第一章 導論
第一節 幽門螺旋桿菌的介紹與研究
1.5 幽門螺旋桿菌之膜蛋白(outer membrane protein, OMP)與黏著因子
之前的文獻分析出幽門螺旋桿菌的基因當中，有許多負責表現膜蛋白的基因，
科學家將他們分為五大平行同源(paralogous)基因的家族(family)，其中一類最為龐 大也最為主要的基因家族包含了21 個 Hop 與 12 個 Hor 膜蛋白(Hop: H. pylori outer membrane protein, Hor: Hop-related protein)，共 33 個膜蛋白，這家族包含了許多 和細菌貼附(adhesion)於胃表皮細胞相關的蛋白，而其他四個家族的膜蛋白則包含
(colonization)，最後才有可能對宿主細胞造成影響或傷害;再者，由於胃壁可能時 常有蠕動或胃酸分泌的情況，幽門螺旋桿菌必須以黏著因子貼附才能讓它們免於 被清除的命運，因此黏著因子對幽門螺旋桿菌在胃中的生存是不可或缺的 [50, 56]。另外，幽門螺旋桿菌的黏著因子也被報導和疾病或是發炎反應有關 [50]，以 下簡述幾個被研究認為是黏著因子的蛋白。
1.5-1 Sialic acid-binding adhesin (SabA, HopP)
人類胃細胞會表現血型抗原(blood group antigen)中的Lewis抗原，而SabA被研 究會和有不同醣化修飾的Lewis x抗原和Lewis a抗原(sialyl-Lex和sialyl-Lea)結合，最 早是發現到一些sialyl-Lewis抗原會和幽門螺旋桿菌結合，接著將會和sialyl-Lewis 抗原結合的蛋白純化出來而找到，並命名為sialic acid-binding adhesin, SabA [57]。
有研究發現帶有sialyl-Lex及sialyl-Lea抗原和受幽門螺旋桿菌感染造成的胃發炎及 胃癌有關 [2]，另外在美國也有研究指出SabA的表現和嚴重的intestinal metaplasia、
胃體萎縮及胃癌發生有高度相關 [58]，顯示了SabA確實是一個幽門螺旋桿菌的致 病因子。另外由於嗜中性白血球表面也有sialyl-Lewis抗原，因此SabA也會和其結 合並且活化嗜中性白血球，活化的嗜中性白血球會釋放出氧自由基而傷害胃表皮 細胞 [59]。SabA的表現會受胃中環境如pH值影響而改變其表現量，另外也有研究 指出SabA會和細胞外基質蛋白(extracellular matrix protein) laminin結合 [2, 58]。
1.5-2 Blood group antigen binding adhesin (BabA, HopS)
BabA是另一個功能較確立的黏著因子，會和人類胃細胞中的血型抗原Lewis b 抗原(Leb)結合，最早也和SabA的發現方式相似。研究發現到BabA的基因有兩個不 同的對偶基因(allele)，為babA1和babA2，但由於babA1的signal peptide不完全所以 不會表達蛋白，只有babA2會表達有活性的蛋白 [60]。有許多研究指出臨床病人中 感染有表現BabA的幽門螺旋桿菌，其和嚴重的消化性潰瘍與胃癌有非常高度的相
關，當有BabA表現時，病人有較嚴重的免疫反應和發炎情況 [2, 61, 62]，另外文 獻顯示當以基因轉殖老鼠(transgenic mice)轉殖人類的Leb抗原後並感染幽門螺旋桿 菌，比沒有轉殖的老鼠有更為嚴重的發炎情況 [63]，這些都代表了幽門螺旋桿菌 透過BabA貼附宿主細胞並導致較嚴重的疾病。通常BabA的表現和vacA及cagA基因 有高度相關性，另外也有研究指出幽門螺旋桿菌會先透過BabA和細胞貼附，接著 再透過SabA和sialyl-Lex及sialyl-Lea的貼附，使幽門螺旋桿菌造成持續發炎的效果 [2, 57]。
1.5-3 Outer inflammatory protein (OipA, HopH)
OipA最早被發現可以刺激細胞分泌IL-8，產生前發炎(proinflammatory)反應， focal adhesion kinase (FAK)活化，進一步使Src活化後最後導致細胞骨架的改變，這 可能是幽門螺旋桿菌感染後造成細胞型態改變的一個原因 [67]。然而和OipA結合 的宿主蛋白還未被發現，有研究指出OipA可能可以使表皮細胞生長因子受器
(epidermal growth factor receptor, EGFR)磷酸化並活化下游Akt訊息傳遞 [68]。
1.5-4 Adherence-associated lipoprotein A (AlpA, HopC)
