GspdSH 簡介

1.10.1 GspdSH 組成物質: GSH 及 spermidine

GSH 是一種 tripeptide，由 L-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glycine 組成，在好氧物 種 (aerobic species) 中是最主要的低分子量硫醇 (low molecular weight thiol)，細 胞內濃度約為0.1 至 10 mM。細胞內大部分 GSH 維持在還原態 (reduced ，thiol form)，亦即 GSH，其他則以 GS-S-protein、GSSG、thioester 形式存在 (Pai et al., 2006)。藉由將大多數 GSH 維持在還原態，GSH 可維持細胞內氧化還原狀態的平 衡，還原態GSH 可將 H2O2或其他過氧化物還原，本身則變成氧化態的glutathione disulphide (GSSG)，GSSG 再經由 glutathione reductase 及 NADPH 的作用，還原 成GSH。

Spermidine [C9H17N3，N-(3-aminopropyl)butane-1,4-diamine] 是細菌細胞中主 要的多胺 (polyamine)。Spermidine 在細菌細胞中作用廣泛，可和磷酯質結合，

達到穩定細胞膜或其他膜結構的效果，或調節膜通透性。另外，多胺類物質亦與 細胞生長及抗氧化有關，其方式為多胺可刺激調控蛋白的生成 (Raj et al., 2001;

Tkachenko & Nesterova, 2003)，進而影響許多與生長或抗氧化相關基因的表現，

如多胺可刺激RpoS、OxyR、FecI、Fis 等調控蛋白的生成，OxyR 可誘導抗氧化 相關基因的表現，RpoS 則與生長遲滯期 (stationary phase) 的許多基因表現有關 (Jung & Kim, 2003)。

1.10.2 大腸桿菌中 GspdSH 及其合成酵素 GspS 相關之研究

GSH 的 glycine carboxylate 與 spermidine 之間，可用醯胺鍵結，形成 GspdSH。

在一般培養條件下，E. coli 生長至指數生長期 (log phase) 或遲滯期 (stationary phase)，菌體內都無法測得 GspdSH。但若將 E. coli 以 M9 minimal medium 搖動 通氣培養 (shaker) 到遲滯期時停止搖動，可在菌體中偵測到 GspdSH 的存在 (Tabor & Tabor, 1975)，Tabor 等人偵測此條件下 (厭氧/生長遲滯期)，二十分鐘內 細胞中GspdSH 和 spermidine 濃度不變，但 GspdSH 卻一直進行生成和分解，並 且發現，在指數生長期時，spermidine 沒有顯著代謝，但進入遲滯期後，大部分 的spermidine 改以 GspdSH 形式存在。若將遲滯期的 E. coli 培養液用新鮮培養 基稀釋，會使GspdSH 快速分解成 GSH 及 spermidine，據此推測使 GspdSH 在生

長遲滯期累積的原因可能有二，一是GspdSH 可能在所有生長期皆可生成，但在 指數生長期時，GspdSH 的分解速度快，另一可能性是遲滯期細胞內的酸鹼值或 氧化還原狀態改變，造成某種酵素活性的改變，使GspdSH 累積（此時期尚未發 現合成GspdSH 的酵素 GspS）。De Craecker 等人觀察 E. coli 所有生長期中 GSH 與GspdSH 含量變化 (De Craecker et al., 1997)，在 aerobic/ M9 minimal medium 狀態下，整個生長期中的GSH 含量穩定，指數生長期中期 (mid-log phase) 會生 成微量GspdSH，約佔 GSH 總量的 3%，到了遲滯期，GspdSH 生成量增加，佔 GSH 總量的 11%。在 aerobic/M9 minimal medium 狀態下培養 E. coli 至指數期，

再換到厭氧狀態 (anaerobic) 培養 6 小時，測得 GspdSH 逐漸增加，最後 80%以 上的GSH 轉變成 GspdSH；但在全程中都沒有測到 N¹, N⁸-bis (glutathionyl) spermidine，即 TSH 的存在，此外，在 glutathione reductase 中加入不同的基質 (substrate)，發現 glutathione reductase 除了可還原 GSH，也可以還原 GspdSH 與 GSH 間的雙硫鍵 (GspdS-SG)，所以 De Craecker 等人推測，GspdSH 的作用可能 是調節GSH 或 spermidine 含量，或者 GspdSH 就像 TSH 在 Trypanosoma，是一 種比GSH 更好的抗氧化物，由於 GspdSH 在遲滯期會累積，GspdSH 也可能和壓 力反應 (stress response) 有關。

GSH 和 spermidine 結合，形成 GspdSH，此作用在 E. coli 中由酵素 GspS 進 行。 E. coli 的 gspS 在 1995 年首次由 Bollinger 等人發現，並定出基因及胺基酸 序列 (Bollinger et al., 1995)，此基因位於 E. coli 染色體 67.5 分鐘處，全長 1860 bp，其產物 GspS 由 619 amino acids 組成，約 70 kDa。是一種具有雙重功能的酵 素 (bifunctional enzyme)，有合成酶 (synthetase)活性，在 ATP 及 Mg²⁺存在下，

可催化glutathione 與 spermidine 間醯胺鍵的形成，產生 GspdSH。除了合成酶之 外，GspS 也具有醯胺酶 (amidase) 活性，可使 GspdSH 的醯胺鍵水解成 GSH 及 spermidine。之後，更進一步發現，GspS 的 N 端 1 至 195 胺基酸有醯胺酶 (amidase) 功能 (Pai et al., 2006)，C 端 206 至 619 胺基酸是合成酶，linker region 為 196 至 205 胺基酸。