第一章 緒論
第三節 鈣離子通道在心臟舒張功能不良的角色
在正常的心臟收縮的時候，鈣離子由 L-type calcium channel (LCC) 流入心肌細 胞中，便會促進心肌細胞內的 sarcoplasm 釋放儲存的鈣離子，釋放鈣離子的主要 通道蛋白是 ryanodine receptor (RyR2, the cardiac isoform of RyR)。鈣離子釋放的結 果會使細胞內鈣離子的濃度由 0.1–0.2 μM 提高至 2.0 – 10.0μM 大量的鈣離子 和肌小節(sarcomere)中肌動蛋白(actin)的 troponin complex 結合，actin 上面原本被 tropomyosin 抑制的活動區(active site)便暴露出來，可以和 ADP 結合，actin 滑動，
促使心肌細胞收縮(Lipskaia, Chemaly et al. 2010)。由上述機制可以發現，LCC 通道 以及 RYR2 的鈣離子通道和心肌的收縮功能會有明顯的相關。而當心肌細胞收縮 完畢，當心肌需要舒張的時候，此時鈣離子需要脫離原本結合的區塊，一開始的 步驟也是由 RYR2 鈣離子通道的關閉開始，鈣離子和 actin 分離，主要是回收到 sarcoplasm 內或者少部分鈣離子經由耗能反應直接通過 sodium-calcium channel (NCX channel)排出細胞外(約占所有鈣離子代謝的 25%)，回收至 sarcoplasm 的過程 需透過鈣離子幫浦(sarcoplasmic reticulum calcium channel pump 2, SERCA2)，大概
佔了 75%的鈣離子是由這個幫浦回收至 sarcoplasm 內。因此 SERCA2 對於細胞鈣 離子的穩定具有兩種主要功能: (1) 回復 sarcoplasmic 內的鈣離子儲存以供下次心 臟肌肉的收縮使用。(2) 回收鈣離子，讓心肌細胞可以舒張。因此由上述可知，
SERCA2 一開始的功能不良，可能影響心肌細胞的舒張功能，如果有進一步的功 能損壞，就有可能造成心肌細胞的收縮功能也產生了破壞(Bers 2008; Del Monte and Hajjar 2008; Kawase and Hajjar 2008)。最後，鈣離子系統也受到β-adrenergic 訊息傳遞系統的調控(βAR)，透過磷酸化 phospholamban 蛋白，可以解除這個蛋白 Giordano et al. 1997; Baker, Hashimoto et al. 1998; Vetter, Rehfeld et al. 2002)。相反的，
如果是基因剔除的老鼠，則可能會引起致命的病變，homozygous(-/-)的基因剔除老 鼠在早期發育的時候就會死亡(Periasamy, Reed et al. 1999)，如果是 hetrozygous (+/-) 的老鼠，會有 35%的 SERCA2 蛋白的減少，也會在成鼠之後產生心臟衰竭，以及
心肌細胞內鈣離子過多的現象。在心臟沒有明顯病變的情況之下，也會因為血行 動力的變化，而導致早期的心臟衰竭產生(Schultz Jel, Glascock et al. 2004)，這樣的 老鼠無論是收縮或者是舒張功能都產生明顯的缺損。SERCA2 對於舒張性心衰竭 的影響是在舒張功能不良最早期的影響因子。以第一型糖尿病鼠產生舒張性心衰 竭的模式為例(Basu, Oudit et al. 2009)，Basu et al 利用 Akita (Ins2WT/C96Y)轉殖基因鼠代 表第一型糖尿病患者併發舒張性心衰竭的機制。這樣的老鼠的心肌經切片顯示並 Heyen, Heymans et al. 2001)。依照過去所做的研究顯示，SERCA2 整體的質與量些 微的變化都可能引起早期舒張功能的改變，在動物模式顯示，經過長時間的 SERCA2 的數量減少，即使心肌沒有發生具體的病變，也可以造成舒張功能不良，
因此 SERCA2 蛋白的調控，實為影響及控制心臟舒張功能的決定步驟。
1.3.3 心肌細胞模式 SERCA2 的調控機制及初步研究結果
SERCA2 蛋白可能受到許多鈣離子幫浦相關蛋白的調控。近年來 ryanodine receptor 被指出可能和 SERCA2 結合成巨分子結構而調控鈣離子的回收，另外
Calreticulin 蛋白，也在胞內同時和 SERCA2 交互作用也和 S100A 結合影響到 SERCA2 的功能(Kiewitz, Acklin et al. 2003; Ihara, Kageyama et al. 2005)，最後，
phospholamban (PLN)蛋白及 sarcolipin 也被發現會和 SERCA2 在細胞質以及穿膜部 分的區塊作結合而能抑制 SERCA2 幫浦的作用(Asahi, Nakayama et al. 2003;
Bhupathy, Babu et al. 2007)。在此簡述最重要的調控蛋白 PLN 調控 SERCA2 的機制 如下: 在 1970s 年代起發現 SR (sarcoplasm) 的磷酸化可以調控 SERCA2 的功能，
後來發現被磷酸化的受體是 PLN 而非 SERCA2，PLN 可能受到 cAMP-dependent
protein kinase A or protein kinase C 的磷酸化(Kranias 1985)，PLN 依附在 SERCA2 受器上，一旦受到磷酸化就會聚合在一起形成 pentamer，原本 PLN 對於 SERCA2 的功能有抑制的作用，當磷酸化之後，鈣離子的通透就會增加(MacLennan, Kimura et al. 1998)。事實上許多 PLN 磷酸化相關的機制也與 SERCA2 的調控有密切的關 係，甚至 PLN 基因的突變，轉殖鼠都會影響到 SERCA2 的功能以及心肌細胞的收 縮力。而 PLN 主要的去磷酸化蛋白，Protein Phosphatase 1(PP1)(Carr, Schmidt et al.