AlpA最早被發現是由於科學家將其基因突變後發現到幽門螺旋桿菌貼附於胃 組織的能力下降，且發現到其蛋白質N端帶有脂蛋白(lipoprotein)的signal sequence，
因而取名為adherence-associated lipoprotein A, AlpA [69]，之後的研究包括以突變 alpA基因的幽門螺旋桿菌與細胞或活體動物共同陪養都發現到細菌貼附及形成菌 落的能力下降，且和野生型相比發現刺激細胞分泌的IL-6下降，顯示AlpA可能也 會造成前發炎反應 [70, 71]。有文獻顯示AlpA會和宿主的laminin結合 [72]。
幽門螺旋桿菌還有其他的黏著因子被科學家們研究，如下表的其他蛋白:
【Table 1】Clin Microbiol Rev, 19: 449 (2006)
第 二 節 生 物 標 記 分 子 (biomarker) 與 蛋 白 質 微 陣 列 晶 片 (protein oxaloacetic transaminase (GOT)及 glutamic pyruvic transaminase (GPT)兩種酵素轉 移至血清中而能被偵測到，藉由偵測這兩種酵素在血清中的量可了解肝受損情形。
此外如女性懷孕時，human chorionic gonadotropin (hCG)的分泌量增加而能夠在血 液和尿液中被偵測到，此原理也廣泛應用到目前市面上常見的驗孕器材中。
致病因子的基因型，再和未被感染幽門螺旋桿菌的正常人做比較並以統計計算， 如尿素酶UreA 或 UreB、VacA、CagA、鞭毛蛋白 FlaA 或 FlaB、及各種黏著因子，
有研究發現到中國地區的幽門螺旋桿菌全都有表達UreB，且不管是胃炎或是消化 性潰瘍的病人血清中都帶有CagA 抗體 [75]，而在歐洲地區，相較於慢性胃炎的 病人，較多消化性潰瘍病人身上的菌株表現了CagA，且發現 CagA 及熱休克蛋白 (heat shock protein) GroEL 和胃癌病人有高度相關 [76, 77]，而美國研究也發現 CagA、 SabA 及 OipA 和胃癌病人相關 [58]，可以看見由於區域性臨床幽門螺旋
起DNA 晶片，蛋白質晶片的困難在於每一個蛋白質的製備純化比起 DNA 或 RNA 定蛋白，而另外有 nitrocellulose 或一層膠的材質能吸附住蛋白質以固定化 [78, 79]。
2.2-2 蛋白質微陣列晶片之應用
蛋白質晶片可應用在許多科學研究上，例如科學家建立了酵母菌蛋白質體 (proteome)晶片，將酵母菌中 80%的蛋白都純化並點於晶片上，接著將 calmodulin 或科學家想研究的脂質加入到晶片上和蛋白反應，觀察蛋白-蛋白或蛋白-脂質的 交互作用(protein-protein interactions and protein-lipid interactions) [80]，另外也有文 獻是建立了大腸桿菌蛋白質體(proteome)晶片，先建立了高通量純化大腸桿菌蛋白
第三節 研究動機、目的與策略
現量應該更能提高準確性。 異，因此利用了16-BAC/SDS-PAGE 的二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis) 系 統 來 分 析 膜 蛋 白 ， 此 種 二 維 電 泳 與 傳 統 二 維 電 泳 的 差 異 在 於 ， DU strain 表現量的蛋白(Supplementary S1、Supplementary S2)，並將膠體的蛋 白點切割下來後經膠體原位酵素切割 (in-gel digestion)，再將這些表現量有差異的 蛋白以nano-LC MS/MS 鑑定身份，其結果於附錄的 Table S1，結果顯示鑑定到的
蛋白質一半以上為膜蛋白，再次證明了16-BAC/SDS-PAGE 用於分析膜蛋白的可 行性(Supplementary S3)。
而本實驗將會根據實驗室先前研究的結果: Table S1 鑑定到的蛋白進行文獻 搜尋，並且選出四個標的膜蛋白分別為OipA、AlpA、SabA 及 BabB 這四個幽門 螺旋桿菌的黏著因子，接著我們會將這四個黏著因子的重組蛋白質(recombinant protein)以 8M 尿素幫助溶解並純化出來後，利用西方墨點法(Western blotting)，分 別以正常人、胃發炎無感染幽門螺旋桿菌者、胃發炎有感染幽門螺旋桿菌者、十 二指腸潰瘍病人及胃癌病人的血清去反應，觀察其免疫特異性，之後以統計分析 結果，並嘗試加入複合型生物標記分子的概念，期望找尋出胃癌相關之幽門螺旋 桿菌生物標記分子。
