4.1 摘要
經研究已知ClpYQ 以六元環方式組合，其中 ClpY 負責基質辨識，利用水解 ATP 作為能量來源，打開基質結構，並傳送到 ClpQ 進行分解。至於 ClpY 如何 辨識並選擇基質，以及後續傳送降解基質的細節，目前尚屬未知。本文針對ClpY 基質辨識區域做一研究與討論。ClpY 可分為三個作用區(domain)，如圖十四，
N-terminal domain，I-intermediated domain 及 C-terminal domain，N domain 具有 ATPase 的功能，C domain 則與 self-oligomerization 及 ClpQ 的蛋白酶活性相關。
由X-ray 結構分析，認為 I domain 能與 ClpQ 結合，並負責與基質互相作用。ClpY 的I domain 中，有兩個 loop 結構，分別為 loop L1(137-150 aa)與 loop L2(175-209 aa)，已知將 loop L2 移除後，ClpY△(175-209 aa)
在ClpQ 存在時仍然無法分解 SulA (in vitro)，但其分子機制未明。利用酵母菌雙雜交系統(yeast two-hybrid system)分 析，可知ClpY 與 SulA 之間有蛋白質交互作用，本文亦使用酵母菌雙雜交系統，
進一步得知ClpY 的 I domain 負責基質辨識，C domain 則可與 ClpQ 作用，而 I domain 中的 loop L2(175-209 aa)除了與基質結合外，並與後續的基質傳遞及分解 相關。
4.2 材料與方法
4.2.1 酵母菌雙雜交系統的菌株、載體及培養基
本文使用酵母菌Saccharomyces cerevisiae EGY48 (his3, trp1, ura2,
lexAop(x6)-leu2)，其內帶有載體 p8op-lacZ，報導基因為 lacZ 與 leu2，另使用兩載 體pGilda (a LexA DNA binding domain)及 pB42AD (a B42 popypeptide activation domain)。將欲探討的基因片段(如 clpY 或 sulA)分別帶入載體 pGilda 及 pB42AD，
以植物蜜糖raffinose 及半乳糖 galactose 誘導兩載體產生 ClpY 及 SulA，若兩者 (ClpY 與 SulA)結合，則可啟動報導基因 lacZ 或 leu2 表現，lacZ 表現時，菌落在 LA/X-gal 培養基上呈現藍色，β-galactosidase 活性升高，leu2 表現時，菌落可以 在缺乏Leucine 的培養基中生長。
用於培養酵母菌的培養基為SD medium (ddH2O 90 ml/ agar 2.0 g/ yeast nitrogen base w/o amino acid 0.67 g 或 mini SD base Gal/Raf 3.7 g/ DO supplements 依包裝標示加入/ glucose 2.0 g/ 10X BU salts(only for X-gal) 10.0 ml/ X-gal (20 mg/mlDMF 避光保存於-20 ℃)/加水至 100 ml。使用液態培養基時不需加入 agar。一般培養時使用 yeast nitrogen base w/o amino acid，並加入 glucose；需誘 導質體表現時使用mini SD base Gal/Raf，不加入 glucose。DO supplements 依營 養缺陷培養基的需求，使用-Ura/-His/-Trp，或是-Ura/-His/-Trp/-Leu。10X BU salts 及X-gal 需先滅菌降溫之後再加入。
4.2.2 leu2 expression : 生長測試
當兩蛋白質有交互作用時，報導基因LEU2 的表現，可使菌株生長於缺乏 leucine 的 選 擇 性 培 養 基 上 。 首 先 挑 選 EGY48 [p8op-lacZ] 雙 質 體 轉 形 株 (cotransformants) 之單一菌落接種至 1 ml 的 SD /-Ura/-His/-Trp 培養液，於 30oC 培養 箱中隔夜培養菌體約12 - 16 小時。再以 3000 rpm 離心 5 分鐘，收集菌體，以 1 ml 無 菌 水 清 洗 菌 體 ， 再 次 離 心 ， 移 除 上 清 液 。 接 著 用 1 ml 的 Gal/Raf/-Ura/-His/-Trp 培 養 液 懸 浮 菌 體 ， 取 0.2 ml 菌 液 接 種 至 2 ml 的 Gal/Raf/-Ura/-His/-Trp 培養液，於 30oC 培養箱震盪培養 5 - 6 小時，至 OD600吸 光值為0.5 - 0.7。取 1 ml 培養至對數期的菌液，以 1 ml 無菌水清洗菌體，離心 後移除上清液，重複兩次。以無菌水將清洗過的菌體稀釋2 倍。取稀釋後的菌 液5 μl 滴於 Gal/Raf/-Ura/-His/-Trp/-Leu 的平板培養基上，於 30oC 培養箱中連 續培養數天，觀察生長情形。
