聚

圖 3-3 管柱 3 結構圖

管柱規格：固定相長度 16 公分、內徑 6.6 毫米，內含擋板(frit，10 μm)。

其中，A 部分為可調端，可透過旋轉可調端組件來改變固定相填充長

焦的透鏡，透過此光學盒所設計的光學路徑，21 公分寬的光線可被

聚焦在一個 6 公分的 CCD(型號 Toshiba models T8E21)上，然後轉換

成電訊號於個人電腦上(如圖 3-4 所示)。 光源為放射波長為 460 nm 的藍光 LED 光源(型號 DL-15-300-B)， 由新北市曜宇科技股份有限公司提供。XYZ 軸調整機座分為兩個部 分，第一個部分可架設光源、管柱，第二個部分架設光學盒，兩個部 分總共可以有 5 種方向來調整彼此間的距離與高度，以及調整光源之 光線穿透管柱後射入光學盒的角度，此機台委託新北市彥宏開發科技 股份有限公司設計製作。 光線必頇通過有填充固定相的管柱後抵達位於光學盒內的 CCD 上 ， 雖 然 填 充 的 固 定 相 並 不 透 明 ， 但 光 線 可 藉 由 擴 散 反 射 (diffuse-reflection)的方式穿越於固定相空隙間，雖然以此方式所收集 的穿透光線並非一般常見的吸收光譜測量方法，但根據文獻[11,76] 指出，仍有不少團隊以此種模式觀察管內樣品分離行為，此即表示以 此種方法進行分析是可行的，亦可以精確的表現樣品在管柱中的位移 行為。 樣品吸收訊號處理方法如下：樣品尚未注入管柱前，先收集光源 通過含有初始條件移動相之管柱後抵達 CCD 的訊號，令其為 P0，樣 品注入的同時，再次啟動 WCD 系統收集樣品在通過管柱過程中所有

圖 3-4 詳細實驗裝置圖

光學盒內部包含三組帄面鏡和一片聚焦透鏡，透過圖示內之光學路徑，

21 公分寬的光線可以被收集在一組寬度 6 公分的 CCD 上，然後轉換

光線強度訊號，令其為 P，吸收值 A=log(P0/P)，此為根據 CCD 所收 集之電訊號來計算樣品通過管柱過程中之吸收訊號的方法。 3.3.3 WCD 系統操作界面設定 進行實驗前，必頇先設定好連接WCD系統之個人電腦中的操作 界面(圖3-5)，樣品取樣時間、取樣點數、取樣模式及曝光時間參數， 使WCD系統獲得樣品吸收訊號，以下逐一介紹操作介面各項參數之 設定原則。 (a)樣品取樣時間(sampling interval) 樣品取樣時間是以毫秒為單位，根據實驗條件做調整，輸入適當 的取樣時間。 (b)取樣點數(sampling method) 此欄可以選擇訊號收集點的數量，總共有5個選項：670、1340、 2680、5360、10720，在偵測範圍21公分的全管柱偵測器裡，其光學 盒內線性CCD上有10720個像素(即10720個訊號收集點)，若以相鄰2 點做帄均積分處理，會得到5360個訊號收集點；若以相鄰4點、8點、 16點做帄均積分處理，分別會有2680、1340、670個訊號收集點，本 實驗每一組訊號波形皆由2680個點所組成，空間解析度相當於0.078 mm，對本研究而言其解析度已足夠。 (c)取樣模式(sampling mode)

圖 3-5 電腦操作界面圖

操作界面上可設定之參數包含：1.數據取點間距時間；2.偵測器曝光

時間；3.取樣點數；4.取樣模式。除了數據取點間距時間於每次實驗

前頇重新輸入以外，在本研究中，偵測器曝光時間固定為 1600%(57.6

光學盒內部的CCD有塗佈材料，可以過濾掉不同波長的光源， 因此，由取樣模式可以選擇光源通過CCD的波段，選擇模式有5種， 分別為Red、Green、Blue、Color、Gray，在本實驗中，因所選擇的 光源已是單波段光源，所以選擇〝Gray〞為取樣模式，即CCD不需濾 掉任何波長的光，盡可能讓所有可用的光線都能到達偵測器，提高偵 測訊號的靈敏度。 (d)曝光時間(Exposure) 曝光時間是以百分比(%)，輸入不同的數值會對應到不同的曝光 時間，本研究中WCD系統的最短曝光時間為3.6 ms，但由於管柱內填 充固定相會導致光源訊號大幅減弱，進而影響訊號解析度，故本研究 所選擇的曝光時間長度固定為最大值1600%(57.6 ms)。 3.4 數據類型定義 以WCD 系統收集樣品於管柱中之吸收訊號值，可得一吸光值空 時矩陣，將此矩陣進行詳細的分析，便可獲得數種不同的實驗數據類 型，此段落將對本研究中所獲得的各種類圖譜進行定義(圖3-6)。本研 究當中使用2組偵測系統(WCD與UV/Vis偵測器)，以UV/Vis偵測器收 集訊號時，為固定一個偵測管柱出口的位置，隨時間來擷取樣品通過 偵測位置的訊號，故所得的圖形橫座標單位為時間，縱座標單位為訊 號強度，此類型數據即稱之為時圖(temporal profile)，且由此組數據是