最後，我們會將這四種膜蛋白黏著因子蛋白點印至晶片上，由於本實驗室先 前的研究中曾將溶於尿素中的幽門螺旋桿菌蛋白點至晶片上 [84]，但其點樣良率 並不高，因此我們會測試並試圖找尋出較適合這四個溶於8M 尿素緩衝夜(buffer) 的膜蛋白其點樣的最佳條件，之後再以正常人及病人血清和蛋白質晶片反應，觀 察其反應趨勢是否與西方墨點法的結果一致，期望能發展出胃癌相關之幽門螺旋 桿菌抗原膜蛋白質晶片，並能幫助臨床上的診斷。
第二章 實驗材料
第五節 抗體
初級抗體 廠牌 Mouse anti-His tag antibody Santa Cruz
次級抗體 廠牌 HRP-conjugated rabbit anti-mouse IgG Millipore
HRP-conjugated goat anti-human IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories
Unconjugated rabbit anti-human IgA + IgG + IgM
Jackson ImmunoResearch Laboratories
Cy3-conjugated rabbit anti-mouse IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories
Cy3-conjugated rabbit anti-human IgA + IgG + IgM 10X ligation buffer New England Biolabs
10X NEB buffer New England Biolabs
Acetic acid Merck
Acetonitrile, ACN Merck
Acrylamide/N, N’-methylene-bis-acrylamide Amersham Bioscience Ammonium persulfate, APS USB
Bovine Serum Albumin, BSA Merck
Bromophenol blue, BPB Pharmacia Biotech
Calcium chloride, CaCl2 Sigma
CBB-250 Amersham Bioscience
Chelating SepharoseTMFast Flow Amersham Bioscience
EDTA Sigma Ethanol Sigma Ethidium Bromide Sigma
Fast green Sigma
Formic acid Merck
Glycerol Merck Glycine Merck Hydrogen chloride, HCl Merck
Imidazole Sigma IPTG Sigma Kanamycin Sigma
Magnesium chloride, MgCl2 Sigma
Methanol Merck
Nickel chloride ,NiCl2 Sigma
PBS Gibco SDS Amresco Sodium chloride, NaCl Sigma
Sodium hydride, NaOH Sigma
TAE buffer Amresco
TEMED Merck Tris Merck Tween-20 Sigma Urea USB
第七節 試劑組
品名 廠牌 KAPA HiFiTM PCR kit KAPA Biosystems 660 nm Protein Assay Reagent Pierce
Bio-100TM DNA Ladder(range 100bp ~ 3 kbp) Promega Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit Geneaid
High Speed Plasmid mini Kit Geneaid ImmobilonTM Western Chemiluminescent
HRP substrate
Millipore Low Range Protein Marker Bio-Rad
PUREGENE DNA purification kit From 臺大醫院內科楊 智欽醫師
第八節 重要儀器
儀器 廠牌型號 Dry bath incubator Major science
Electrophoresis power supply 301/1001 Amersham Bioscience ESI Q-TOF tandem mass spectrometry QSTARTM XL system GeneAmp PCR system 2700 Applied Biosystem
