RpoH 對 clpQ + ::lacZ 基因表現的影響

(a) RpoH 參與 clpQ⁺::lacZ 在一般狀況及熱誘導時的表現

sigma factor σ³² (RpoH) 可辨識的保守序列(consensus binding site)為 CCCCATXT (X=A, C, G, T)，σ³⁸ (RpoS) 可辨識的保守序列為 CTATACT，

clpQ⁺clpY⁺啟動子區域中的序列CCCCATCTATAAT，有可能受 σ³²或σ³⁸所調 控，為瞭解σ³²及σ³⁸是否參與clpQ⁺::lacZ 的表現，將 λRS45clpQ⁺::lacZ (op-141bp) 以藍白篩選的方式，帶入MC4100 (wt)，RH90 (rpoS ^-)，KY1429 (rpoH ^-)，SM25 (rpoS ^-,rpoH ^-)，得到四株溶原菌 HY20001 [wt, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)]，HY20005 [rpoS ^-, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)]，HY20006 [rpoH ^-, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)]，

HY20007 [rpoS ^-,rpoH ^-, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)]。

將此四菌於熱誘導處理前後分別取樣，分析熱誘導前後的β-galactosidase 活 性，結果如圖三。在30 ℃對數期時，HY20001 (wt) 和 HY20005 (rpoS ^-) 的活性 比HY20006 (rpoH ^-) 和 HY20007 (rpoS ^-,rpoH ^-) 高。此結果顯示，在一般生長狀 況下， clpQ⁺::lacZ 的表現受 σ³²影響。

移至42 ℃熱誘導後，HY20001 (wt) 及 HY20005 (rpoS ^-) 的 β-galactosidase 活性均大幅增加，HY20006 (rpoH ^-) 和 HY20007 (rpoS ^-,rpoH ^-) 的活性則沒有顯 著改變。此結果顯示，42 ℃熱休克對 clpQ⁺::lacZ 的誘導，受 sigma factor σ³² (RpoH) 的控制，若菌株的rpoH 基因缺失，則 42 ℃熱休克無法誘導 clpQ⁺::lacZ 表現。

(b) RpoH (σ³²) 可直接調控 clpQ⁺clpY⁺的表現

前述實驗證實42 ℃熱誘導對 clpQ⁺::lacZ 的影響受 σ³²控制，而在clpQ⁺clpY⁺ 的啟動子區域中，具有可以被σ³²辨識的序列CCCCATXT，為瞭解 σ³²是否直接 調控clpQ⁺clpY⁺的啟動子序列，在clpQ⁺clpY⁺啟動子的此段保守序列中做點突變 CC(C→T)CATCT，並觀察點突變對 clpQ^m(c→t)::lacZ 表現的影響。

在clpQ⁺clpY⁺啟動子的σ³²保守序列做點突變CC(C→T)CATCT，以 PCR 大 量產生選殖基因片段後，分別與pRS415 及 pRS414 上的 lacZ 接合，同前述方式 用λRS45 以藍白篩選的方式，得到兩種溶胞液(lysate) λRS45clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp) 及 λRS45clpQ^m(c→t)::lacZ (pr-141bp)，接著以此兩種溶胞液分別感染

MC4100 (wt) 及 KY1429 (rpoH ^-) 兩株菌，以藍白篩選方式取得溶原菌 HY20020 [wt, clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)]，HY20022 [wt, clpQ^m(c→t)::lacZ (pr-141bp)]，

HY20021 [rpoH ^-, clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)]，HY20023 [rpoH ^-, clpQ^m(c→t)::lacZ (pr-141bp)]。

將菌株HY20001 [wt, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)]，HY20006 [rpoH ^-, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)]，HY20020 [wt, clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)]，HY20021 [rpoH ^-,

clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)]培養在 30 ℃，待生長至對數期，取樣分析 β-galacto sidase 活性，並將菌株移至 42 ℃培養，30 分鐘後再次取樣分析 β-galactosidase 活性，結果如圖四(A)。

在30 ℃對數生長期的部分，具有正確啟動子序列的兩株菌，β-galactosidase 活性分別是HY20001 [wt, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)] 為 151 units，HY20006 [rpoH ^-, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)] 為 87 units，而啟動子有 C→T 點突變的兩株菌，活性分 別是HY20020 [wt, clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)] 為 84 units，HY20021 [rpoH ^-, clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)] 為 73 units，其中，HY20020 (具有正常的 σ³²，但啟 動子上的σ³²保守序列已有突變C→T) 的活性與 HY20006 (rpoH 基因有缺失，

但啟動子序列正確) 相似，表示點突變 C→T 造成 σ³²無法啟動clpQ^m(c→t)::lacZ 之表現，使其活性降低。

以42 ℃熱休克誘導後的 β-galactosidase 活性，HY20001 [wt, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)] 為 286 units，HY20006 [rpoH ^-, clpQ⁺::lacZ (op-141bp)] 為 84 units，

HY20020 [wt, clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)] 為 105 units，HY20021 [rpoH ^-,

clpQ^m(c→t)::lacZ (op-141bp)] 為 79 units，比較野生株 HY20001 與啟動子點突變的 HY20020，可知點突變後，clpQ^m(c→t)::lacZ 受 42 ℃熱休克誘導的程度顯著降低，

且rpoH 缺失的 HY20006 亦無法被 42 ℃熱休克誘導，此結果顯示點突變 C→T

造成clpQ^m(c→t)::lacZ 無法被 42 ℃熱誘導。以上結果亦說明 σ³²可直接影響clpQ⁺

clpY⁺啟動子，並調控clpQ⁺ clpY⁺表現。

將轉譯融合的菌株HY20002 [wt, clpQ⁺::lacZ (pr-141bp)]，HY20017 [rpoH ^-,

clpQ⁺::lacZ (pr-141bp)]，HY20022 [wt, clpQ^m(c→t)::lacZ (pr-141bp)]，HY20023 [rpoH ^-, clpQ^m(c→t)::lacZ (pr-141bp)] 培養在 30 ℃，待生長至對數期，取樣分析 β-galactosidase 活性，並將菌株移至 42 ℃培養，30 分鐘後再次取樣分析

β-galactosidase 活性，結果與 operon fusion 的菌株 HY20001，HY20006，HY20020，

HY20021 相似，點突變後 clpQ^m(c→t)::lacZ 受 42 ℃熱休克誘導的程度顯著降低，

且rpoH 缺失的 HY20017 亦無法被 42 ℃熱休克誘導，如圖四(B)。