左心室舒張功能不全之分子及臨床研究

國立臺灣大學醫學院臨床醫學研究所 博士論文

Graduate Institute of Clinical Medicine College of Medicine

National Taiwan University doctoral dissertation

左心室舒張功能不全之分子及臨床研究 Molecular Mechanisms and Clinical Studies of Left

Ventricular Diastolic Dysfunction 吳卓鍇

Cho-Kai Wu

指導教授：江福田教授 蔡佳醍副教授 Advisor: Fu-Tien Chiang, Professor

Chia-Ti Tsai, Associate Professor

中華民國 102 年 11 月

November, 2012

致謝

忙與協助。首先最感謝我的兩位恩師，江福田教授，這數年來從老師身上學到的 不僅只是做學問的方法以及嚴謹的態度，更能感受到老師的親切與對學生指導的 熱誠，開始做博士班研究時，不知從何下手，老師始終指引了整體的方向，使我 不致迷失，更努力支援讓我能回到台大醫院總院服務，安心順利的完成基礎與臨 床研究，在此要向老師表達無限的感激。蔡佳醍老師，在我剛畢業，對研究一無 所知時帶領我進入基礎研究的領域，其後一路指導我至今，讓我在博士班學習的 路上一路順遂，並且亦師亦友的和我討論工作生活上的種種困難，該當如何處理，

讓我獲益匪淺。感謝林俊立教授，對我心臟科的生涯規劃提供莫大的幫助。感謝 黃瑞仁老師，對於我臨床工作的指導，以及在雲林分院時期的照顧與鼓勵。另外，

特別感謝林昭維學長提供最重要的啟發與資料處理，教導我如何開始一項研究，

也感謝任光對於所有研究論文的分析，繪圖與經費協助。此外也要感謝助理林淑 君小姐、謝嘉珊小姐及林宜樺小姐在實驗技術方面的協助，沒有他們的幫忙，就 沒有我今日的成果。此外，更要感謝臨床所的老師們及諸位口試委員對論文的指 導與修正。

感謝曾春典教授，心臟科全體同仁對我的支持，有了景齡、富群、建鈞、勝南 這些好伙伴以及佳玲有求必應的支援，才能讓我安心的完成我的研究。

最後謹將這份論文獻給我的家人，將我含辛茹苦扶養長大的雙親，總是事事 包容並盡一切努力協助我的岳父岳母，以及在這幾年來一路陪著我，給予我生活 上所有支援與歡笑的摯愛，我的太太–尹岑，讓我忘卻一切煩惱的寶貝女兒–苡寧，

沒有妳們無怨無悔的付出與支持，我沒辦法渡過這數年。

目錄

目錄………..………..i

圖目錄……….……….iv

表目錄………vi

中文摘要………...viii

Abstract……….…...xi

縮寫對照表………xiv

第一章 緒論……….………..1

第一節 心衰竭的重要性...………….………1

第二節 正常收縮功能心衰竭與左心室舒張功能不全….……...……….1

第三節 鈣離子通道在心臟舒張功能不良的角色……..…....……….. 8

第四節 臨床族群中和 HFpEF 或左心室舒張功能相關的 biomarkers……….12

第五節 研究目的與假說………...………..……...…...17

第二章 研究方法及材料………...19

第一節 TNF-α 及 IL-6 可能透過 transcription level 的抑制，影響 SERCA2 的 表現………...………..………..19

第二節 探討 TNF-α 可能影響 SERCA2 的機轉(pathway)，是否直接影響心臟 舒張功能以及是否可以被藥物所反轉-細胞及動物實驗模式………..21

第三節 探討臨床 DHF 病患，加護病房嚴重發炎反應的病患，發炎反應物質 與心臟舒張功能的關係以及預後的影響………..……....……….24

第四節 一般族群中 subclinical inflammation 是否會影響左心室舒張功能的產 生，可能的機轉如何?...……….……….28

第五節 新的左心室纖維化標的- CTGF 和 DHF 的相關性以及可能影響機轉.31 第三章 研究結果……….………...…….34

第一節 TNF-α 及 IL-6 可能透過 transcription level 的抑制，影響 SERCA2

現……….………...………..……….34

第二節 探討 TNF-α 可能影響 SERCA2 的機轉(pathway)，是否直接影響心臟 舒張功能以及是否可以被藥物所反轉-細胞及動物實驗模式………..35

第三節 探討臨床 DHF 病患，加護病房嚴重發炎反應的病患，發炎反應物質 與心臟舒張功能的關係以及預後的影響………....…………...37

第四節 一般族群中 subclinical inflammation 是否會影響左心室舒張功能的產 生，可能的機轉如何?...…..……..39

第五節 新的左心室纖維化標的- CTGF 和 DHF 的相關性以及可能影響機 轉………...41

第四章 討論……….………44

第一節 TNF-α 及 IL-6 可能透過 transcription level 的抑制，影響 SERCA2 現……….………...………..……….44

第二節 探討 TNF-α 可能影響 SERCA2 的機轉(pathway)，是否直接影響心臟 舒張功能以及是否可以被藥物所反轉-細胞及動物實驗模式………..46

第三節 探討臨床 DHF 病患，加護病房嚴重發炎反應的病患，發炎反應物質 與心臟舒張功能的關係以及預後的影響………....…………...49

第四節 一般族群中 subclinical inflammation 是否會影響左心室舒張功能的產 生，可能的機轉如何?...…..……..52

第五節 新的左心室纖維化標的- CTGF 和 DHF 的相關性以及可能影響機 轉………...57

第五章 結論及展望…….………61

第六章 論文英文簡述….………66

第七章 參考文獻..….………74

第八章 圖表……….………85 第九章 附錄……….………133

圖 目 錄

圖 2-1 如何量測二尖瓣流入血流，E 波以及 A 波……….……....85

圖 2-2 診斷舒張性心衰竭的流程圖(2007 年歐洲心臟科學會共識)………….…...86

圖 2-3 預設體脂肪影響左心室舒張功能的結構方程模式圖..……….…87

圖 2-4 如何由心臟核磁共振造影 T1 量測細胞外體積…...………..…………88

圖 3-1 TNF-α 及 IL-6 在 HL-1 心肌細胞上，以轉錄調控的方式來減少 SERCA2 基 因的表現，影響促進子，mRNA，乃至於蛋白質濃度的整體表現………..….89

圖 3-2 HL-1 心肌細胞中的 TNF-α 及 IL-6 對 SERCA2 鈣離子通道電流的影響……90

圖 3-3 重症病患血清(PAT)相較於對照組(CTL)血清作用在 HL-1 心肌細胞上，對於 SERCA2 蛋白質濃度以及 mRNA 量的影響….………..…………..……91

