ClpYQ 為 ATP 依賴型蛋白酶之研究

1.4.1 ClpY 為 ATPase 之研究

Missiakas 等人針對 ClpY 中假設性的 ATP-binding site 作研究。實驗係將假 設性的ATP-binding site 中之 Gly59 置換成 Ala；或將 Gly61 置換成 Ala。結果發 現 : （1）免疫沈澱的結果顯示，經置換過的 ClpY 蛋白無法如野生種的 ClpY 蛋白一般，可與ClpQ 蛋白形成複合體而共同沈澱出來； （2）帶有 clpQ⁺ clpY59

的多倍數質體，並不能如帶clpQ⁺ clpY⁺的多倍數質體一般可使熱休克反應下降；

（3）經純化所得的 ClpY59 及 ClpY61 失去胞外水解 ATP 的能力。由結果推論，

存在於E. coli 中之 ClpY 的 ATP-binding site “ GPTGVGKT ” 應與 ClpY 水解 ATP 的活性，及與ClpY 和 ClpQ 蛋白形成複合體有關 (Missiakas et al., 1996)。

Shin 等人亦針對 ClpY 的 ATP-binding site 作研究。利用定點突變的方式，將 ATP-binding site 中之 Lys63 置換成 Thr，而重組出 HslU/K63T 蛋白，並針對 HslU/K63T 與 HslU 蛋白作 ATP 水解能力及特性上的比較 (Shin et al., 1996)。研 究結果發現 : （1）HslU/K63T 失去了水解 ATP 的功能； （2）HslU/K63T 無法 在ATP 存在下協同 ClpQ 分解基質 Z-Gly-Gly-Leu-AMC； （3）HslU/K63T 在純 化過程中，無論ATP 存在與否，均以單體 (50 kDa) 存在，而 HslU 蛋白於 ATP 不存在時以雙體之形式出現 (100 kDa)，於 ATP 存在時，則為分子量介於 350 至 450 kDa 之複合體； （4）HslU/K63T 較 HslU (ClpY) 蛋白不穩定，容易在純化 過程中被分解成許多小片段蛋白。HslU/K63T 無論 ATP 或 ADP 是否存在，都極 易被Trypsin 分解，但是 HslU (ClpY) 於 ATP 或 ADP 存在時，可受其保護，因 而不易被Trypsin 分解。由以上的結果推論，位於 ATP-binding site 的 Lys63 對 ClpY 蛋白扮演著十分重要的角色，而 ATP-binding site 至少具有三個重要性 :

（1）水解 ATP； （2）形成 ClpY 複合體的結構； （3）ClpY 與 ATP 結合，可 增加ClpY 的穩定性。

1.4.2 ClpY 具 chaperone 功能之研究

Seong 等人將純化所得的 ClpY (HslU) 和 MBP-SulA 及 FXa 一起置於 Tris-HCl 緩衝液中，測其混濁度，發現無論 ATP 存在與否，ClpY (HslU) 蛋白的 存在可降低混濁度，即ClpY (HslU) 可以阻止 SulA 的聚集 (Seong et al., 2000)。

此外，實驗結果亦發現E. coli. hsl 突變菌株的生長較野生型好，此乃由於在 hsl 突變菌株中缺少ClpY (HslU) 蛋白，故有部分 SulA 蛋白聚集失去活性，因此細 胞生長較有ClpY (HslU) 存在而能降低 SulA 蛋白聚集的野生型細胞好。以上的

實驗結果顯示無論於胞內或胞外，ClpY (HslU) 皆具有 molecular chaperone 的功 能，能降低細胞分裂抑制物SulA 之聚集。Seong 等人亦證實 ClpY 的

oligomerization，而非 ATP 水解，為 ClpY 具有 molecular chaperone 功能所必須 (Seong et al., 2000)。

1.4.3 ClpYQ 蛋白酶為 Threonine 蛋白酶

Rohrwild 等人利用各種蛋白酶的抑制物，進行 ClpYQ 蛋白酶活性抑制實驗，

以分析ClpYQ 蛋白酶之特性。實驗結果發現，ClpYQ 蛋白酶分解 peptide Z-Gly-Gly-Leu-AMC 之能力會受到多種可抑制哺乳類 proteasome 的抑制物之抑 制 (Rohrwild et al., 1996)。這些抑制物包括 MG132 及 calpain inhibitor I、3, 4-dichloroisocoumarin 及 lactacystin，其中 3,4-dichloroisocoumarin 及 lactacystin 會修飾哺乳類及古細菌 (archaebacteria) 之 proteasome 中 N 端的 Threonine。

