TNF-α 及 IL-6 可能透過 transcription level 的抑制，影響 SERCA2

HL-1 細胞培養與過渡性轉染

由於新生心臟心肌細胞的低轉染率 (約 10%)，我們使用 HL-1 心肌細胞進行其他需 要進行過渡性轉染的心肌細胞實驗。由美國紐奧良路易西安那大學所取得的 HL-1 細胞株衍生自成年小鼠心房組織(Claycomb, Lanson et al. 1998)，可依製造商說明以 使用 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) 進行過渡性轉染實驗，過去許多實驗已經證 明此細胞雖為心房組織取出，不過離子通道特性，蛋白質表現均可代表整體心臟 之功能(Tang, Tian et al. 2012)，故在本論文中以此細胞代表心臟細胞之舒張功能細 胞模式。根據 GFP 螢光顯示，轉染成功率為 60~80%。細胞轉染後 24 小時，接著 進行 Luciferase 融合質體嵌入與西方墨點分析等實驗。每 0.5μg luciferase 報告者質 體和0.5 μg pRL-TK 載體進行共轉染，pRL-TK 載體為當作內部控制。轉染後 24 小時將細胞進行下一步實驗。標準化的 luciferase 活性以雙 luciferase 報告者質體分 析系統測量，並且用自動冷光儀讀取。

建構 SERCA2 啟動子-Luciferase 融合質體

利用聚合酶連鎖反應複製一段 1754bp 老鼠 SERCA2 基因啟動子片段，使用根據已 發表的老鼠心肌細胞 ATPase, Ca++ transporting 基因序列 (GenBank accession number NW_047375)設計而來的前置引子與後置引子： (5’-

AGAGAGGTCATGACCTTC-3’ [-1720 to –1703] 與

把將近 1.8kb 的聚合酶連鎖反應產物從 BglII 與 HindIII 切點次轉殖入 pGL3Basic 載體(Tsai, Wang et al. 2007)。HL-1 的心肌細胞轉殖入SERCA2 啟動子-Luciferase 融 合質體或者是單純pGL3Basic 載體作為對照組。同時另一組 HL-1 細胞僅加入 pRL-TK 載體 (Promega Corporation)作為內對照組。確定轉殖成功之後，便加入不

同濃度的 TNF-α(50pg/mL, 500pg/mL, 5ng/mL, 50ng/mL)或者 IL-6(100pg/mL, 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL)刺激細胞達 24 小時，以冷光儀測定 Luciferase 的表現 量。 螢光；鈣離子濃度利用公式 C=Kd×R/(Kd/C0+1-R) (Chen et al., 1993)來計算，R 表 示 F/F0、Kd 表示(=1.1 μmol/L)細胞質內 Fluo-3 的解離常數、C0 (=150 nmol/L) 表 示靜止態的鈣離子量。實驗在 30±0.5 °C 進行。同樣加入便加入 TNF-α(5ng/mL) 或者 IL-6(10ng/mL)刺激細胞之後測定鈣離子通道的表現量。

RNA 萃取與實時定量反轉錄聚合酶連鎖反應

在 HL-1 細胞加入 TNF-α(5ng/mL)或者 IL-6(10ng/mL)刺激細胞 0,2,6,12 或者 24 小 時之後測定 SERCA2 的 mRNA 表現量。利用 TRIZOL 方法萃取細胞總 RNA，接 著用 RQ1 RNase-free Dnase 以及 M-MμLV transciptase with oligo-dT primers 來進行 反轉錄。利用 SYBR 綠色染料將單股 cDNA 擴增 (ABI-Prism 7900, Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA)。同時測定細胞內 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA 當作內控制組。對老鼠 SERCA2 而言，前置引子 為 5’-CCATCTGCTTGTCCATGTCACT-3’，後置引子為

5’-CAAATGGTTTAGGAAGCGGTTACT-3’。對 GAPDH而言，前置引子為

5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’，後置引子為5’-GATGCAGGGATGATGTTC-3’，