圖 3-4 心肌細胞的 TNF-α 經由 SERCA2 基因啟動子區域中的 NF-κB 反應單元區來 調控 SERCA2 鈣離子通道的表現…..………...……92

圖 3-5 TNF-α 誘導的訊息傳遞子及轉錄活化子………...…93

圖 3-6 TNF-α 誘導的訊息傳遞子及轉錄活化子，經由 NF-κB 反應單元活化下游的 反應路徑，導致 NF-κB p65 次單元體轉化入細胞核中………..………..……94

圖 3-7 TNF-α 對 HL-1 心肌細胞中 SERCA2 鈣離子通道表現的影響受到 NF-κB 蛋 白抑制劑 PDTC 所阻斷………..………….………...………...……95

圖 3-8 TNF-α 對 HL-1 心肌細胞中 SERCA2 鈣離子通道表現的影響受到已知的 TNF-α 抑制劑，simvastatin 所阻斷………...………..……96

圖 3-9 TNF-α 經由 NF-κB 反應單元抑制 SERCA2 表現的路徑在動物實驗中因使用 simvastatin 所阻斷………...……….…97

圖 3-10 血漿中的 TNF-α 上升影響心臟的舒張功能路徑，在動物實驗中因使用 simvastatin 所阻斷………...…98

圖 3-11 整體模式圖顯示 TNF-α 抑制 SERCA2 表現同時導致心臟舒張功能不良的訊 息傳導方式..………...………99 圖 3-12 以純粹舒張性心衰竭病患為例，血漿中的 TNF-α 及 IL-6 和心臟超音波下，

各項心臟舒張功能指標的相關性..…………...………100 圖 3-13 以嚴重燒傷病患為例，血漿中的 TNF-α 及 IL-6 和心臟超音波下，各項心臟 舒張功能指標，以及燒傷面積的相關性..…...………101 圖 3-14 在嚴重燒傷的群體上，根據左心室舒張功能 Kaplan-Meier 圖…………...102 圖 3-15 以結構方程分析得到的機轉路徑模式圖..………..….………..……..…103 圖 3-16 在舒張性心衰竭病患上，血漿中 connetive tissue growth factor(CTGF)和心 臟超音波下，各項心臟舒張功能指標的相關性...……104 圖 3-17 心臟核磁共振造影下的細胞外體積(ECV)和血漿中的 connetive tissue growth factor(CTGF)相關性..………...……105 圖 3-18 舒張性心衰竭的動物模式與正常動物血行動力以及超音波型態的差異...106 圖 3-19 組織中 CTGF 和心臟舒張功能的相關性..………...…107 圖 3-20 拉力刺激心肌細胞後，觀察釋放到培養液中的 CTGF 濃度....………..…108

表 目 錄

表 一 群 體 一 中 實 驗 組 與 對 照 組 之 間 的 基 本 資 料 ， 超 音 波 型 態 與 血 清 中 的 激素濃度………..…………...109 表二 群體二加護病房嚴重病患的基本資料與血漿中激素濃度……….111 表三 群體三燒傷病患的基本資料以及血漿中的激素濃度……….113 表四 在群體二嚴重疾病病患轉入轉出加護病房前後的血漿中 Interleukin-6, tissue necrosis factor-alpha, 以及心臟超音波變化………115 表五 群體三燒傷病患轉出轉入加護病房前後的血漿中 Interleukin-6, tissue necrosis factor-alpha, 以及心臟超音波舒張功能指標………116 表六 以 Cox regression 模式分析影響燒傷病患住院死亡率的因素…………117 表七 群體一中實驗組與對照組的基本資料與心臟超音波資料………118 表八 群體二正常腎臟功能與腹膜透析病患的基本資料，心臟超音波資料與血漿中 的激素濃度 ……….………120 表九 Pearson bivariate 相關分析脂肪組織與臨床資料的相關性………122 表十 多變項迴歸分析決定和左心室舒張功能不良發生的相關因子…………123 表十一 根據結構方程做路徑分析………125 表 十 二 多 變 項 迴 歸 分 析 決 定 腹 膜 透 析 病 患 和 左 心 室 舒 張 功 能 不 良 發 生 的 相關因子………...126 表十三 將舒張性心衰竭(DHF)病患依照舒張功能的嚴重程度分組，條列 DHF 病患 以及對照組基本資料，血漿中的 CTGF 濃度………127 表 十 四 線 性 多 變 項 分 析 在 舒 張 性 心 衰 竭 病 患 中 影 響 心 臟 超 音 波 E / e



表十六 線性多變項分析在動物模式中影響心臟超音波 E/e數值的因素………132

中文摘要

本研究的目的，主要在於發炎反應物質(proinflammatory cytokines）和左心室舒張功 能不良(left ventricular diastolic dysfunction)發生的可能分子機轉。首先研究血漿中的蛋 白質對於舒張性心衰竭發生機制的影響，過去的研究顯示 SERCA2(sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase)是影響舒張性心衰竭生成最重要的鈣離子通道，過去的研 究也顯示 SERCA2 的功能跟質量都明顯的影響舒張性心衰竭的發生率。我們的初步 研究顯示，血漿中的 angiotensin II 對於 SERCA2 促進子(promoter)的影響程度不及 tissue necrosis factor (TNF-α)或者 interleukin-6 (IL-6)等前發炎反應物質，因此以心 肌細胞模式研究 TNF-α 或者 IL-6 影響 SERCA2 表現的訊息傳導模式。我們使用 HL-1 心肌細胞，複製促進子前 1754 苷基片段，藉由質體導入 HL-1 心肌細胞中，

接著分別研究 TNF-α 或者 IL-6 對於促進子的影響，直接刺激 HL-1 細胞對於 mRNA，

蛋白質總量的改變。結果發現 TNF-α 或者 IL-6 可以抑制 SERCA2 促進子的活性 乃至於 mRNA，蛋白質的量，甚至改變鈣離子通道回收鈣離子的能力(鈣離子電流 坡度變得平緩)。接著研究影響 SERCA2 最強的激素- TNF-α 可能抑制 SERCA2 的機制，同樣使用 HL-1 細胞，加入 TNF-α 後研究下游可能的機轉，結果首次發 現，TNF-α 藉由 Nuclear Factor-KappaB (NF-κB) 反應單元結合蛋白機轉抑制 SERCA2 基因的表現，同時進一步抑制左心室的舒張功能。我們同時也在動物模 式中驗證上述細胞模式所發現的機轉，以 lipopolysaccharide(LPS)刺激大鼠，引發 血漿中的 TNF-α 上升後上升後，同樣會經由上述的機轉使得大鼠的左心室舒張功 能變差，但使用 NF-κB 抑制劑-PDTC 或者 simvastatin 來抑制發炎反應卻可以在 細胞模式中使得此機轉阻斷，SERCA2 的量回升。同樣在動物模式下，利用口服 的 simvastatin 給予大鼠服用，抑制血漿中的 TNF-α 上升，對比對照組的老鼠發現，