4.2.3 lacZ expression：X-gal 測試
當兩蛋白質有交互作用時，報導基因lacZ 表現，會產生β-galactosidase，可
將 X-gal 分解產生藍色物質，於含 X-gal 的選擇性培養基上呈現藍色菌落。首 先挑選EGY48 [p8op-lacZ] 雙質體轉形株 (cotransformants) 之單一菌落接種至SD /-Ura/-His/-Trp 平板培養基上，於 30oC 培養箱中隔夜培養 1 - 2 天，活化菌體。沾 取菌落劃於含80 mg/l 之 X-gal 的 Gal/Raf/-Ura/-His/-Trp 平板培養基上，於 30oC 培養箱中連續培養數天，觀察生長情形。
4.2.4 lacZ expression：β-galactosidase 活性分析
當報導基因LacZ 表現，產生β-galactosidase，可分解 ONPG (O-Nitrophenyl β-D-Galactopyranoside)，藉由分解的活性測試，分析兩蛋白質交互作用情形。
首先挑選EGY48 [p8op-lacZ] 雙質體轉形株 (cotransformants) 之單一菌落接種至 1 ml 的 SD /-Ura/-His/-Trp 培養液，於 30oC 培養箱中隔夜培養菌體約 12 - 16 小時。
再以3000 rpm 離心 5 分鐘，收集菌體，以 1 ml 無菌水清洗菌體，再次離心，
移除上清液。接著以1 ml 的 Gal/Raf/-Ura/-His/-Trp 培養液懸浮菌體，取 0.5 ml 菌液接種至5 ml 的 Gal/Raf/-Ura/-His/-Trp 培養液，於 30oC 培養箱震盪培養 5 - 6 小時，至OD600吸光值為0.5 - 0.7，紀錄各樣品的 OD600值。
取1 ml 菌液 (每個樣品均做三重複)，以 14000 rpm 離心移除上清液，收集 菌體。再以1 ml 的 Z buffer 懸浮菌體，加入 40 μl 0.1% SDS 及 60 μl chloroform，
劇烈震盪10 秒進行破菌。置於 28oC 水浴槽中預反應 5 分鐘。接著加入 200 μl ONPG 至每個反應試管及空白組中 (以 1 ml Z buffer 加入 40 μl 0.1% SDS 及 60 μl chloroform 作為空白組)，開始計時。待顏色轉變黃色 (OD420吸光值約在0.4 - 0.6) 後，加入 0.5 ml 的 stop solution (1 M Na2CO3) 終止反應，並記錄總反應 時間。最後離心使細胞碎片沉降後，取上清液測量OD420吸光值。
活性的計算公式為：
Units of β-galactosidase = (1000 × OD420) / (T × V × OD600) T：ONPG 加入至中止液加入所反應之時間 (分) V：參與反應菌液之體積 (ml)
Unit 定義：每分鐘每個菌體所產生之Ο-Nitrophenol (Miller 1972)。
4.2.5 ClpY 及其突變分解基質之偵測
偵測ClpY 及其突變是否可以順利分解基質時，使用 E. coli AC3112 (lon -, clpQ -clpY -, cpsB::lacZ)，將 clpY 及其衍生的突變基因與 pBAD24 接合，送入 AC3112/ pBAD33-clpQ，以阿拉伯糖誘導兩載體表現，產生之 ClpQ 與 ClpY(或 突變的ClpY)如能正常作用，則 ClpYQ 可分解基質 SulA 或 RcsA。當培養基中 加入MMS 使細菌產生大量的 SulA，而 SulA 被 ClpYQ 分解，此時菌株可正常生 長，另外，當ClpYQ 分解 RcsA 時，報導基因 cpsB::lacZ 缺乏活化物，活性下降。
4.3 結果