所有的實驗，不同的時間點都進行三次，取平均值。

蛋白質萃取、西方墨點分析

使用 1x10⁶/3.5 cm²大小的培養皿來培養 HL-1 細胞，24 小時不加入血清培養，接 著我們使用嚴重敗血症患者的血清，或者 TNF-α(5 ng/mL)，IL-6(10 ng/mL)等激素 來刺激細胞，分不同時間點收集蛋白(0,2,6,12,24 小時)，另外也使用正常人的血清 當作對照組加入細胞中。細胞質蛋白、西方墨點分析的實驗步驟依照先前文獻所 述進行(Tsai, Wang et al. 2007)。本次實驗所使用的 SERCA2 一級抗體是山羊抗 SERCA2 多株抗體(sc-8094, Santa Cruz)，HRP 接合的山羊抗體當作二級抗體(Santa Cruz)，也使用兔抗 GADPH 多株抗體 (Lab Frontier, Seoul, Korea)來偵測 GADPH 表現，接著使用 HRP 接合的兔抗 IgG 抗體作為二級抗體(Santa Cruz)。

統計分析

數據以平均值附加標準差的形式來呈現，並且使用 Student t test 來分析個別的樣品。

小於 0.05 的 P 值視為統計上有意義。

第二節 探討 TNF-α 可能影響 SERCA2 的機轉(pathway)，是否直接影響心臟舒 張功能以及是否可以被藥物所反轉-細胞及動物實驗模式

材料與試劑

Simvastatin 由美國默沙東藥廠(MSD, Rahway, NJ, USA)友善地提供。TNF-α 購自 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)。SERCA2 抗體是 polyclonal 羊抗體，抗 IKKα/β 蛋白是 polyclonal 兔抗，抗 IκB-α 抗體是 monoclonal 鼠抗購自 Santa Cruz biotechnology (USA) 。另外上述抗體的二抗採用 horseradish peroxidase 結合的羊 抗，購自 Santa Cruz biotechnology (USA)。對照組的抗 GADPH 蛋白採用 polyclonal 兔抗，購自 Lab Frontier, Seoul, Korea。萃取核蛋白使用 monoclonal 的鼠抗來對抗 nucleolin，購自 Enzo lift science(10 Executive Blvd Farmingdale, NY 11735, USA)偵 測 的 方 式 用 ECL reagents(Millipore Chemiluminescent HRP substrate; Pierce

Chemical Co., Rockford, IL, USA)，偵測核內的 NF-κB p65 蛋白抗體購自 Abcam，

(1 Kendall Square, Suite B2304 Cambridge, MA 02139-1517 USA)。雙 luciferase 分析 套組、pGL3Basic 與 pRL-TK 載體購自 Promega Corp. (Madison, WI, USA)，

LipofectAMINE 2000 試劑購自 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA)。Fluorescent dyes 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA)、Fluo-3 AM、與發散劑 pluronic F-127 購自 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)。免疫沉著實驗中， NF-κB p65 次 單元體的抗體採用 polyclonal 兔抗(Abcam, 1 Kendall Square, Suite B2304 Cambridge, MA 02139-1517 USA)，偵測則使用結合 FITC 的羊抗(West Grove, PA, USA 19390)，

染色用的 DAPI(Sigma)用來染核，Texas-Red-phalloidin ( Invitrogen Corporation , Staley Rd. Grand Island, NY ,USA)則用來染心肌纖維骨幹來區分心肌細胞以及纖維 母細胞。

HL-1 細胞培養與過渡性轉染

HL-1 心肌細胞如同先前描述(Claycomb, Lanson et al. 1998)。HL-1 心肌細胞的過渡 轉染及 luciferase 質體分析系統也如上面的實驗所述。轉染後 24 小時將細胞進行下 一步實驗。標準化的 luciferase 活性以雙 luciferase 報告者質體分析系統測量，並且 用自動冷光儀讀取。

建構 SERCA2 啟動子-Luciferase 融合質體

利用聚合酶連鎖反應複製一段 1754bp 老鼠 SERCA2 基因啟動子片段，如同前面一 個實驗所述的方式，把將近 1.8kb 的聚合酶連鎖反應產物從 BglII 與 HindIII 切點 次轉殖入 pGL3Basic 載體(Wu, Lee et al. 2011)。HL-1 的心肌細胞轉殖入SERCA2 啟動子-Luciferase 融合質體或者是單純pGL3Basic 載體作為對照組。利用同樣的策 略，將另外 2 個刪除構築質體利用 2 個前置引子製造出來：(5’-