經由抑制 NF-κB 反應單元結合蛋白機轉不僅使得 SERCA2 的量回升，也同樣可 以改善左心室的舒張功能不良。

臨床的研究上，也研究血漿中的前發炎反應物質如 TNF-α 或者 IL-6 上升和左 心室舒張功能各項指標的相關性。首先，我們研究血漿中的 TNF-α 或者 IL-6 和 心臟超音波下各項標準的評估左心室舒張功能的指標。第一個研究的群體是單純 舒張性心衰竭的病患，第二個群組則引入 30 位加護病房的病患同時具有左心室舒 張功能不全者。我們發現在單純舒張性心衰竭病患血漿中的 TNF-α 或者 IL-6 和 超音波下的左心室舒張功能指標有顯著的相關性(各項指標 P<0.01)，同時在嚴重的 病患血漿中的發炎反應指數上升，左心室舒張功能也明顯地變差，當病患狀況改 善時，發炎指數和左心室舒張功能也平行的發生改善。接著引入了極端發炎反應 的病患也就是 56 位嚴重燒傷的病患，在這樣的族群當中，發現不僅發炎指數更顯 著地和左心室舒張功能的超音波指標明顯的相關，同時經過迴歸分析校正之後，

左心室舒張功能在這樣的病患更是影響預後的一項獨立因子(HR = 3.99, p = 0.038)。

以上為住院病患具有高發炎反應的患者，為了評估一般族群中前發炎反應是否 與左心室舒張功能不全的發生有關，我們選擇臨床門診比較常見，血漿中可能前 發炎反應會較正常人高的族群，第一個族群選取了 102 位肥胖的族群，血漿中的 發炎指數顯著的上升，同時以斷層掃描定義內臟脂肪(visceral fat)的多寡，以心臟 超音波評估病患是否有左心室舒張功能不全。使用結構方程分析後發現，內臟脂 肪主要可以透過發炎反應的產生來導致左心室舒張功能不全的發生，而不是因為 脂肪滲透引起心臟功能不全的發生。另外一個族群則選取腹膜透析的病患，我們 比較發炎反應，腹膜透析，左心室舒張功能不全三者之間的關係，發現發炎反應 本身是和左心室舒張功能不全發生一項獨立的因子，腹膜透析也是和左心室舒張 功能不良發生一項顯著的相關因素，同時兩者有交互作用存在，此交互作用可以 額外的增加舒張性心臟功能不良發生的機會。最後，我們也研究新的血漿中和組 織纖維化相關的激素 conntective tissue growth factor (CTGF)，我們利用臨床上台灣

舒張性心衰竭群體資料，左心室肥厚的狗模式，心肌細胞模式三種不同的模式來 分析，第一次發現血漿中的 CTGF 和嚴重舒張性心衰竭的心臟超音波 E/E’有明顯 的相關性存在，另外以核磁共振(MRI)評估左心室的舒張功能也發現，心臟纖維化 的程度也和血漿中的 CTGF 明顯的相關，在動物模式上，組織的 CTGF 和心臟纖 維化的程度經過兩週後平行的上升了，同時 CTGF 的濃度和血壓的變動有顯著的 相關性存在，更是回歸分析後影響心臟舒張功能不良發生的獨立因素。

總結而言，本研究利用動物、細胞模式及基礎分生研究來證實前發炎反應物質 (TNF-α)和舒張性心衰竭發生的可能分子機轉，進而發現 simvastatin 可以阻斷 TNF-α 訊息傳遞，有治療舒張性心衰竭的效果，再不同程度的發炎反應病患身上 驗證了 TNF-α 等前發炎反應物質和左心室舒張功能指標的相關程度，並推論出 內臟脂肪，腹膜透析都可以透過發炎反應或者交互作用引起左心室的舒張功能不 全發生，另外也驗證了新的纖維化指標 CTGF 可以作為預估左心室舒張功能不全，

或者新的治療方法的依據。

Abstract

The aim of the present doctoral thesis is to investigate the molecular mechanism by which proinflammatory cytokines are involved in the pathegenesis of diastolic heart failure (DHF). We try to find the mechanism by which inflammatory cytokines

influence cardiac diastolic function. We realized that the sarcoplasmic reticulum Ca2+

ATPase (SERCA) is essential to the regulation of intracellular calcium levels in cardiac and is crutial for the development of DHF. Our pilot study reveal that Angiotensin II does not appear to exert an effect on SERCA2 levels in cardiomyocytes, but

pro-inflammatory cytokines such as tissue necrosis factor-alpha (TNF-α) or IL-6 have even greater effect over SERCA2 expression in cardiomyocyte models. Regarding TNF-α or IL-6 and SERCA2 signal transduction, we investigated whether TNF-α or IL-6 modulates SERCA2 calcium current through transcriptional regulation, using a HL-1 cells model. We cloned a 1754 bp promoter fragment of rat SERCA2 gene and amplified by polymerase chain reaction (PCR). We determined that TNF-α or IL-6 decreased SERCA2 mRNA, protein levels and SERCA2 promoter activities, which resulted in an attenuation calcium transient. Accordingly, in the following study, we explored the pathway of TNF-α on the transcriptional regulation of SERCA2

cardiomyocytes. We first found that TNF-α decreased SERCA2 gene expression and induced left ventricular (LV) diastolic dysfunction through Nuclear Factor-KappaB (NF-κB) Element–Binding Protein–Dependent Pathway. We also used an in vivo rat model of hyper-TNF-α to verify the results obtained in the cellular study. The upstream NF-κB dependent pathway was critical for TNF-α–induced decreased transcription of SERCA2 gene. The NF-κB blocker (PDTC) and pre-incubation of simvastatin inhibited TNF-α–induced NF-κB dependent pathway and augmented expression of

SERCA2 gene which in turns lead to improvement of LV diastolic function in a in-vivo rat model of LPS injection.

Regarding clinical studies, to evaluate the association between cytokines (TNF-αor IL-6) and left ventricular dysfunction indices, first, we sought to assess plasma levels of IL-6 and TNF-α in patients with DHF, including critically ill patients. We included several goups of patients. The first group consisted of pure DHF patients, and the second group enrolled 30 consecutive patients with left ventricular diastolic dysfuction that were admitted to the intensive care units (ICUs). Significant correlations (p < .01 for each) were found for TNF-α, IL-6 and cardiac diastolic dysfunction indices.

