第三章 實驗方法
第三節 開發胃癌相關之幽門螺旋桿菌抗原膜蛋白質微陣列晶片
ECL 呈色，首先將 PVDF membrane 上多餘的緩衝液吸掉，均勻加入適量的 反應物(ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP substrate，A 與 B 兩種溶液等 體積混合)，反應 1 分鐘後將多餘的受質溶液吸掉，利用 LAS-4000 影像分析儀分 析membrane 上的冷光反應。
2.2 統計分析 (Statistical analysis)
本篇論文中樣品族群的免疫反應程度的強弱數據分析是利用 Microsoft Office 2007 中的 Excel 軟體來計算，透過其內建的統計程式來比較分析樣品群的差異度，
我們選用的統計檢定法為Student’s T test，並執行單尾檢定。分析反應為陽性或陰 性則利用odds ratio (OR)、信賴區間(confidence interval, CI)及卡方檢定計算 p-value。
篩檢值(cutoff value)的設定是以非胃癌之病人以及正常人(Normal、GS(-)、GS(+) 及 DU)共 65 人的分析結果，先去掉最高及最低各 10%的極端值，接著計算其平 均加上2 倍標準差的值做為最後篩檢值。當 p-value < 0.05 視為有顯著差異。結果 呈現以SigmaPlot 軟體來繪圖。
第 三 節 開 發 胃 癌 相 關 之 幽 門 螺 旋 桿 菌 抗 原 膜 蛋 白 質 微 陣 列 晶 片 (membrane protein microarray chip)
此節實驗操作於國立中央大學系統生物與生物資訊研究所陳健生老師實驗
3.1 膜蛋白質樣品的處理 (Sample preparation)
為了防止蛋白質於晶片上固定化(immobilization)時液滴容易蒸發導致液滴乾 掉而影響蛋白質結合到晶片上的效果，因此純化出之重組蛋白質除了溶於原本的 8 M urea binding buffer 以外，蛋白質樣品必須加入 glycerol 使樣品溶液最終含有 30 % (v/v) glycerol，而其他非蛋白質的樣品如只有緩衝液的 negative control 也必 須加入30 % (v/v) glycerol。 (aldehyde-derivatized)的材質(CapitalBio)。另外晶片會點三個control: 1. 經過序列稀 釋的unconjugated rabbit anti-human IgA + IgG + IgM四個濃度(18.25 μg/mL, 37.5 μg/mL, 75 μg/mL及150 μg/mL)，用來顯示當加入血清反應後其血清內的IgG反應程 度是否正常(positive control)。2. Cy3-conjugated rabbit anti-mouse IgG做為觀察晶片 和點印機點印狀況是否一致及儀器狀況是否良好的訊號(landmark)。3. 只有8 M urea binding buffer而不含蛋白質的negative control。以上的樣品(四個幽門螺旋桿菌 的重組蛋白質、四個濃度的unconjugated rabbit anti-human IgA + IgG + IgM、8 M urea binding buffer及Cy3-conjugated rabbit anti-mouse IgG)經過點印後整體成為一 個區塊(block)，而一張晶片則點印成7 x 3 = 21個區塊。當晶片點印完成後繼續放 置於冷房20℃中讓蛋白在晶片上固定化(immobilization)至少12小時，之後晶片可保 存於-20℃。
3.3 蛋白質晶片試驗 (Protein chip assay)
1. anti-His tag antibody:
以含有 1 % (w/v) BSA 的 TBST 稀釋 anti-His tag antibody，稀釋比例為 1:1000，
之後加入3 mL 的抗體溶液和晶片進行反應，蓋上蓋子後以水平儀確定晶片為平 放並靜置於4℃下 overnight。隔天將晶片放入 100 mL TBST 中以 50 rpm 洗 10 分 鐘，再一樣將晶片四個邊緣碰觸擦手紙以吸乾多餘液體後，放入3 mL 的次級抗 體中，次級抗體為Cy3-conjugated rabbit anti-mouse IgG，以含有 1 % (w/v) BSA 的 TBST 稀釋，比例為 1:5000，晶片與抗體溶液靜置於室溫 1 hr，之後利用生物晶 片清洗系統SlideWasher 8 Slide Clean-up Station (CapitalBio)清洗晶片。
2. 血清:
重複三次以稀釋掉原本 well 中的血清，之後將 cassette 拆開，並且將晶片放入 SlideWasher 中以 TBST 清洗 5 分鐘 2 次，接著一樣將晶片四個邊緣碰觸擦手紙以 吸乾多餘液體後，放入 3 mL 的次級抗體中，次級抗體為 Cy3-conjugated rabbit anti-human IgA + IgG + IgM，以含有 1 % (w/v) BSA 的 TBST 稀釋，比例為 1:20000，
晶片與抗體溶液靜置於室溫1 hr，之後利用 SlideWasher 清洗晶片。
與次級抗體反應完的晶片放入SlideWasher清洗，先以TBST清洗5分鐘2次，接 著換成ddH2O 10 sec後馬上將晶片拿起來並以1000 rpm, 1分鐘離心將液體甩乾避免
3.4 晶片影像掃描及分析 (Chip image scanning and analysis)
晶片使用Luxscan 10K Microarray Scanner (CapitalBio)掃描，掃描波長為Cy3的 536 nm，之後掃描的影像則以GenePix Pro 6.0軟體分析結果，每個蛋白質都會經過 數據前處理(data preprocessing) [82]，也就是每個點的蛋白質螢光訊號讀值會減去 其背景值做為最後數值，對背景值常態化(normalization)。而數值之後會減去只有8 M urea binding buffer而不含蛋白質的negative control之讀值，以消去非專一性結合
的抗體訊號。
數據分析結果會以 Microsoft Office 2007 中的 Excel 軟體來計算，並選用統計 檢定法Student’s T test 執行單尾檢定，當 p-value < 0.05 視為有顯著差異，而結果 呈現以SigmaPlot 軟體來繪圖。