圖 3-6 管外時圖和管內空圖的定義 管外時圖是以單通道偵測器收集樣品流出管柱後的訊號結果，所得圖 表橫軸座標單位為時間；管內時圖是以 WCD 系統持續收集大範圍之 樣品空間分佈訊號，但選擇其中一固定管柱位置為偵測點，隨時間累 積而得的訊號，可得此橫座標單位為時間的管內時圖；管內空圖是以 WCD 系統同時偵測大範圍的管柱內樣品空間分佈訊號，所得圖表橫 軸座標單位是空間。

在管柱外之環境所收集而得，故又稱管外(post-column)時圖。使用 WCD 系統時，可以同時偵測大範圍的樣品分佈，如同瞬間拍照的技 術，獲取樣品在一維管柱空間中的訊號強度值，獲得的圖譜橫座標為 管柱位置、縱座標為訊號強度，此類型之數據稱為空圖(spatial profile)， 且 由 於 此 數 據 是 在 管 柱 內 之 環 境 所 獲 得 ， 故 亦 可 稱 之 為 管 內 (on-column)空圖。 WCD 系統除可獲得管柱內樣品的空圖訊號，若將一固定管柱位 置為偵測點，隨著時間累積所獲得的訊號，亦可獲得橫座標單位為時 間的管內時圖數據(圖 3-6)。 根據WCD系統所獲得的管內空圖數據，可繪製出樣品在管內沖 提移動過程中的遷移路徑圖(migration route)如圖3-7：WCD在T1、T2、 T3…Tn等流析時間時〝拍攝〞到樣品於管柱內的空圖波峰訊號Peak1、

Peak2、Peak3…Peakn，找出以上空圖波峰之頂點分別位於管柱位置N1、

N2、N3…Nn處，再將T1、T2、T3…Tn與N1、N2、N3…Nn等數據同時表

現於同一張關係圖上，此樣品流析時間與空圖波峰頂點位置關係圖即

稱之為樣品遷移路徑圖，遷移路徑圖中所繪製出的數據趨勢線則稱為

遷移曲線(migration curve)，遷移曲線之斜率則代表樣品在管柱中的移

圖 3-7 遷移路徑圖與遷移曲線之定義

WCD 在 T1、T2、T3…Tn等流析時間時獲得樣品於管柱內的空圖波峰

訊號 Peak1、Peak2、Peak3…Peakn，找出以上空圖波峰之頂點分別位

於管柱位置 N1、N2、N3…Nn處，再將 T1、T2、T3…Tn與 N1、N2、

N3…Nn 等數據同時表現於同一張關係圖上，此關係圖即為樣品遷移

3.5 實驗流程 實驗裝置架設完畢之後，先調整機台與全管柱偵測器的相關位置 與角度，使光源之光線能夠通過填充固定相之管柱並進入偵測器，然 後根據電腦操作界面上呈現的光源訊號強度，進行機台之 XYZ 軸微 調，以達最佳化狀態，所謂最佳化狀態是指光源強度穩定且左右兩端 強度對稱，機台調整完畢後測量偵測點所對應的管柱位置。上述步驟 執行完畢後，進行接下來的實驗步驟： (1) 每次層析實驗操作前，以約 30 mL 之 HPLC 級甲醇清洗管柱。 (2) 依照實驗條件設定幫浦沖提程式。 (3) 設定電腦操作界面。 (4) 注入樣品，並將儀器蓋上黑布避免受其他光源干擾。 (5) 開啟幫浦進行實驗，並同時開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器 2 組系統收集樣品訊號。 (6) 從電腦操作界面上看到訊號恢復至原本狀態即表示樣品已流出 管柱，此時停止收集訊號。 (7) 進行數據處理