Cytokine levels were also correlated with diastolic function in critical ill patients, and diastolic function improved significantly in association with decrease of cytokines. We later included 56 critically burned patients and we found that there was a significant correlation between LV diastolic dysfunction and in-hospital mortality in critically burned patients (HR = 3.99, p = 0.038) after risk factors adjusted. Regarding the patients in the general population with higher inflammatory status, we further included 2 other goups of patients to prove the above hypothesis. First we we included 102 obese adults. In this study, we found a significant association between LV diastolic

dysfunction and fat content as measured by CT. With the analysis, we verified that fat deposition acts mainly through inflammation to affect LV diastolic dysfunction and less by its own effect (e.g. fat infiltration of LV). We also tried to establish the association between inflammation and LV diastolic dysfunction in peritoneal dialysis (PD) and non-PD patients. We established that an interaction between PD and inflammation, especially TNF-α, was also shown to further aggravate LV diastolic dysfunction.

Finally, we investigated an emerging marker for tissue fibrosis, connective tissue

growth factor (CTGF) and its association with cardiac diastolic function using cellular and animal models and clinical human data. Significant correlation was found between plasma CTGF and E/e’in DHF patients. Severity of cardiac fibrosis evaluated by CMRI also correlated with CTGF. In the cell model, stretch increased secretion of CTGF from cardiomyocytes. In the canine model, myocardial tissue CTGF expression and fibrosis significantly increased after 2 weeks of aortic banding.

In conclusions, the present doctoral thesis combined animal, cell models and molecular studies to demonstrate how cytokines (including TNF-α, IL-6 and CTGF) are involved in the pathogeneses of cardiac fibrosis, SERCA2 regulation, which are important substrates of DHF. Current study also discovered that simvastatin could block TNF-αsignal transduction which could be beneficial for the treatment of DHF. By testing the association of TNF-α and LV diastolic dysfunction parameters in patients with different severities of DHF, we could conclude that both visceral fat, PD could interact with inflammation, which in turns, lead to the development of LV diastolic dysfunction. Finally, we provided evidence that CTGF could be a marker for LV diastolic dysfunction and also targets of treatment.

Abbreviations and Acronyms (縮寫)

HFpEF= heart failure with preserved systolic function DHF = diastolic heart failure

LVEF = left ventricular ejection fraction LVEDV = left ventricular end-diastolic volume

E/E’: E=early mitral valve flow velocity; E’= tissue Doppler early diastolic length NT-proBNP = N-terminal-probrain natriuretic peptide

LAVI = left atrium volume index LVMI= left ventricular mass index ACE= angiotensin converting enzyme ARB= angiotensin receptor blocker SHF = systolic heart failure

LCC = L-type calcium channel

RYR2 = the cardiac isoform of ryanodine receptor

SERCA2 = sarcoplasmic reticulum calcium channel pump 2 NCX = sodium-calcium channel

PLN = phospholamban

TNF-α =tissue necrosis factor-alpha IL-6 = interleukin-6

VLDL = very low-density lipoprotein) LDL= low-density lipoprotein

TG= triglyceride

HDL =high-density lipoprotein

CTGF = connective tissue growth factor

PDTC = ammonium pyrrolidinedithiocarbamate

ELISA = high-sensitivity enzyme-linked immunosorbent assays PD= peritoneal dialysis

第一章 緒論 (Introduction) – 背景與文獻回顧

第一節 心衰竭的重要性

心衰竭是各種心臟疾病的最終結果，像是瓣膜性心臟病和冠狀動脈疾病，病 情最後的結果，就是變成慢性心衰竭。不論是心臟收縮或是舒張的過程中出現異 常，都有可能造成心臟衰竭。根據統計，心衰竭的盛行率逐年的上升(McCullough, Philbin et al. 2002)，這樣的原因一部分是因為年齡組成的老化，另一部分則是因為 藥物治療的大進步(Weber, Brilla et al. 1993)。

美國 Framingham 研究指出，心衰竭不論是發生率或是盛行率都是隨著年齡的 上升而增加。經年齡校正過後，美國心衰竭的盛行率為男性每千人 24 人，女性則 為每千人 25 人(Hanatani, Yoshiyama et al. 1995)。在芬蘭，75-86 歲的老年，心衰竭 的盛行率為 8.2%。而在葡萄牙大於 25 歲的成年中，心衰竭的盛行率 4.36%(Goette, Staack et al. 2000)。在台灣，利用金山地區所進行的世代追蹤研究指出，心衰竭的 發生率為 5.5% (Huang, Chien et al. 2007)。而就發生率而言，美國 Framingham 研究 指出，經年齡校正過的心衰竭發生率為男生每年每千人 7.2 案例，女生則為 4.7 案 例。這發生率隨著年齡的上升而增加。在大於 75 歲以上的成年，發生率則為每千 人 40 案例。就死亡率而言，新診斷的心衰竭病人中，六個月的死亡率為

14%(Jeunemaitre, Soubrier et al. 1992)，因心衰竭住院的病人中，死亡率為 10%，而 這些病人一年的死亡率為 32%。以上的流行病學可知，心衰竭在現今的醫療環境 之下仍然是非常重要的一個疾病與衛生議題。

第二節 正常收縮功能心衰竭(heart failure with preserved systolic function)與 左心室舒張功能不全

1.2.1 正常收縮功能心衰竭定義及診斷

在心衰竭的病人中，有一部分的病人，他們心臟的收縮功能是正常的。這些

人早期被區分為舒張性心衰竭，目前新的名稱為正常收縮功能心衰竭(heart failure with preserved systolic function, HFpEF)。這些病人心臟的收縮力在超音波的測量下 和一般族群差不多，所以稱為正常收縮功能，但臨床上卻有心衰竭的症狀，比如 肺水腫發作，腳腫，氣促等符合 Framingham criteria 定義的心衰竭。這類的病人往 往左心室的舒張功能是不正常，也往往因為長期心臟舒張功能不全，導致水分無 法回流至左心房，左心室內，導致左心房終端壓力上升而最終表現心衰竭的症狀。

在這樣的病患引起心臟舒張功能不全機制很多，過去認為最有可能的原因便是糖 尿病，高血壓和動脈硬化。糖尿病及高血壓都可以導致動脈及心肌的硬化，血管 壁因為高血壓之張力而受損，也可能因血糖高造成糖化代謝物的堆積，進一步纖 維化，最終的結果就是動脈硬化，而動脈硬化可能藉由壓力的反彈，造成心臟後 負荷的上升，增加心肌細胞的氧氣需求，並同時減少舒張時流入冠狀動脈的血流，

