幽門螺旋桿菌重組標的膜蛋白質之免疫特性分析

2.1 膜蛋白質 OipA, AlpA, SabA 及 BabB 之免疫原性(immunogenicity)測試 首先我們將OipA, AlpA, SabA 及 BabB 這四個重組蛋白分別以 SDS-PAGE 展 開(Figure 5, lanes 1-4)，並且轉印至 PVDF membrane 後，使用西方墨點法分析，

以一位有感染幽門螺旋桿菌的胃癌病人血清做為初級抗體與重組蛋白質進行雜交 反應，再加入次級抗體以偵測反應強度，結果如Figure 5, lanes 5-8 所示，我們 發現到四個標的蛋白與病人血清都有反應，表示當受幽門螺旋桿菌感染以後，受 感染者的血液中會產生這四個膜蛋白的抗體，也就是我們的標的蛋白具有引發免 疫功能的特性，稱為具有免疫原性(immunogenicity)。

2.2 膜蛋白質 OipA, AlpA, SabA 及 BabB 之免疫特性分析 進行反應，示意圖如Figures 6-9，結果中只放上 5 個 Normal 血清(lanes 1-5)、1 個GS(-)血清(lane 6)、1 個 GS(+)血清(lane 7)、5 個 DU 血清(lanes 8-12)以及 5 個 GC 血清(lanes 13-17)的反應結果，若血清與重組蛋白有反應就會出現明顯的黑色 色帶(箭頭處)。

接著我們將上述分析的結果整理成Figures 10-13，y軸為西方墨點法訊號的強 度，代表重組蛋白質與血清中抗體反應的相對程度(immuno-reactive intensity)，然

後以統計方法計算每組(Normal、 GS(-)、GS(+)、DU及GC)各自的平均值;由於我 們研究的目標為找出與胃癌相關之具潛力的生物標記分子，因此我們以Student’s T test計算以比較GC這組的免疫反應強度與其他各組間的差異，觀察GC這組的反應 程度是否有高於其他各組，是否有顯著差異(*即p-value < 0.05，視為有顯著差異)。

如Figures 10-13所示，OipA, AlpA, SabA及BabB之GC組別的反應強度平均值皆高 於其他四組，且整體散佈的趨勢也都比其他組來的高，而OipA之GC組別反應強度 與Normal、 GS(-)及DU這三組分別比較都有顯著差異(與Normal比較 p = 0.000006，

與GS(-)比較 p = 0.000034，與DU比較 p = 0.0035) (Figure 10) ; AlpA之GC組別反 (Figure 13)。以上結果顯示，OipA, AlpA, SabA及BabB重組蛋白質的免疫反應強度 在胃癌病人中，都高於十二指腸潰瘍病人，代表這四個標的膜蛋白為胃癌相關之 幽門螺旋桿菌抗原，另外胃癌病人的免疫反應強度也高於未感染幽門螺旋桿菌者 (Normal與GS(-))，因此OipA, AlpA, SabA及BabB也是幽門螺旋桿菌的專一性抗原。

除了比較四個膜蛋白的免疫反應強弱度以外，我們也設了每個蛋白的篩檢值 (cutoff value) (Figures 10-13虛線處之數值)，將反應分成只有陽性或陰性兩種結果，

並計算勝算比(odds ratio, OR)、95%信賴區間(confidence interval, CI)及利用卡方檢 定計算p-value，另外我們將Normal、GS(-)、GS(+)及DU四組合併，整體共65人稱 為非胃癌(non-GC)組，以比較胃癌和其他非胃癌的組別之間是否有差異。如Table 1 所示，GC組別與OipA的反應頻率為42.5%，和DU或non-GC組別比較都有顯著差異 (與DU比較勝算比為4.19，p = 0.007，與non-GC比較勝算比為5.27，p < 0.001) ; 而

GC組別與AlpA反應頻率為27.5%，與DU或non-GC組別比較皆沒有顯著差異(與DU 比較勝算比為1.31，與non-GC比較勝算比為2.09，但兩者的信賴區間都包含1，所 以不可信，且p皆> 0.05) ; GC組別與SabA反應頻率為42.5%，與DU或non-GC組別 比較都有顯著差異(與DU比較勝算比為5.17，p = 0.003，與non-GC比較勝算比為4.60，

p = 0.001) ; GC組別與BabB反應頻率為45%，與DU或non-GC組別比較都有顯著差 異(與DU比較勝算比為4.64，p = 0.003，與non-GC比較勝算比為8.05，p < 0.001)。

從以上結果得知，OipA, SabA及BabB三個膜蛋白能區分出胃癌與十二指腸潰瘍的 0.056) ; No.≧3的勝算比為6.33 (95% CI為1.29-31.1, p = 0.012)。而GC與non-GC組別 相 比 的 勝 算 比 及 可 信 程 度 也 一 樣 隨 著 增 加:No.1 的 勝 算 比 為 0.83 (95% CI 為 0.32-2.19, p = 0.711) ; No.2的勝算比為4.21 (95% CI為1.43-12.4, p = 0.006) ; No.≧3 的勝算比為10.5 (95% CI為2.16-51.0, p = 0.001)。從以上結果我們可以得知，若合併

其中兩個或三個以上的抗原來看，與只分析單一抗原相比，更能有效區分出胃癌

protein microarray chip)平台的開發 3.1 膜蛋白質晶片之最佳化條件測試