3.6 實驗步驟 3.6.1 等位沖提 三種不同管柱移動相以甲醇和去離子水做不同比例混合(表 3-2)， 然後再以 0.7 mL min-1_{的流速對 20 μL 的樣品進行等位沖提，在樣品} 注入管柱的同時，立即開啟 WCD 系統與 UV/Vis 偵測器收集樣品流 經管柱過程的波峰訊號(包含管內空圖和管內時圖)以及管外訊號(管 外時圖)，在不同移動相沖提樣品的條件下，樣品停留於管柱內所需 的總滯留時間長度不同，為了收集適量的數據來進行往後的分析處理， 則 WCD 系統所需之數據取點間距時間亦不相同，移動相沖提實驗所 分別搭配的數據取點間距時間列於表 3-2。 3.6.2 梯度沖提 梯度沖提實驗採用管柱 1 作為分析管柱，實驗為利用甲醇與水作 為移動相，亦使用 0.7 mL min-1_{的流速對20 μL 的樣品進行沖提，在} 樣品一注入的同時，立即開啟 WCD 系統收集樣品流經管柱過程的樣 品波峰訊號(包含管內空圖和管內時圖)。 本實驗設計階梯式沖提與連續式沖提兩種模式之梯提沖提條件， 進而探討非線性層析之波峰壓縮效應與理論板數計算。兩種梯度沖提

表 3-2 等位沖提條件中，移動相組成比例與數據取點間距時間 編號 移動相比例(V/V) 甲醇(%)：去離子水(%) 數據取點間距時間 (ms) 管柱 1 1 99 : 01 100 2 95 : 05 200 3 90 : 10 300 4 85 : 15 400 5 80 : 20 500 6 75 : 25 700 7 70 : 30 1000 管柱 2 1 99 : 01 100 2 95 : 05 200 3 90 : 10 300 4 85 : 15 400 5 80 : 20 500 6 75 : 25 700 7 70 : 30 1000 管柱 3 1 99 : 01 100 2 95 : 05 200 3 92 : 08 300 4 90 : 10 400 5 87 : 13 500 6 85 : 15 700 7 83 : 17 1000 8 80 : 20 1200

之實驗條件與分別搭配之 WCD 系統的數據取點間距時間列於表 3-3。 表 3-3 兩種梯度沖提實驗中，數據取點間距時間 實驗編號 數據取點間距時間(ms) 階梯式沖提 1 1500 2 1200 3 900 4 700 連續式沖提 1 750 2 800 3 850 4 900 3.6.2.1 階梯式沖提 階梯式沖提模式啟動前，先以 100%的移動相 A 以流速 0.7 mL min-1的條件進行管柱帄衡，接著在樣品注入後的 9 分鐘時，瞬間將 移動相變換為 100%的移動相 B、C、D、E，如圖 3.8(a)所示。

3.6.2.2 連續式沖提 連續沖提模式啟動前，先以 100%的移動相 A 以流速 0.7 mL min-1 的條件進行管柱帄衡，接著在樣品注入後的 9 分鐘時，將移動相在 0.5、1.0、2.0、3.0 分鐘變換為 100%的移動相 D，如圖 3.8(b)所示。 (a)階梯式沖提模式 (b)連續式沖提模式 圖 3-8 梯度沖提所設計之兩種實驗模式

第四章 結果與討論（一）－樣品注入管柱入口端之波峰壓縮效應 4.1 數據處理 本實驗所使用的全管柱偵測系統，此偵測系統會在同一時間得到 2680 個訊號收集點，因此每一個空間訊號含 2680 個數據。 數據處理步驟如下：實驗過程中，每次取樣會記錄 2680 個訊號 收集點的偵測訊號，由「timeInfo.txt」檔案可以得到每次取樣時間的 數據；「result.txt」檔案內含整個系統偵測過程中樣品的吸收訊號。 在固定的偵測位置，以固定的取樣間隔時間收集偵測訊號，可得 到「時間對應吸收值」的圖形，這種隨流析時間收取訊號作圖的圖形 稱為時圖，而一般管柱外偵測器所得的紀錄波形即為管外時圖。 將「相同流析時間」但「不同偵測位置」的訊號點取出，依據偵 測點對應的管柱位置作出「位置對應吸收值」的圖形，這種在同一時 間獲得全部偵測點的訊號，並以管柱位置作圖得到的圖形稱為空圖。 詳細數據類型定義已在 3.4 節提及。 4.2 波形參數指標 本實驗所獲得之空圖與時圖之波形指標參數為： (a)波峰位置：表為波形之最高點所對應至橫軸座標位置 空圖：波峰最高點所對應為管柱位置