最終造成了心臟舒張功能的惡化。如果仔細探究其病理機制，最主要可以分為四 大類包括一、心肌舒張不良(impaired relaxation)，二、增加心肌硬化 (increased passive stiffness)，三、心包膜疾病 (pericardial disease)，心肌疾病 (endocardial disease)，以及四、神經賀爾蒙的影響 (neurohormonal regulation)(Angeja and Grossman 2003)。在診斷方面，舒張性心衰竭的診斷基本上包含了 1.正常或輕度異 常的左心室收縮功能，2.臨床上心衰竭的表現或症狀，3.左心室舒張功能不良的證 據。目前已有研究指出，隨著人口逐漸老化，目前約有接近百分之五十的心臟衰 竭患者皆屬於”相對”正常收縮功能(relatively preserved systolic left ventricular

function)之心臟衰竭，而且此類病患跟收縮性心臟衰竭相比並不會有較佳的預後。

近年來，由於新藥物的開發，使得收縮性心衰竭的預後有了明顯的改善，但是因 為針對正常收縮功能之心臟衰竭的藥物發展上並沒有顯著的突破，所以預後在近 年來也沒有顯著的改善。至於何謂超音波下心臟的收縮功能不良? 在 2001 年的美 國心臟科學院及學會規範 (American College of Cardiology/American Heart

Association guideline)對於舒張性心衰竭的定義是：有明顯的心臟衰竭症狀，同時

有正常的左心室射出率 (left ventricular ejection fraction, LVEF)，且在超音波檢查下 沒有明顯的瓣膜疾病，再加上有左心室舒張不良的證據三樣條件。歐洲的團體則 認為在超音波下有左心室舒張，填充不良的證據則可認定為明顯左心室舒張不良 的證據(1998)。至於在超音波的檢查上，美國超音波學會已訂立可以用二尖瓣的流 入血流型態 (mitral valve inflow E/A ratio)，流入血流的減速率 (deceleration time)，

組織都卜勒的型態 (tissue Doppler Em/Am)，肺靜脈流入血流的都卜勒型態 (Pulmonary vein inflow S/D/A flow pattern)(Reich, Duncan et al. 2003)，來作為病人有 舒張性障礙的標準。根據最新對於舒張性心衰竭的定義，在 2007 年歐洲心臟學會 指引中對 HFpEF 的診斷定義做了新的調整，在診斷 HFpEF 上整合了 LVEF，left ventricular end-diastolic volume (LVEDV), 左心室舒張功能指標，左心室肥厚，左 心房大小，以及血中的 natriuretic peptides 等，而訂立出新的診斷流程圖(Takahashi, Murakami et al. 2000; Dickstein, Cohen-Solal et al. 2008)。大體而言，正常的左心室 的射出分率(LVEF)是指大於 50%或者左心室舒張末期容積指數(LVEDV index <97 ml/m2)被視為正常左心室功能的臨界指標。測量 LVEDV 常常會過度計算，所以需 依照美國超音波或者歐洲超音波學會的準則小心測量。另外在測量 LVEF 上，並不 需要在診斷心衰竭的 72 小時內做測量，在 HFpEF 的病患，LVEF 以及左心室的大 小，大體上不會因為急性症狀而有所改變。歐洲心臟學會指引中，對舒張功能不 全的測量，提供了更客觀的量測方法。在侵入性的檢查方面，包括測量肺部微血 管的 wedge pressure >12 mmHg，左心室末舒張壓(Left ventricular end diastolic pressure >16 mmHg)，左心室舒張的時間常數(τ>48ms)，左心室硬化係數 (b > 0.27) 等。而在非侵入性的檢查，目前首推心肌的組織都卜勒(tissue doppler，E/E’ >

15)(E=early mitral valve flow velocity; E’= tissue Doppler early diastolic lengthening velocity)，如果 E/E’在 8~15 之間時，需要加上其他超音波的客觀標準如下：1. 二 尖瓣血流都卜勒(病患 50 歲以上，E/A 比值<0.5，deceleration time > 280 ms)或肺靜 脈血流 (Ard-Ad >30 ms) (Ard: duration of atrial reverse pulmonary vein flow velocity;

Ad: duration of atrial mitral valve flow velocity)。 2. 以超音波量測左心房體積係數 上升(Left atrial volumn index >40 ml/m2)或左心室質量係數(Left ventricular mass index:女性大於 122 g/m2; 男性>149 g/m2) 。 3. 心電圖顯示為心房震顫。 4. 血 清中 brain natriuretic peptide (BNP)或 N-terminal-proBNP (NT-proBNP)上升。除此之 外，由於 HFpEF 的診斷偽陽性較高，所以新的 guideline 也提供了排除 HFpEF 的 流程圖(圖 1-2)，如果病患僅只是呼吸困難，但是血液中的 BNP<100 pg/ml 或 NT-proBNP<120 pg/ml，心衰竭的診斷，便因為 BNP 具有高度的陰性預測值而可 以排除。另外如果病患的心臟收縮功能正常，LVED volume index <76 ml/m2，病 患並沒有心房震顫，沒有左心房擴大(left atrium volume index, LAVI <29 ml/m2)，

沒有左心室肥大(left ventricular mass index, LVMI: female <96 g/m2; male <116 g/m2)，同時 tissue Doppler shortening velocity > 6.5 cm/s 且 E/E’ >8，基本上 HFpEF 的診斷便可以排除(如圖 1-2)。總而言之，綜合目前現行的規範，舒張性心衰竭的 公認的指標為，臨床上有明顯心衰竭的症狀，加上正常的左心室射出率，沒有其 他瓣膜或者心包膜疾病，加上超音波可證明有舒張功能不全的證據便可以診斷病 人為舒張性心衰竭(Takahashi, Murakami et al. 2000; Dickstein, Cohen-Solal et al.

2008)。

1.2.2 HFpEF 治療的瓶頸與目前藥物治療的臨床研究結果

過去 20 年當中，收縮性心衰竭的預後因為使用藥物的關係而有了長足的進展。

但是舒張性心衰竭，相對的，即使使用相同的藥物，卻並沒有在預後方面有明顯 的進步。在著名的 CHARM-Alternative study，以及最近的 I-PRESERVE 研究(Massie, Carson et al. 2008)都發現在 HFpEF 及對照組身上同時使用 angiotensin receptor blocker (ARB)並不會影響預後，這樣的結果和收縮性心衰竭有很大的差異，原因 可能在於心肌的再塑(remodeling)以及訊息傳遞在兩者是不同的。收縮性心衰竭 (SHF)的病患在心肌的再塑通常是偏心圓(eccentric)，同時低 LV 質量容積比 (mass/volume)，但 HFpEF 則是同心圓式(concentric)的心肌再塑，而有高的 LV 質