Rohrwild 等人將純化所得之 ClpQ 蛋白進行 N 端定序，發現 N 端有兩個 Thr 之殘 基，推論此兩個Thr 應與其蛋白酶活性有關。

由於ClpQ 蛋白與真核生物中 20S proteasome 的 β-type subunit 蛋白具有同源 性，且N 端均有兩個連續的 Thr 殘基。 Seemuller 等人對 Thermoplasma

acidophilum 中 20S proteasome 之 β-type subunit 的研究報告，推測 ClpYQ 蛋白酶 屬於Threonine 蛋白酶，且 ClpQ 蛋白中的 Thr1 及 Thr2 與蛋白酶活性有關 (Seemuller et al., 1995)。因此，Missiakas 等人針對 Thr1 及 Thr2 對 ClpQ 的活性 影響作研究，分別將ClpQ 的 Thr1 及 Thr2 置換成 Ala，而得到 HslV1 及 HslV2 兩重組蛋白，結果顯示HslV2 完全失去其蛋白酶 活性，並且於 clpQY 基因缺失 的突變種中大量表現hslV2 hslU 基因時，將無法像大量表現正常 hslV hslU 基因 時，可抑制puromycin，hslV2 hslU::Ω 亦無法像 hslV hslU::Ω 突變株可形成較小 的菌落，這顯示Thr2 與 ClpQ 的活性及 ClpYQ 蛋白酶的功能有關，ClpYQ 應屬 於Threonine 蛋白酶 (Missiakas et al., 1996)。

1.4.4 ClpYQ 蛋白酶為 ATP 依賴型蛋白酶

Rohrwild 等人發現 ClpQ 抗體可降低 ClpYQ 蛋白酶的活性，且活性降低程 度和ClpQ 抗體濃度成正比關係，然而，利用 ClpY、ClpP、Lon 等抗體或是 preimmune serum 不影響 ClpYQ 蛋白酶的活性，由此推論 ClpQ 為 ClpYQ 蛋白酶 水解活性所必須。此外，亦發現純化之ClpYQ 蛋白僅於 ATP 存在時可分解 peptide Z-Gly-Gly-Leu-AMC，而 CTP、GTP、UTP、ADP、AMP 以及 ATP 的類似物 (analogue) AMP-PNP 皆無法取代 ATP 使 ClpYQ 蛋白酶分解 peptide，且當 ATP 存在時，水解Z-Gly-Gly-Leu-AMC 的活性提高 150 倍，因而推論 ATP 水解為 ClpYQ 蛋白酶活性所必須 (Rohrwild et al., 1996)。1996 年，Missiakas 等人亦發 現在ClpY 及 ATP 存在下，會大大增加 ClpQ peptidase 的水解活性 (Missiakas et al., 1996; Rohrwild et al., 1996)。

1996 年 Yoo 等人亦得到相同的實驗結果 (Yoo et al., 1996)。Yoo 等人以多倍 數質體大量表現ClpYQ 以純化其蛋白，並對 ClpYQ 蛋白酶作特性分析。實驗結 果發現： (1)利用膠體過濾法 (gel filtration) 無論 ATP 是否存在的情況下，均可 純化得到250 kDa 的 ClpQ 複合體，推測由 12~14 個 ClpQ 單體組成； (2)在 ATP 存在的情況下可得到450 kDa 的 ClpY 複合體 (8~10 個單體)，但 ATP 不存在時 則僅可得到100 kDa 的 ClpY 複合體 (2 個單體)，這顯示 ATP 的存在與 ClpY 形 成複合體有關； (3)ClpQ 單獨存在時其水解活性相當低；當 ATP 及 ClpY 同時存 在時，ClpQ 水解 peptide Z- Gly-Gly-Leu-AMC 之能力劇烈提高，這顯示細胞中 ClpY 和 ClpQ 需在 ATP 的存在下協同作用； (4)ClpY 可水解 ATP，是一種 ATPase，而 ClpQ 存在時會刺激 ATPase 的活性達兩到四倍； （5）在 ATP 存在 下，ClpQ 可水解 peptide Z-Gly- Gly-Leu-AMC，於 dATP、CTP、α, β-methylene ATP 存在時，僅有15～40%的 peptide 被分解，此因其水解速度為 ATP 水解速度的 15

～35%，由於 GTP 及 UTP 不被水解，故無法刺激 ClpQ 水解 peptide，而 ADP 及 AMP 並非 ClpY 之基質，因而無法刺激 ClpQ 水解 peptide。無法被水解的 ATP

之類似物β,γ-methylene ATP 亦無法取代 ATP，促使 ClpYQ 蛋白酶分解 peptide，

此結果顯示ATP 水解為 ClpQY 蛋白酶活性所必須。綜合上述結果可知，細胞中 ClpY 和 ClpQ 需在 ATP 存在下協同作用，故 ClpYQ 蛋白酶為一 ATP 依賴型蛋白 酶。