Himac CF15R centrifuge Hitachi Hotplate Stirrer JLab Tech ImageQuant 300 Amershan Kubota 1020 centrifuge Kubota
Liquidator96 RAININ
Luxscan 10K Microarray Scanner CapitalBio Maxi Dry Plus (SpeedVac) Heto Holten
Micro-centrifuge Bertec Microfuge R centrifuge Beckman Coulter
Multichannel pipett RAININ Nano LC system LC packing NVT 90 ultraspeed rotor, for Backman Centrifuge Beckman Coulter
Orbital shaker TKS
pH meter InLab
Pipett Gilson SlideWasher 8 Slide Clean-up Station CapitalBio
SmartArrayer 136 CapitalBio
SpectraMax® M5 multi-detection reader Molecular Devices TM-325 autoclave Tomin
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Ultrasonicator Sonics & Materials, Inc Ultrospec 3000 Spectrophotometer Amersham Biosciences Vortex-2 Genie Scientific Industries
第三章 實驗方法
第一節 幽門螺旋桿菌標的基因之質體建構(plasmid construction)與重組膜 蛋白質的表現與純化
1.1 標的基因之質體建構
1.1-1 抽取幽門螺旋桿菌之 genomic DNA (Extraction of genomic DNA )
先以棉棒刮一個培養基(plate)的菌量並收集至裝有 1.5mL ddH2O 的 eppendorf 中，再以7000g 轉速離心 5min 後去除上清液，沉澱的 pellet 即是菌體，可置於-20℃
中保存或繼續以下步驟，接著使用PUREGENE DNA purification kit 抽取幽門螺旋 桿菌之genomic DNA，先加 600μL 的 cell lysis solution，輕輕混勻後置於 80℃, 5min 以破菌完全，之後回到室溫，再加入3μL 的 RNase A，在 37℃下 incubate 60min 以去掉RNA，再來加入 200μL 的 protein precipitation solution on ice 5min，再離心 15000g, 1min, 4℃以沉澱蛋白質，之後取上清液再和 isopropanol 600μL 混勻，並 一樣以15000g, 1min, 4℃離心後倒去上清液，最後先加入 600μL 100%酒精洗 pellet，
離心後倒去上清再換成600μL 70%酒精洗 pellet，離心 13000g, 10min, 4℃後去掉 上清，pellet 晾乾(可 overnight)，最後加入 50μL 的 DNA hydration solution(或 ddH2O) 並於65℃下 incubate 1hr 回溶 DNA，DNA 可放置於-20℃中保存。
1.1-2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)
利用聚合酶連鎖反應放大標的基因，使用KAPA HiFiTM PCR kit，並以上述抽 取之幽門螺旋桿菌genomic DNA 做為模板(template)，其反應時使用配方如下，一 次實驗25μL 兩管，共 50μL，：
*使用的primer 經過 SignalP 4.0 Server 軟體預測蛋白之 signal peptide 後，去除 signal sequence 以設計 primer，序列附於附錄 Table S2
充分混合後，開始聚合酶連鎖反應，四個基因個別的反應條件如下:
聚合酶連鎖反應完成之後，利用1%洋菜膠體電泳分析 OipA, AlpA, SabA 及 BabB 之PCR 產物。
聚合酶連鎖反應完成之後，利用1%洋菜膠體電泳分析 OipA, AlpA, SabA 及 BabB 之PCR 產物。