量容積比。而心肌細胞在 SHF 會失去心肌微束(microfilaments)，而在 HFpEF，卻 是以心肌肥大來表現。接下來討論各種藥物的使用在兩種不同心衰竭(systolic heart failure, SHF VS HFpEF or DHF) 的差別。

在血管收縮素轉化酵素抑制劑 (angiotensin converting enzyme inhibitor, ACE inhibitor)應用於心肌梗塞後病患的研究上，PREAMI trial 研究的對象是: LVEF>40%，

NYHA class I-II 的病患，結果發現，病患使用 8 mg 的 perindopril 後可以減少 eccentric LV 的再塑。但是這樣的結果卻沒有辦法應用在一般 HFpEF 的病患，因為 其心肌是 concentric 的再塑(van Heerebeek, Borbely et al. 2006)。另外由 Aronow 所 做的研究發現，enalapril 應用於 AMI 後，LVEF>50%的病患，相較於

hydralazine+isosorbide dinitrate 的組合可以有效的改善死亡率，但同樣的，藥物施 用的族群仍然是以 eccentric LV 再塑為主的族群 (a cardiothoracic ratio >0.55 or an echocardiographic LV end-diastolic dimension index >2.7 cm/m2)。PEP-CHF study，

則是第一個針對 DHF 的 ACE inhibitor 隨機對照研究(Dickstein, Cohen-Solal et al.

2008)。研究的對象是以年紀在 70 歲以上，LVEF>40%，心臟超音波下發現 LA 擴 大，LV 肥大，或者 mitral flow Doppler velocity 異常的心衰竭病患，結果發現在死 亡率及住院率都沒有明顯的差異。同樣的 OPTIMISE-HF registry(包括 76%高血壓 以及 62%女性病患)，也發現在 DHF 的族群出院後使用 ACE inhibitors 對於病患在 60-90 天的再住院率並沒有明顯的差異。在香港所做的 DHF 研究設計和之前的研 究不一樣，研究的對象分為 1. 僅使用利尿劑，2. 使用利尿劑加上 ramipril，3. 利 尿劑加上 irbesartan，結果發現三組的住院率及運動耐受力的改變是沒有差異的，

但是發現加用 ACE inhibitor or ARB 的族群，有比較低的 NT-proBNP 的數值，同時 以心臟超音波追蹤的研究也發現，mitral annular velocity 的 S (systolic)及 E’ (early diastolic)都上升。最後在 ALLHAT trial 當中(Davis, Kostis et al. 2008)，發現 chlorthalidone 相較於 lisinopril 可以減少新發生 DHF 的機會，但是對於 SHF 的新 發生率，兩者的效果卻是差不多的。目前的假設是。當病患處於前症狀期

(presymptomatic)，心肌的再塑已由不同的基因決定不同疾病(DHF or SHF)的變化 以及表現，這樣的假設，和目前我們初步對於 DHF 的特定基因發現是不謀而合的。

在 ARB 的研究上更為多采多姿。在一項以心臟超音波下 LV 舒張功能不良同時 運動時血壓上升的病患為對象的研究上(mitral flow velocity Doppler evidence of diastolic LV dysfunction)，Losartan 相較於安慰劑或者 hydrochlorothiazide 可以改善 運動的耐受性，以及生活品質。但不同的，valsartan 對於高血壓以及心臟超音波 下心臟舒張功能異常(TDI evidence of diastolic LV dysfunction)的族群研究卻發現，

valsartan 相較於其他的降血壓藥物，並沒有辦法改善 TDI 下的 E’ (early diastolic mitral annular lengthening velocity)值。第一個大規模針對 DHF 族群使用 ARB 的預 後以及心衰竭住院率的研究首推 CHARM-preserved trial，蒐羅了 3023 個 DHF 的 病患分別使用 candesartan 以及安慰劑，結果雖然發現使用 ARB 的族群可以減少心 血管疾病死亡率以及心衰竭住院的機會，可是所參與研究的族群 56%是以缺血性 心血管疾病為主，只有 23%是由高血壓引起 DHF，且男性佔了大部分，和傳統認 知的 DHF 仍有很大的差異。以心臟超音波的結果來分析，在 CHARM-preserved 所 蒐集的病患 LV mass /LV volume 的比率為 1.4，和正常族群的 1.3 相去不遠，可是 和 DHF 定義的 1.7 倍卻有很大的差異。至於 Irbesartan 則在 I-PERSERVE trail 以及 Hong Kong diastolic heart failure study 作為和安慰劑對照的用藥。結果發現

irbesartan 並不能改善 DHF 的住院率。I-PERSERVE 的研究對象是女性為主(60%)，

高血壓佔多數(88%)，同時超音波的研究也發現左心室肥大(30%)，和一般認知的 DHF 較為接近。

相對於 ACE inhibitor 及 ARB，更少的有力證據支持乙型阻斷劑(β-blocker)在 DHF 病患上的使用。一項由 Dobre 等作者所做的 registry 研究上，針對心肌梗塞後，但 心臟收縮功能正常的病患，發現乙型阻斷劑約可減少 43%的死亡率，但是同樣的，

這樣的族群心肌的 remodeling 是以 eccentric 為主，和 DHF 所認知的 concentric 變 化有所不同。針對典型 HFpEF 病患較有代表性的研究如 SWEDIC trial 是以超音波

的 wall motion score 來排除可能因為心肌梗塞造成的 dyskinetic 變化，同時也以年 齡來校正 mitral or pulmonary venous flow velocity Doppler。謹慎的將典型 HFpEF 的病患挑選出來後，分成以 carvedilol 治療六個月的族群和對照組做比較，結果發 現無論是症狀，或者超音波下的 diastolic indices 都沒有改善。

其他的藥物如 aldosterone antagonist，毛地黃以及鈣離子阻斷劑都被應用於評估 對 HFpEF 的治療效果。在小規模使用 spironolactone 對於 DHF 病患的研究上，每 天使用 25 mg 的藥物，似乎可以改善左心室後壁的厚度，左心房的容積和 strain，

strain rate 等舒張功能指數，但是對於臨床上運動功能並沒有顯著的改善，大規模 的隨機試驗仍在進行當中。針對 digoxin 和竇性心率的心衰竭病患研究當中，無論 是 SHF 或是 DHF，digoxin 都可以改善住院率，但都不會改善整體的死亡率。另外 鈣離子阻斷劑(verapamil)，則被報導過在肥厚性心肌病變的病患上，可以改善左心 室的收縮率以及舒張功能。最後，初步的研究顯示 statin 的治療對於 DHF 的預後 是有利的(Fukuta, Sane et al. 2005)。Statin 的使用有助於左心室肥厚的改善，減少心 肌纖維化，在 DHF 病患上使用，可以明顯的減少死亡率，而在同樣的族群分析上，

