標的基因之質體建構

1.1-1 抽取幽門螺旋桿菌之 genomic DNA (Extraction of genomic DNA )

先以棉棒刮一個培養基(plate)的菌量並收集至裝有 1.5mL ddH2O 的 eppendorf 中，再以7000g 轉速離心 5min 後去除上清液，沉澱的 pellet 即是菌體，可置於-20℃

中保存或繼續以下步驟，接著使用PUREGENE DNA purification kit 抽取幽門螺旋 桿菌之genomic DNA，先加 600μL 的 cell lysis solution，輕輕混勻後置於 80℃, 5min 以破菌完全，之後回到室溫，再加入3μL 的 RNase A，在 37℃下 incubate 60min 以去掉RNA，再來加入 200μL 的 protein precipitation solution on ice 5min，再離心 15000g, 1min, 4℃以沉澱蛋白質，之後取上清液再和 isopropanol 600μL 混勻，並 一樣以15000g, 1min, 4℃離心後倒去上清液，最後先加入 600μL 100%酒精洗 pellet，

離心後倒去上清再換成600μL 70%酒精洗 pellet，離心 13000g, 10min, 4℃後去掉 上清，pellet 晾乾(可 overnight)，最後加入 50μL 的 DNA hydration solution(或 ddH2O) 並於65℃下 incubate 1hr 回溶 DNA，DNA 可放置於-20℃中保存。

1.1-2 聚合酶連鎖反應 (Polymerase Chain Reaction, PCR)

利用聚合酶連鎖反應放大標的基因，使用KAPA HiFi^TM PCR kit，並以上述抽 取之幽門螺旋桿菌genomic DNA 做為模板(template)，其反應時使用配方如下，一 次實驗25μL 兩管，共 50μL，：

*使用的primer 經過 SignalP 4.0 Server 軟體預測蛋白之 signal peptide 後，去除 signal sequence 以設計 primer，序列附於附錄 Table S2

充分混合後，開始聚合酶連鎖反應，四個基因個別的反應條件如下:

聚合酶連鎖反應完成之後，利用1%洋菜膠體電泳分析 OipA, AlpA, SabA 及 BabB 之PCR 產物。

1.1-3 洋菜凝膠電泳 (Agarose gel electrophoresis)

配置 1%之洋菜膠體，取 1 g agarose 加入 1X TAE buffer 至 100 mL (20X TAE buffer 配方如下)，放入微波爐加熱 3 至 5 分鐘沸騰使 agarose 完全溶解，將些微 冷卻之溶液注入預先架設好之電泳模板中，置於室溫下使其冷卻凝固，之後將膠 體放在電泳槽中，並加入1X TAE buffer 蓋過膠體做為電泳時的緩衝液。將 6X DNA

成份 體積(μL)

KAPA HiFi DNA polymerase DNA Template

*Primer forward (10 μM)

*Primer reverse (10 μM) dNTP (10 mM)

5X KAPA HiFi fidelity buffer Sterile water

loading dye 和 PCR 產物混勻後注入膠體樣品槽中，以電壓 110 伏特(V)、電流 400 毫安培(mA)下進行 30 分鐘電泳，電泳結束後，將膠體浸入染色液(EtBr 濃度: 0.5 μg/mL )中 5~10 分鐘，以清水清洗數次後置於 ImageQuant 300 儀器中以 UV 照射 進行DNA 影像分析，並利用 IQuant Capture 300 進行影像擷取。

20X TAE buffer

EDTA 15 g

Tris-Base 194 g

NaOH 8 g

Acetic acid 80 mL 加ddH2O 至 2L

1.1-4 DNA 電泳產物之回收 (Gel extraction)

用 酒 精 擦 拭 過 刀 片 後 將 要 回 收 的 DNA 片段從洋菜膠體上切下，裝入 eppendorf 中並秤出洋菜膠體之重量，之後使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 進行 PCR 產物回收，而回收之 DNA 儲存於-20 ℃。

1.1-5 質體 DNA 的製備與微量抽取 (Extraction of plasmid DNA)

實驗使用的 pET28a 質體原轉型於 E. coli JM109 中保存，所以先將帶有 pET28a 的 JM109 菌養開，以過火殺菌之 loop 沾 JM109 菌液並將菌液畫開在含有 Kanamycin (pET28a 帶有 Kanamycin-resistant 基因，而抗生素以 LB 體積之五千分 之一的比例加入50 mg/mL 之 Kanamycin)之 LB 培養基上，置於 37℃培養箱中培 養16~18 小時，之後挑出單一菌落(single colony)並於 5mL 的 LB 液中在 37℃下震 盪培養16~18 小時(LB 也含有 Kanamycin)，菌液再使用 High Speed Plasmid mini Kit 抽取pET28a 質體，抽出的質體儲存於-20 ℃。

1.1-6 限制酶水解 (Reaction of restriction enzyme)

將準備好的 pET28a 質體與 PCR 產物回收的 DNA 進行限制酶水解，反應配 方如下:

在37℃下反應 2 小時，之後加入 calf intestinal alkaline phosphatase (CIP) 1mL, 1 小 時37℃以防止自我接合(self-ligation)，然後加入 6X DNA loading dye 後，利用 DNA 電泳技術分析其DNA 片段，最後使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit 將 DNA 片段回收，回收之 DNA 儲存於-20 ℃。

1.1-7 與 pET28a 質體之接合反應 (Ligation with pET28a plasmid)

將被限制酶水解後的四個DNA 片段與質體 pET28a 進行酵素結合反應，DNA 片段與pET28a 各加入 50 ng 來進行反應，反應條件如下:

成份 比例

質體或DNA 片段 10X NEB buffer

10X BSA

將混合好的樣品於 16 ℃下培養 20 小時，接著轉型至勝任細胞(competent cells) E. coli DH5α 菌株。

1.1-8 轉型作用 (Transformation)

將勝任細胞 DH5α 和接合反應後的產物混勻後置於冰上 15 分鐘，之後於 42℃

1.1-9 以 colony PCR 之方式篩選轉型基因庫 (Colony PCR screening)

已滅菌之離心管加入 10 μL 之滅菌水，用 tip 尖端沾取 LB 培養基上之單一菌 落後加入離心管之滅菌水中，並以 1μL 之含有菌落的滅菌水做為模板，再以 pET28a 上之 T7 與 T7 terminator 的序列做為 primer 以及論文中 1.1-2 提及之四個 基因上之專一性primer 來進行 PCR 反應，T7 與 T7 terminator primer 之 annealing

成份 比例

質體pET28a DNA 片段 T4 DNA ligase (1 U/μL)

10X ligation buffer Sterile water

temperature 為 50℃。PCR 產物以 1%之洋菜膠體電泳分析，選擇有增殖出正確 DNA 分子量之菌株，這些菌株即帶有成功建構的含標的基因之質體，將這些菌株培養 後進行微量質體DNA 之抽取，質體保存於-20 ℃，

1.1-10 DNA 定序 (DNA sequencing)

萃取之質體 DNA 送交台大醫學院第一共同儀器中心進行 DNA 定序，確認其 DNA 序列無誤後，由於勝任細胞 DH5α 不適合用來表現與純化重組蛋白，因此將 質體再進行轉型作用至另一種勝任細胞 E. coli BL21 菌株。

1.1-11 製備勝任細胞 (Preparation of competent cells)

要製備勝任細胞 BL21 菌株，首先取 BL21 單一菌落接種至 2 mL 培養液中震