4.3.1 ClpY 基質辨識：ClpY△I+7Gly及ClpY△L1, △L2與SulA 之間沒有交互作用 前人研究已知，ClpY 的 I domain 中有兩個環狀結構(loop)，分別為 loop L1(137- 150 aa)及 loop L2(175-209 aa)，若將 loop L2 去除，ClpY 無法分解 SulA。
為瞭解I domain 與基質辨識及分解的相關性，建構以下各組載體：pGilda- clpY，
pGilda-clpY△L1，pGilda-clpY△L2，pGilda-clpY△L1, △L2，pGilda-clpY△I+7Gly，ClpY△L1 係將I domain 中的 loop L1 移除，ClpY△L2將I domain 中的 loop L2 移除，ClpY△L1,
△L2則移除loop L1 及 L2 都去除，ClpY△I+7Gly以七個Glicine 取代 I domain，經由 X-ray 分析已知其構形與 ClpY 相似。
將各載體分別送入EGY48/pB42AD-sulA+，觀察這些菌株在缺乏Leucine 的 選擇性培養基中的生長狀況，結果如圖十五(A)，BD-ClpY/AD-SulA，BD-ClpY△L1/ AD-SulA，BD-ClpY△L2/AD-SulA 可生長，BD-ClpY△L1, △L2/AD-SulA，
BD-ClpY△I+7Gly/AD-SulA 無法生長，此結果顯示 loop L1 與 loopL2 皆可與 SulA 作用。
為瞭解上述不同的ClpY 與 ClpQ 作用後，是否具備分解基質的能力，將 clpY 及其衍生基因分別與載體pBAD24 接合，得到載體 pBAD24，pBAD24-clpY，
pBAD24-clpY△L1，pBAD24-clpY△L2，pBAD24-clpY△L1, △L2，pBAD24-clpY△I+7Gly，
將上述各載體送入AC3112/pBAD33-clpQ+，觀察報導基因cpsB::lacZ 的表現，結 果如圖十五(B)，只有 ClpY 與 ClpY△L1兩者與ClpQ 作用後，可正常分解 RcsA activator，使 cpsB::lacZ 的活性降低，ClpY△L2，ClpY△L1, △L2與ClpY△I+7Gly三者則 否，另外，以MMS test 觀察 ClpYQ 是否可分解 SulA，使細菌正常生長，結果 如圖十五(C)，ClpY 與 ClpY△L1兩者與ClpQ 作用後，可分解 SulA，細菌生長正 常，ClpY△L2，ClpY△L1, △L2與ClpY△I+7Gly三者則無法分解SulA，細菌無法正常生 長，此結果顯示，在ClpY 與基質結合後，loop L2(175-209 aa)與基質的進一步傳 送及分解相關。
4.3.2 ClpY 基質辨識： loopL2 上的點突變 ClpYL199Q造成ClpYL199Q/ClpQ 無法 分解基質
為瞭解I domain 中，哪些胺基酸與 SulA 的結合相關，在 clpY 的 I domain 序列做error prone PCR，取得 clpY 隨機突變片段，與載體 pB42AD 接合後，送 入yeast EGY48/pB42AD-sulA+/p8op-lacZ，以藍白篩選方式挑出與野生株 EGY48/
pB42AD-clpY/pGilda-sulA+/p8op-lacZ 顏色相異者（深藍色或白色），經定序知突 變處為M187I，A188S，L199Q，N205K，皆集中於 loop L2。
此四突變株與野生株AD-ClpY/ BD-SulA 的 SulA binding 活性測試結果如圖 十六(A)，AD- ClpYM187I/BD-SulA 在 X-gal 培養基中生長時為深藍色，且
β-galactosidase 活性較高，顯示其與 SulA binding 較強，ClpYL199Q在X-gal 培養 基中生長時為白色，且β-galactosidase 活性極低，顯示其與 SulA binding 很弱，
ClpYA188SClpYN205k在X-gal 培養基中生長時為淡藍色，且 β-galactosidase 活性稍
低，顯示其與SulA binding 較弱。
另欲知上述四處突變對ClpYQ 分解基質的影響，建構四組載體
pBAD24-clpYM187I，pBAD24-clpYA188S，pBAD24-clpYL199Q，pBAD24-clpYN205K， 分別送入AC3112/pBAD33-clpQ，測 cpsB::lacZ 活性，結果如圖十六(B)，除