時圖：波峰最高點所對應為樣品滯留時間(retention time, tR) (b)波峰寬度： 於統計學中，常會以標準偏差值(standard deviation, )，來表示據 據點分散情形之參考指標。當波形為一高斯波形時，其波形之半高寬 約為倍之標準偏差值，可透過波形最高點之高度處，計算波峰 左右兩側的寬度，求出波峰半高寬進而求得標準偏差值。然而若波形 非高斯波形之情況下，則頇根據統計學上計算標準偏差之公式來求得。 由於本實驗所獲得之空圖及時圖之波形是由許多數據點所組成，因此 可藉由計算構成波形之數據點之標準偏差值，來代表波峰寬度。所用 計算公式如下：  i i 2 i ( ) y x x y       

yi：yi代表第i個訊號值，yi+1代表第i+1個訊號值。

xi：xi代表yi所對應橫軸座標之位置，xi+1代表yi+1所對應橫軸座標之位

置。

：波形質量之中心(calculated mass center by shape profile)，為所有數

據點位置的帄均值，可由以下公式計算出： i i i y x x y     (4-1) (4-2)

4.3 數據結果討論 4.3.1 管柱外 UV/Vis 偵測器數據討論 利用三管柱以不同之移動相，0.7 mL min-1_{之流速，對樣品進行} 等位沖提，由一般管柱外UV/Vis偵測器所收獲得之管外時圖如圖4-1 所示。三管柱在不同移動相之等位沖提條件以式2-14計算出k值，並 利用式2-13所計算而得之樣品移速，以及管外時圖之波形指標皆列於 表4-1。根據以上結果顯示出，當k值越大，由於樣品在管柱內受到固 定相滯留力較強，因此在管柱內之樣品移速較慢，且k值越大，其在 管外時圖之波寬越寬、波高越矮；此原因在一般教科書上解釋其原因 為當樣品在管柱內滯留時間長，即k值較大之樣品，其在空間上產生 擴張情形顯著，故空間波峰較寬，反之滯留時間短，亦即k值較小之 樣品，其在管柱內產生擴張情形較不明顯，故空間波峰較窄。然而造 成此一現象正確解釋應為：樣品在流析出管柱之際，會受到樣品之移 速不同而影響其在管外時圖之波峰寬度[9]。 4.3.2 管內空時圖數據討論 透過WCD系統可獲得三管柱之個別遷移路徑圖(圖4-2)，計算遷 移曲線之斜率，即可得到樣品在移動相中的個別移動速度，而遷移曲 線斜率與由管外時圖利用式2-13所計算而得之樣品移速um(見表4-2)

(a)管柱 1 (b)管柱 2 (c)管柱 3 圖 4-1 三管柱於等位沖提實驗中，管外時圖結果 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中 k=0.84 k=5.34 k=13.1 k=2.05 k=0.84 k=9.45 k=2.34 k=5.28 k=2.03 k=10.0 k=3.70 k=5.52

表 4-1 等位沖提實驗中，樣品於三管柱之管外時圖波形指標 編號 k 值 樣品移速 um (cm min-1) 滯留時間 tR (min) 波峰寬度(t) (min) 管柱 1 1 0.84 6.94 3.60 0.144 2 1.23 5.71 4.50 0.184 3 2.05 4.17 6.13 0.261 4 3.29 2.97 8.60 0.378 5 5.34 2.01 12.5 0.564 6 8.44 1.35 19.1 0.929 7 13.1 0.90 28.7 1.524 管柱 2 1 0.84 6.29 4.03 0.148 2 1.16 5.36 4.66 0.189 3 2.34 3.92 6.37 0.279 4 3.42 2.97 8.41 0.347 5 5.28 2.12 11.8 0.585 6 7.19 1.56 16.0 0.884 7 9.45 1.21 20.6 1.283 管柱 3 1 2.03 1.43 12.3 0.403 2 2.80 1.14 14.6 0.463 3 3.70 0.92 18.2 0.749 4 4.35 0.81 20.8 0.909 5 5.52 0.66 25.4 1.187 6 6.47 0.58 28.7 1.481 7 7.61 0.50 33.0 1.666 8 10.0 0.39 41.9 2.149 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

(a)管柱 1 (b)管柱 2 (c)管柱 3 圖 4-2 三管柱於等位沖提實驗中，樣品之遷移路徑圖 樣品遷移路徑圖中，各組實驗遷移曲線的斜率代表樣品在個別移動相 組成的移動速度。註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