無論是 ACE inhibitor，ARB，乙型阻斷劑，或是鈣離子阻斷劑都沒有辦法改善整 體死亡率。Statin 對於 SHF 病患的治療在 CORONA trial 中顯示是沒有明顯效果的。

但是相反的對於治療 DHF 或是 HFpEF 的病患，卻似乎有實質上的助益。這樣的 結果可用以下的機制來解釋：DHF 和 SHF 無論是心肌結構，或者功能上的變化是 不一樣的，DHF 主要是以心肌肥厚，心肌硬化增加，抑或是血糖轉化成 free fatty acid 出現異常為主。綜合上述的文獻回顧以及過去的研究可以發現，由於 HFpEF 相對 傳統心衰竭是新興卻盛行率高，影響健康經濟重大的疾病，由於對於疾病機制的 了解到近年來才有共識，因此診斷的原則也在近年的 guideline 才有一致的準則，

過去大規模的臨床試驗很少(僅只有 3~4 個)，而且這些臨床試驗對於 HFpEF 的定 義也不符合最新歐洲指引的定義，也因為這些的限制，使得目前的臨床研究沒有 具體的發現對於 HFpEF 確定有好處而且是一定須要使用的藥物。在 2012 年美國

心臟學會的 guideline 針對 HFpEF 的建議上，class I 的處理準則只包括合理的控制 血壓血糖，以利尿劑處理病患 fluid overload 的症狀，避免生活的危險因子(高鹽，

高血脂)等，主要的限制便是缺乏正確診斷，大規模，長期的臨床追蹤研究。總結 而言，上述許許多多的藥物研究以及臨床試驗發現，HFpEF 的病患目前並沒有一 個有效的藥物如同一般的心衰竭一樣，可以確定的改善病患的預後，因為這是一 個特殊的疾病，目前對於其機制了解的依然有限，正確的診斷標準也是在近年來 才比較確立，所以過去並沒有依照正確診斷所做的長期追蹤研究。初步的研究結 果看來，似乎依然是 ACE inhibitor/ARB 類的藥物，以及 statin 類的藥物對於這個 疾病的長期預後是有幫助的。

第三節 鈣離子通道在心臟舒張功能不良的角色 1.3.1 分子機制，鈣離子通道以及心臟功能

在正常的心臟收縮的時候，鈣離子由 L-type calcium channel (LCC) 流入心肌細 胞中，便會促進心肌細胞內的 sarcoplasm 釋放儲存的鈣離子，釋放鈣離子的主要 通道蛋白是 ryanodine receptor (RyR2, the cardiac isoform of RyR)。鈣離子釋放的結 果會使細胞內鈣離子的濃度由 0.1–0.2 μM 提高至 2.0 – 10.0μM 大量的鈣離子 和肌小節(sarcomere)中肌動蛋白(actin)的 troponin complex 結合，actin 上面原本被 tropomyosin 抑制的活動區(active site)便暴露出來，可以和 ADP 結合，actin 滑動，

促使心肌細胞收縮(Lipskaia, Chemaly et al. 2010)。由上述機制可以發現，LCC 通道 以及 RYR2 的鈣離子通道和心肌的收縮功能會有明顯的相關。而當心肌細胞收縮 完畢，當心肌需要舒張的時候，此時鈣離子需要脫離原本結合的區塊，一開始的 步驟也是由 RYR2 鈣離子通道的關閉開始，鈣離子和 actin 分離，主要是回收到 sarcoplasm 內或者少部分鈣離子經由耗能反應直接通過 sodium-calcium channel (NCX channel)排出細胞外(約占所有鈣離子代謝的 25%)，回收至 sarcoplasm 的過程 需透過鈣離子幫浦(sarcoplasmic reticulum calcium channel pump 2, SERCA2)，大概

佔了 75%的鈣離子是由這個幫浦回收至 sarcoplasm 內。因此 SERCA2 對於細胞鈣 離子的穩定具有兩種主要功能: (1) 回復 sarcoplasmic 內的鈣離子儲存以供下次心 臟肌肉的收縮使用。(2) 回收鈣離子，讓心肌細胞可以舒張。因此由上述可知，

SERCA2 一開始的功能不良，可能影響心肌細胞的舒張功能，如果有進一步的功 能損壞，就有可能造成心肌細胞的收縮功能也產生了破壞(Bers 2008; Del Monte and Hajjar 2008; Kawase and Hajjar 2008)。最後，鈣離子系統也受到β-adrenergic 訊息傳遞系統的調控(βAR)，透過磷酸化 phospholamban 蛋白，可以解除這個蛋白 對於 SERCA2 的抑制，並加速鈣離子的回收代謝。在緊急狀況或者是慢性心衰竭 時，βAR 會受到刺激，引起下游的 adenylate cyclase 活化，再加強 LCC 或者是 RYR2 等鈣離子通道的反應。如果是慢性心衰竭的長期刺激之下，久而久之，細胞 內的鈣離子濃度便會上升，相對的鈣離子濃度受到刺激的強度變化就會下降，引 起刺激-反應的不協調，也就會引起心肌細胞的功能產生不良的變化。在上述的機 制當中，和心臟的舒張功能最相關的便是 SERCA2 的鈣離子通道。SERCA 有三種 不同的 isoform，由三種不同的基因所轉錄，在轉錄的過程中經由不同的切割方式 形成不同種的 mRNA 片段，其中 SERCA2 基因是特定在心臟表現的基因，也和正 常心臟的功能有很大的關連性，特別是左心室的舒張功能。

1.3.2 文獻回顧 – SERCA2 及心臟舒張功能研究

SERCA2 鈣離子通道經由基因剔除或者高表現的老鼠實驗模型證明了作用，在 transgenic mice 的模型當中，心肌細胞中 SERCA2 的表現量是一般老鼠的 1.5~2 倍，

結果發現這樣的動物模型，無論收縮或者心臟舒張的能力都比起一般的老鼠來的 改善，同時也沒有發現其他的病灶，顯示高表現的 SERCA2 並不會引起併發症(He, Giordano et al. 1997; Baker, Hashimoto et al. 1998; Vetter, Rehfeld et al. 2002)。相反的，

如果是基因剔除的老鼠，則可能會引起致命的病變，homozygous(-/-)的基因剔除老 鼠在早期發育的時候就會死亡(Periasamy, Reed et al. 1999)，如果是 hetrozygous (+/-) 的老鼠，會有 35%的 SERCA2 蛋白的減少，也會在成鼠之後產生心臟衰竭，以及