2002)，如果是基因轉殖鼠具有加強能力的 PP1 就會引起 PLN 的去磷酸化，對於 SERCA2 的抑制能力就會增加，這一類的老鼠不僅是基礎的收縮力比較不好，受 到刺激時心臟的收縮力增幅也比較小。後續的研究也就串聯在這樣的機制上面進 行，heat-shock protein 20(HSP-20)，也被證明會調控 PLN-PP1 這樣的機轉，透過減 弱 PP1 的抑制能力，當過度表現 HSP -20 的功能時，心肌細胞的收縮力也會加強，
SERCA2 的功能也隨之而上升。最後談到 S100A1 蛋白(Remppis, Greten et al. 1996;
Kiewitz, Acklin et al. 2003)，這個蛋白是連結 PLN，SERCA2 的重要蛋白，也會受 到胞內的鈣離子濃度而影響表現，過去的研究也證明，如果天生缺乏 S100A1 的調 控，就會引發嚴重的心臟功能不良。上述的許多蛋白不僅是在心臟衰竭的研究上，
作為基因治療的一個基礎(Yamada, Ikeda et al. 2006; El-Armouche, Wittkopper et al.
2008)，同時也是引響心臟舒張功能很重要的一個機轉。由上述可知，SERCA2 可 以受到許多的蛋白所調控，當然也會直接受到些血清中的激素所影響，舉例來說，
在幼鼠心肌培養出的心肌細胞上，加入 angiotensin II，被證明可以抑制 SERCA2 的表現，可是在成鼠的心肌上卻不如此的明顯(Ju, Scammel-La Fleur et al. 1996)，
一些重要的發炎反應前驅物質如 tissue necrosis factor-alpha (TNF-α)，也在很早期就 證明可以影響到心肌細胞中 SERCA2 的表現(Kubota, Bounoutas et al. 2000)，甚至 之後的研究也發現，TNF-α 甚至可以透過 DNA 的修飾來影響 SERCA2 的功能以及 活性(Kao, Chen et al. 2010)。相同的 interleukin-6 (IL-6)是許多發炎反應機轉中的中 間作用媒介，也被發現可以透過對於促進子(promoter)的影響，使得 SERCA2 的表
現減少(Villegas, Villarreal et al. 2000)。為了解血清中的何種激素可以直接促使心肌 細胞中的 SERCA2 受到最大的影響，我們以 HL-1 心肌細胞為模式，進行了初步的 實驗，簡述如下。首先我們使用 HL-1 心肌細胞進行其他需要進行過渡性轉染的心 肌細胞實驗。由美國紐奧良路易西安那大學所取得的 HL-1 心房細胞株衍生自成年 小鼠心房組織 (Tsai-Claycomb et al., 1998)，可依製造商說明以使用 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)進行過渡性轉染實驗。根據 GFP 螢光顯示，轉染成功率為 60~80%。
細胞轉染後 24 小時，接著進行激素刺激與西方墨點分析等實驗。標準化的 luciferase 活性以雙 luciferase 報告者質體分析系統測量，並且用自動冷光儀讀取。SERCA2 的蛋白質濃度利用西方墨點分析，SERCA2 mRNA 的濃度直接用 real-time PCR 的 方式測定濃度。首先我們利用聚合酶連鎖反應複製一段 1754bp 老鼠 SERCA2 鈣離 子通道蛋白基因啟動子片段，在設計前引子及後置引子，把將近 1.8kb 的聚合酶連 鎖反應產物從 BglII 與 HindIII 切點次轉殖入 pGL3Basic 載體，再把這樣的載體轉 殖入 HL-1 心肌細胞，接著再用上述的各種激素來刺激。在初步的實驗當中 (Wu-JRAAS)，發現 Angiotensin II 並不會影響到心肌細胞中 SERCA2 的啟動子表 現，也不會影響到蛋白質的含量或者是 mRNA 的表現量。但相對的，如果是發炎 反應的物質，比如 TNF-α，IL-6 則對啟動子的功能有明顯的抑制作用。由上述的 初步實驗顯示，發炎反應前驅物質如 TNF-α 或者 IL-6 對於 HL-1 心肌細胞中
SERCA2 的量可能有明顯的抑制的作用，也可能透過這樣的機制，影響到心肌細
胞的舒張功能，合理的假設是這些激素可能透過訊息傳遞，影響到啟動子的表現，進而造成 SERCA2 的轉錄轉譯功能受到抑制，鈣離子通透減弱，心臟的舒張功能 也受到影響，透過藥物來阻斷這樣的訊息傳遞，或可以改善心臟的舒張功能。