TTCAGATCTGAAGCCAAAGCCAAGCTACC-3’ [+34 to –480], 以及 5’-

TTCAGATCTGCAAGCCAAGGACACCAGTC-3’ [+34 to –846])，兩者具有共同的 後置引子: 5’-GAGGAGACGGGAGGTGGCGTC-3’ [+14 to +34]，確定轉殖成功之

後，便加入不同濃度的 TNF-α(0.01, 0.1, 1μM)刺激細胞達 24 小時，以冷光儀測 定 Luciferase 的表現量。

RNA 萃取與實時定量反轉錄聚合酶連鎖反應

RNA 萃取，實時定量，以及反轉錄聚合酶連鎖反應測定 SERCA2 濃度的步驟如前所 述，在 HL-1 細胞加入 TNF-α(100 ng/mL)伴隨 simvastatin(1, 5μM)或者 ammonium pyrrolidinedithiocarbamate (PDTC, 20μM))或者食鹽水，刺激細胞 0, 0.5, 2, 16 或者 24 小時之後測定 SERCA2 的 mRNA 表現量。，所有的實驗，不同的時間點都進行 三次，取平均值。

蛋白質萃取、西方墨點分析

使用 1x10⁶/3.5 cm²大小的培養皿來培養 HL-1 細胞，24 小時不加入血清培養，接 著我們 TNF-α(0,1,5,50,100 ng/mL)伴隨 simvastatin(1, 5μM)或者食鹽水，刺激細胞 0, 0.5, 2, 16 或者 24 小時之後測定細胞質中 IKK，p-IKK，IκB 以及 SERCA2 蛋白 4% paraformaldehyde 以及 1% Triton X-100 固定細胞之後，對 NF-κB p65 次單元體 染色。在 incubation 的過程中，加入 DAPI 以成色細胞核，Texas-Red-phalloidin conjugate，來染細胞纖維骨幹。然後使用數位相機鏡頭(Olympus epifluorescence microscope)搭配 60 倍放大的油鏡來成像。影像經由灰階轉換成亮色螢光由 Adobe Photoshop 成影。

大鼠的發炎反應以及舒張性功能不良模式

24 隻 200~300 克大小的 Wistar 大鼠分成 2 組，其中 12 隻腹腔注射 LPS (10mg/kg) 連續三天，根據我們初步的結果及過去研究的報導可以誘導發生高發炎反應的左

心室舒張功能不全模式(Terashita, Kawamura et al. 1992; Xu, Wang et al. 1992)。使用 的 LPS 是 Escherichia coli, 0127:B8, phenol extraction (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 UNITED STATES)。其他的 12 隻作為對照組(注射食鹽水)。注射製劑之後，

所有的老鼠都維持 12 小時日夜交替模式，溫度維持在攝氏 21~24 度。老鼠血清中 的 TNF-α 用 high-sensitivity enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)的方式測 量(McKinley Place NE, Minneapolis, USA , R&D systems)。除了正常飲食之外，對 照組或者實驗組的老鼠分別依據注射 LPS 的有無，再選取一半的老鼠給予水或者 simvastatin (5 mg/kg per day for 7 days)。經過三天之後，幫大鼠做超音波檢測，接 著犧牲老鼠，用 Langendorff 的方式灌流心臟五分鐘後收集檢驗，動物實驗均經由 台灣大學醫學院動物中心許可進行。

大鼠的心臟超音波量測

大鼠的心臟超音波均在以 pentobarbital (40 mg/kg; i.p.)麻醉大鼠後進行，使用 Sonos 7500 心臟超音波 (Hewlett-Packard, Andover, MA, USA)搭配 12-MHz 的探頭進行。

