建立 clpQ + clpY + 上游啟動子區域 ( promoter region ) 表現系統 21

本研究選殖基因的載體為 pRS415 與 pRS414 (Simons et al., 1987)，兩載體皆 以lacZ 為 reporter gene，pRS415 用以建構不同長度 clpQ⁺clpY⁺ promoter region 與lacZ 之轉錄融合基因(operon fusion or transcriptional fusion)，包含 clpQ⁺::lacZ (op-141bp)，clpQ⁺::lacZ (op-478bp)，clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)，clpQ^m1::lacZ (op-141bp)及 clpQ^m2△40bp::lacZ (op)，pRS414 用於建構轉譯融合基因(protein

fusion or translational fusion)，包含 clpQ⁺::lacZ (pr-141bp)，clpQ⁺::lacZ

(pr-478bp)， clpQ^m(c→t)::lacZ (pr-141bp)，clpQ^m1::lacZ (pr-141bp)等，點突變 C→T，

A→C 及△40bp 位置如圖一所示。

選殖基因表現的宿主細胞為E. coli MC4100 (Casadaban, 1976)，RH90 (Lange

& Hengge-Aronis, 1991)，KY1429 (Yano et al., 1987)，SM25 (Marques et al., 1999)。用於製備含有 single copy clpQ::lacZ 溶原菌 ( lysogen ) 的噬菌體為 λRS45，本文所使用的菌株列於表一，載體及噬菌體列於表二。

使用的培養基為Luria Bertani Broth ( Difco )，並視情況加入 100 μg/ml 的 ampicillin，以 30 ℃，200 rpm 培養。進行熱誘導實驗時，則將 E. coli 培養於 30

℃，待生長至對數期，取樣後再移至42 ℃培養 30 分鐘，再次取樣。

(b) clpQ⁺clpY⁺啟動子區域序列建構及選殖 (1) PCR 增幅 clpQ⁺clpY⁺ promoter region 條件

為大量增幅選殖的基因片段，利用 E. coli 野生株 MG1655 chromosome 作為 DNA 模板，5’primers 及 3’primers 列於表 3，進行 PCR 反應。條件為 95 ℃denature 7 min， 95 ℃ denature 1.5 min，60 ℃ annealing 2 min，72 ℃ extension 1.5 min，進 行35 個循環，再以 72 ℃ extension 10 min 後，反應停止於 4 ℃。

(2) 酵素截切及黏合作用

PCR 產物 clpQ⁺141，clpQ⁺478，clpQ^m(c→t)141，clpQ^m1::lacZ141，clpQ^m2△40bp 經純化後，以限制酶EcoRI 及 BamHI 在 37 ℃水浴截切一小時，pRS415 及 pRS414 也以相同酵素做相同處理。再將截切後的載體和PCR 產物溶液混合，加入 2.5 倍95 %酒精及 1/10 倍 2.8 M NaOAc (pH5.2)，置於-80 ℃共同沈澱至少四小時後，

以4 ℃，11000 rpm 離心 30 min，吸除上清液後，再加入 75 % 酒精，之後以 4 ℃，

11000 rpm 離心 30 min，用 16 μl ddH2O 溶解 DNA，加入 2 μl ligation buffer，1 μl ATP，1 μl T4 DNA ligase，在 16 ℃進行 16 hr 接合反應。

(3) clpQ::lacZ 基因選殖

E. coli XL1 blue 培養至 OD600 約 0.4-0.5，離心後以冰浴之 2X TSS buffer

[10% PEG 8000/ 5% (v/v) DMSO/ 20 mM MgSO4 (pH6.5) in LB] 0.15 ml 懸浮菌 體，再加入接合反應後的反應物冰浴45 分鐘，置於 37 ℃ heat shock 2 分鐘，在 37 ℃培養兩小時，將菌液塗抹於含 100 μg/ml ampicillin 的 LA 培養基，37 ℃隔 夜培養 (Chung et al., 1989)。

待長出許多菌落後，挑出單一菌落，於100 μg/ml ampicillin 的 LB 培養基隔 夜培養，再以Viogene mini prep kit 抽取載體，並定序以確認是否含有欲選殖之 基因序列。

(4) lysogens (溶原菌) 建構

菌液於37 ℃，0.2% maltose，震盪培養隔夜，視需要加入抗生素 (此菌內的 載體含有欲建構的target DNA 序列)，取 0.2 ml 菌液，加入 λRS45 plaques，在 37

℃靜置15 分鐘。加入 R-Top Agar （10 g Bacto tryptone/ 1 g bacto yeast extract/ 8 g agar/ 8 g NaCl/ 2 ml 1M CaCl2/ 5 ml 20 % glc/ 1 L dH2O）3 ml，混勻後倒在 LA 上，