ClpYL199Q活性升高，無法正常分解基質外，其餘三者皆可分解基質。
4.3.3 ClpY 基質辨識：ClpY 的基質辨識與 loopL2 上的疏水性胺基酸密切相關
為確認I domain 中的疏水性胺基酸與基質結合的相關性，在前述四組隨機突 變處附近做點突變，建構三組新載體pB42AD-clpYI186N，pB42AD-clpYE193L,E194L
， pB42AD-clpYQ198L,Q200L，送入yeast EGY48/pGilda-sulA+/p8op-lacZ，經缺乏 Leucine 的培養基培養後，結果如圖十七(A)，ClpYE193L,E194L，ClpYQ198L,Q200L
可生長，表 示此兩組突變可與SulA 結合，ClpYI186N則無法與SulA 結合，此結果顯示 ClpY 需要loop L2 的疏水性胺基酸才能與基質 SulA 結合。
將此三突變與載體pBAD24 接合，分別送入 AC3112/pBAD33-clpQ，測 cpsB::lacZ 活性，結果如圖十七(B)，ClpYI186N，ClpYE193L,E194L，ClpYQ198L,Q200L
三者的活性都升高，無法分解基質。顯示ClpYI186N無法順利與基質結合， 440 個胺基酸 R440 相連接(Rohrwild et al., 1997)，且 X-ray 結晶結構亦得出 ClpY 以I domain 與 ClpQ 作用之結論((Bochtler et al., 2000))。由本實驗室先前研究則 顯示，與野生型的ClpQ 相比，ClpQE61C與ClpY 的親和力較佳，並具有正常的 蛋白酶功能。為探討ClpY 以哪一部份與 ClpQ 相連結，將 clpY 的 C domain 去除 後，建構新載體pGilda-clpY△C，另外，將clpY 的 C domain 置換為 clpX 的 C domain (已知 ClpX 的 C domain 與 ClpQ 無作用(Kim & Kim, 2003))，建構新載體
pGilda-clpYX。
將載體pGilda，pGilda-clpY，pGilda-clpY△L1，pGilda-clpY△L2，pGilda-clpY△L1,
△L2，pGilda-clpY△I+7Gly及pGilda-clpY△C與pGilda-clpYX 分別送入 EGY48/pB42AD -clpQE61C，觀察各菌株在缺Leucine 培養基的生長狀況，結果如圖十八，
BD-ClpY/AD-ClpQE61C，BD-ClpY△L1/AD-ClpQE61C，BD-ClpY△L2/AD-ClpQE61C， BD-ClpY△L1, △L2/AD-ClpQE61C，BD-ClpY△I+7Gly/AD-ClpQE61C中，ClpY 與 ClpQ 交
互作用正常，菌株可生長，BD-ClpY△c/AD-ClpQE61C，BD-ClpYX/AD-ClpQE61C 中，ClpY 與 ClpQ 無法正常作用，使菌株無法在缺 Leucine 的培養基中生長，以 上結果顯示，ClpY 的 C domain 可以與 ClpQ 相結合。
4.4 討論
在ClpY 基質辨識的研究中，以酵母菌雙雜交系統證實，缺乏 I domain 但 N 與C domain 之間仍有七個 Gly 相連的突變 ClpY△I+7Gly，無法與SulA 結合，而 ClpYQ 複合體之結構，中間部分為兩個 ClpQ 六元體，上下則是兩個 ClpY 六元 體，且I domain 位於複合體最外層（附圖一 A），顯示ClpY 是以突出的 I domain 來進行基質辨識。
前人研究已知，在in vitro 狀態下，ClpY 分解 MBP-SulA 需要 loopL2 (Song et al., 2000)，且在 X-ray 結構中，H. influenza 的 ClpY，其 loopL2 呈現αloop 結構 (Sousa et al., 2000)。本文研究則顯示，單獨缺乏 loopL1 或 loopL2 時，ClpY 仍可 辨識基質，但兩者皆缺乏時，ClpY 失去與基質結合的能力，此結果與結晶結構 中，ClpY 的 I domain 上，loopL1 與 loopL2 位於複合體中 I domain 的外側相呼 應(附圖一 B)。另外，ClpY△L2無法與ClpQ 共同作用並分解 SulA，表示 loopL2 在in vivo 狀態下，與基質結合之後的基質傳送有關，此亦與結晶結構中，loopL2 為一具有彈性的loop 結構之結果相對應。