測量的項目包括包括胸骨旁長軸切面測量舒張末期的心室中隔，心室徑，心室後 壁及收縮末期的心室中隔，心室徑，心室後壁之厚度，也用都卜勒的方式，計算 收縮末期的二尖瓣膜進入血流流速包括早期填充期，E 波，和晚期舒張填充期，A 波，也會量測 E 波的減速時間。另外使用組織都卜勒的方式測量 E’的數值來代表 心臟的舒張功能(Lang, Bierig et al. 2005; Salemi, Bilate et al. 2005)。

大鼠舒張性功能不良之訊息傳遞分析

處理過的老鼠心臟使用 Nonide P40 (NP-40)為基礎的試劑來萃取純化心臟的蛋白，

接著使用西方點墨法(方法如前述)來決定 IκB 的代謝，IKK，p-IKK，SERCA2，以 及 GAPDH 的濃度。

第三節 探討臨床 DHF 病患，加護病房嚴重發炎反應的病患，發炎反應物質與心 臟舒張功能的關係以及預後的影響

本研究是橫斷面研究的方式來探討血漿中發炎反應物質在舒張性心衰竭的病 素轉化劑阻斷劑，乙型阻斷劑 (beta-blocker)，鈣離子阻斷劑 (calcium channel blocker)。 高血壓及糖尿病的定義如第一部分實驗所述。所有病人都做 M-mode 二 維心臟超音波併用都卜勒測量，紀錄的項目亦如同前面實驗所敘述，另外，我們 也用都卜勒的方式，計算各項舒張功能及心臟功能指標。舒張性心衰竭的定義:採 用歐洲心臟科學會 2007 年最新的共識(Paulus, Tschope et al. 2007)(圖 2-2)，符合 NYHA 心衰竭症狀 II~III 以上，沒有排除條件，以都卜勒超音波為主要診斷工具，

E/E’ > 15 或者如果 E/E’在 8~15 之間時，需要加上其他超音波的客觀標準，二尖瓣 血流都卜勒(病患 50 歲以上，E/A 比值<0.5，deceleration time > 280 ms)，另外就是 收縮功能正常，也就是左心室心搏輸出率≧50%。本研究經由台大醫院倫委會審核 並通過，病人也都有簽署同意書。所有加入實驗的病患都測量血清中的發炎指標，

包括 TNF-α 及 IL-6。排除條件：有心肌梗塞病史或有明顯冠狀動脈疾病 (冠狀動 脈狹窄大於 50%，coronary artery stenosis >50%)，中度以上的瓣膜疾病，心肌病變，

心包膜疾病，慢性肺病，腎衰竭，心電圖顯示寬 QRS 波 (>120ms)，慢性心房震顫 (chronic atrial fibrillation)。實驗組 VS 對照組條件：對照組選擇沒有排除條件，無 心衰竭症狀，超音波顯示沒有心臟舒張功能不良證據者，同時根據性別，年齡(差 距五歲以內)，和實驗組做 1:2 的對照。群體二: 另外選擇 30 位加護病房(ICU)的

患者，在進入加護病房時，測量左心室的舒張功能，超音波的測量指標如上述， 心臟科最新的定義(Paulus, Tschope et al. 2007)。

測定血漿中的 TNF-α 及 IL-6

的病患，皆在沒有明顯感染，發炎反應的情況下接受抽血，經過 12hr 的禁食之 後，經由前臂靜脈抽血，經由標準程序分離離心之後，測定血漿中的 TNF-α 及 IL-6，

使用高敏感度的酵素免疫吸收法(high-sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，IL-6 選用 catalog no. HST600B; R & D Systems, Minneapolis, MN, USA 測定，TNF-α 選用 catalog no. HSTA00D; R & D Systems 測定。以 IL-6 為例，

最小偵測的範圍是 0.016 to 0.110 pg/mL，TNF-α 則是 0.038 to 0.191 pg/mL。整體的 偵測變異範圍試驗間，以及試驗外以 IL-6 為例是 6.5-9.6%及 6.9-7.8%，TNF-α 則

最小偵測的範圍是 0.016 to 0.110 pg/mL，TNF-α 則是 0.038 to 0.191 pg/mL。整體的 偵測變異範圍試驗間，以及試驗外以 IL-6 為例是 6.5-9.6%及 6.9-7.8%，TNF-α 則