在37 ℃倒置培養 5-8 小時，待長出許多透明 plaques 後，加 5 ml TM buffer [0.05 M Tris-HCl ( pH7.5 )/ 8 mM MgSO4] 於培養皿內，靜置於 4 ℃隔夜培養。再將培 養皿內的溶液吸到乾淨試管內，加200 μl chloroform，震盪混合均勻，靜置 4 ℃ 30 min，離心取上清液即為溶胞液 ( lysate )，保存於 4 ℃。

將 lysate 以 TM buffer 稀釋，並與 R-Top agar 混合後倒在 X-gal/LA 上，37 ℃ 隔夜培養後，取藍色plaques (藍色 plaques 代表 λRS45 已帶有 target gene，可使 X-gal 變藍色)，再用前述方法製備溶胞液。

將 MC4100 置於 LB/0.2 % maltose 隔夜培養，取菌液 0.2 ml 與 R-top agar 混 合後倒入LA plate，待凝固後，滴入 0.1 ml 溶胞液，於 37 ℃隔夜培養，取溶胞 液區(透明)與菌液區(混濁)間的細菌，以 X-gal/LA 藍白篩選並分離純化得溶原菌。

(5) clpQ⁺::lacZ 轉錄及轉譯融合基因的建構

將clpQ⁺clpY⁺的啟動子 (promoter)序列與報導基因 (reporter gene) lacZ 接 合，建構兩組不同長度的clpQ⁺::lacZ 融合基因，分別為第一組 clpQ⁺::lacZ (op-141bp) (operon fusion gene or transcriptional fusion gene，轉錄融合基因)，

clpQ⁺::lacZ (pr-141bp) (protein fusion gene or translational fusion gene，轉譯融合基 因)，及第二組 clpQ⁺::lacZ (op-478bp)， clpQ⁺::lacZ (pr-478bp)。

建構方式以clpQ⁺::lacZ (op-141bp)為例，將 clpQ⁺clpY⁺的上游序列至 clpQ⁺clpY⁺的第十三個胺基酸序列 (包含啟動子的-35 及-10 box，五端未轉譯區 (5’UTR) 71 bp 與 clpQ⁺第一至第十三個胺基酸的序列)，總共 141 bp，與載體 pRS415 上的 reporter gene lacZ 接合，轉殖入 E. coli，使其帶有 pRS415- clpQ⁺::lacZ (op-141bp)。因 lacZ 的產物 β-galactosidase 可分解 X-gal 而呈現藍色，以噬菌體 λRS45 感染帶有載體 pRS415- clpQ⁺::lacZ (op-141bp)的菌株，再以 X-gal/LA 培養 基進行藍白篩選，製備溶胞液 （lysate），此時溶胞液中的λRS45，含有 clpQ⁺::lacZ (op-141bp)，最後，以 λRS45 clpQ⁺::lacZ (op-141bp)感染 E. coli MC4100 (其染色 體上的lacZ 已無作用)，繼之以藍白篩選，純化出溶原菌 (lysogen) MC4100λRS45 clpQ⁺::lacZ (op-141bp)，即 HY20001。

另外，同組溶原菌中，clpQ⁺::lacZ (op-141bp) 與 clpQ⁺::lacZ (pr-141bp) 的 不同處，在於clpQ⁺::lacZ (op-141bp) 用載體 pRS415 所建構，稱之為 operon fusion gene 或轉錄融合基因 (transcriptional fusion gene)，clpQ⁺::lacZ (pr-141bp) 用載體 pRS414 建構，稱之為 protein fusion gene 或轉譯融合基因 (translational fusion gene)。第一組 (141 bp) 與第二組 (478 bp) 融合基因不同之處，在於第二組融合 基因包含的clpQ⁺clpY⁺上游片段較長，由clpQ⁺clpY⁺的啟動子區域往前延伸337 bp，下游則同樣至 clpQ⁺clpY⁺的第十三個胺基酸為止，總長度為478 bp。

2.2.2 β-galactosidase 活性分析

菌液於適當溫度培養至OD600 = 0.3-0.7。取 0.3 ml 菌液加入 0.7 ml Z buffer (Na2HPO4/ NaH2PO4．2H2O/ MgSO4/ β-mercaptoethanol/ KCl)，以 0.1％ SDS 30 μl 及40 μl 氯仿破菌後，於 28 ℃水浴漕中預反應 5 分鐘。加入 0.2 ml ONPG (4 mg/ml) 開始計時，至反應呈黃色 (OD420=0.6-0.9)後，加入 0.5 ml 1 M Na2CO3終止反應，

記錄反應時間。測定反應液之OD420及OD550值。

活性的計算公式為:

1000 ×(OD₄₂₀ – 1.75 ×OD₅₅₀)/(T ×V ×OD₆₀₀) = Units of β-galactosidase T：反應時間 （分）

V：反應體積 (ml)

單位定義: 每分鐘每個菌體所產生之 O-Nitrophenol (Miller, 1972)。

2.2.3 北方點墨法 (Northern blotting)