表 4-2 等位沖提實驗中，三管柱遷移曲線斜率與管外時圖所計算而得 的樣品移速之數據比較 編號 遷移曲線斜率 (cm min-1) 樣品移速 um (cm min-1) 管柱 1 1 7.14 6.94 2 5.71 5.71 3 4.19 4.17 4 3.00 2.97 5 2.05 2.01 6 1.35 1.35 7 0.86 0.90 管柱 2 1 6.66 6.29 2 5.63 5.36 3 4.09 3.92 4 3.09 2.97 5 2.18 2.12 6 1.61 1.56 7 1.26 1.21 管柱 3 1 1.47 1.43 2 1.21 1.14 3 0.96 0.92 4 0.83 0.81 5 0.67 0.66 6 0.59 0.58 7 0.50 0.50 8 0.39 0.39 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

結果符合，此結果即表示由一般管柱外偵測器所獲得之管外時圖，亦 可代表樣品管柱中的移動速度。利用三管柱之等位沖提實驗中，以 WCD系統觀察所得樣品之管內空圖結果如圖4-3、4-4、4-5所示，管 內時圖結果如圖4-6、4-7、4-8所示。由於管柱1、2之耐壓設計，為在 不鏽鋼管柱切割出15公分作為觀察視窗，因此僅可觀測管柱1、2由管 柱7公分位移至17公分之流動情形，然而使用管柱3，可觀測到樣品從 管柱1公分至管柱13公分之流動情形，即可觀察樣品在管柱內流動的 完整情形。 4.3.2.1 空時差異 由三管柱之管內空圖結果(圖4-3、圖4-4及圖4-5)皆可看出，樣品 在管柱中進行等位沖提時，樣品隨著移動相沖提往管柱後端位移，其 空間波峰寬度逐漸變寬，且k值較大者，由於受到固定相滯留力量較 大，故樣品在管柱內之波峰寬度變為較寬，相較於三管柱之管內時圖 (圖4-6、圖4-7及圖4-8)之結果，樣品位移至管柱後端，其時圖波峰寬 度亦逐漸變寬，且變寬程度相較於管內空圖結果明顯許多。為了彰顯 空時圖數據之明顯差異，將三管柱之各組不同k值條件之空圖與時圖 波寬分別除上k值最小條件之空圖與時間波寬，藉此觀察樣品從k值最 小增加至k值大條件時，管內外時圖波寬增加程度與管內空圖波寬增 加程度之差異，三管柱之比較結果於圖4-9及表4-3中，此結果可看出

(a)k=0.84 (b)k=1.23 (c)k=2.05 (d)k=3.29 (e)k=5.34 (f)k=8.44 (g)k=13.1 圖 4-3 管柱 1 於等位沖提實驗中，當樣品抵達管柱約 7、9、11、13、 15、17 公分處之管內空圖結果 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

(a)k=0.84 (b)k=1.16 (c)k=2.34 (d)k=3.42 (e)k=5.28 (f)k=7.19 (g)k=9.45 圖 4-4 管柱 2 於等位沖提實驗中，當樣品抵達管柱約 7、9、11、13、 15、17 公分處之管內空圖結果 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

(a)k=2.03 (b)k=2.80 (c)k=3.70 (d)k=4.35 (e)k=5.52 (f)k=6.47 (g)k=7.61 (h)k=10.0 圖 4-5 管柱 3 於等位沖提實驗中，當樣品抵達管柱約 1、3、5、7、9、 11、13 公分處之管內空圖結果 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

(a)k=0.84 (b)k=1.23 (c)k=2.05 (d)k=3.29 (e)k=5.34 (f)k=8.44 (g)k=13.1 圖 4-6 管柱 1 於等位沖提實驗中，當樣品抵達管柱約 7、9、11、13、 15、17 公分處之管內時圖結果 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

(a)k=0.84 (b)k=1.16 (c)k=2.34 (d)k=3.42 (e)k=5.28 (f)k=7.19 (g)k=9.45 圖 4-7 管柱 2 於等位沖提實驗中，當樣品抵達管柱約 7、9、11、13、 15、17 公分處之管內時圖結果 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

(a)k=2.03 (b)k=2.80 (c)k=3.70 (d)k=4.35 (e)k=5.52 (f)k=6.47 (g)k=7.61 (h)k=10.0 圖 4-8 管柱 3 於等位沖提實驗中，當樣品抵達管柱約 1、3、5、7、9、 11、13 公分處之管內時圖結果 註：詳細實驗條件列於表 3-2 中

(a)管柱 1 (b)管柱 2 (c)管柱 3 圖 4-9 三管柱等位沖提實驗中，管外時圖與管柱末端之管內空時圖波 寬比例關係圖

註：波寬比例之計算公式為，peak width ratio=

詳細實驗條件列於表 3-2 中 min ( ) ( ) k k  