心肌細胞內鈣離子過多的現象。在心臟沒有明顯病變的情況之下，也會因為血行 動力的變化，而導致早期的心臟衰竭產生(Schultz Jel, Glascock et al. 2004)，這樣的 老鼠無論是收縮或者是舒張功能都產生明顯的缺損。SERCA2 對於舒張性心衰竭 的影響是在舒張功能不良最早期的影響因子。以第一型糖尿病鼠產生舒張性心衰 竭的模式為例(Basu, Oudit et al. 2009)，Basu et al 利用 Akita (Ins2WT/C96Y)轉殖基因鼠代 表第一型糖尿病患者併發舒張性心衰竭的機制。這樣的老鼠的心肌經切片顯示並 沒有發生組織間的纖維化(interstitial fibrosis)，超音波觀察型態也發現，老鼠的心 肌並沒有肥厚，進一步染色做下游的分析發現，主要影響的是 SERCA2 蛋白的含 量，經由 Akt/PKB 的機轉影響到心肌細胞中 SERCA2 的含量，進而引起心臟的舒 張功能不良。更早的研究也發現，如果是組織中的 SERCA2 發生變性，被不良的 SERCA2 所取代，即使是蛋白的量是充足的也將會影響到整體心臟的舒張功能(Ver Heyen, Heymans et al. 2001)。依照過去所做的研究顯示，SERCA2 整體的質與量些 微的變化都可能引起早期舒張功能的改變，在動物模式顯示，經過長時間的 SERCA2 的數量減少，即使心肌沒有發生具體的病變，也可以造成舒張功能不良，

因此 SERCA2 蛋白的調控，實為影響及控制心臟舒張功能的決定步驟。

1.3.3 心肌細胞模式 SERCA2 的調控機制及初步研究結果

SERCA2 蛋白可能受到許多鈣離子幫浦相關蛋白的調控。近年來 ryanodine receptor 被指出可能和 SERCA2 結合成巨分子結構而調控鈣離子的回收，另外

Calreticulin 蛋白，也在胞內同時和 SERCA2 交互作用也和 S100A 結合影響到 SERCA2 的功能(Kiewitz, Acklin et al. 2003; Ihara, Kageyama et al. 2005)，最後，

phospholamban (PLN)蛋白及 sarcolipin 也被發現會和 SERCA2 在細胞質以及穿膜部 分的區塊作結合而能抑制 SERCA2 幫浦的作用(Asahi, Nakayama et al. 2003;

Bhupathy, Babu et al. 2007)。在此簡述最重要的調控蛋白 PLN 調控 SERCA2 的機制 如下: 在 1970s 年代起發現 SR (sarcoplasm) 的磷酸化可以調控 SERCA2 的功能，

後來發現被磷酸化的受體是 PLN 而非 SERCA2，PLN 可能受到 cAMP-dependent

protein kinase A or protein kinase C 的磷酸化(Kranias 1985)，PLN 依附在 SERCA2 受器上，一旦受到磷酸化就會聚合在一起形成 pentamer，原本 PLN 對於 SERCA2 的功能有抑制的作用，當磷酸化之後，鈣離子的通透就會增加(MacLennan, Kimura et al. 1998)。事實上許多 PLN 磷酸化相關的機制也與 SERCA2 的調控有密切的關 係，甚至 PLN 基因的突變，轉殖鼠都會影響到 SERCA2 的功能以及心肌細胞的收 縮力。而 PLN 主要的去磷酸化蛋白，Protein Phosphatase 1(PP1)(Carr, Schmidt et al.

2002)，如果是基因轉殖鼠具有加強能力的 PP1 就會引起 PLN 的去磷酸化，對於 SERCA2 的抑制能力就會增加，這一類的老鼠不僅是基礎的收縮力比較不好，受 到刺激時心臟的收縮力增幅也比較小。後續的研究也就串聯在這樣的機制上面進 行，heat-shock protein 20(HSP-20)，也被證明會調控 PLN-PP1 這樣的機轉，透過減 弱 PP1 的抑制能力，當過度表現 HSP -20 的功能時，心肌細胞的收縮力也會加強，

SERCA2 的功能也隨之而上升。最後談到 S100A1 蛋白(Remppis, Greten et al. 1996;

Kiewitz, Acklin et al. 2003)，這個蛋白是連結 PLN，SERCA2 的重要蛋白，也會受 到胞內的鈣離子濃度而影響表現，過去的研究也證明，如果天生缺乏 S100A1 的調 控，就會引發嚴重的心臟功能不良。上述的許多蛋白不僅是在心臟衰竭的研究上，

作為基因治療的一個基礎(Yamada, Ikeda et al. 2006; El-Armouche, Wittkopper et al.

2008)，同時也是引響心臟舒張功能很重要的一個機轉。由上述可知，SERCA2 可 以受到許多的蛋白所調控，當然也會直接受到些血清中的激素所影響，舉例來說，

在幼鼠心肌培養出的心肌細胞上，加入 angiotensin II，被證明可以抑制 SERCA2 的表現，可是在成鼠的心肌上卻不如此的明顯(Ju, Scammel-La Fleur et al. 1996)，

一些重要的發炎反應前驅物質如 tissue necrosis factor-alpha (TNF-α)，也在很早期就 證明可以影響到心肌細胞中 SERCA2 的表現(Kubota, Bounoutas et al. 2000)，甚至 之後的研究也發現，TNF-α 甚至可以透過 DNA 的修飾來影響 SERCA2 的功能以及 活性(Kao, Chen et al. 2010)。相同的 interleukin-6 (IL-6)是許多發炎反應機轉中的中 間作用媒介，也被發現可以透過對於促進子(promoter)的影響，使得 SERCA2 的表

現減少(Villegas, Villarreal et al. 2000)。為了解血清中的何種激素可以直接促使心肌 細胞中的 SERCA2 受到最大的影響，我們以 HL-1 心肌細胞為模式，進行了初步的 實驗，簡述如下。首先我們使用 HL-1 心肌細胞進行其他需要進行過渡性轉染的心 肌細胞實驗。由美國紐奧良路易西安那大學所取得的 HL-1 心房細胞株衍生自成年 小鼠心房組織 (Tsai-Claycomb et al., 1998)，可依製造商說明以使用 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)進行過渡性轉染實驗。根據 GFP 螢光顯示，轉染成功率為 60~80%。

細胞轉染後 24 小時，接著進行激素刺激與西方墨點分析等實驗。標準化的 luciferase 活性以雙 luciferase 報告者質體分析系統測量，並且用自動冷光儀讀取。SERCA2 的蛋白質濃度利用西方墨點分析，SERCA2 mRNA 的濃度直接用 real-time PCR 的 方式測定濃度。首先我們利用聚合酶連鎖反應複製一段 1754bp 老鼠 SERCA2 鈣離 子通道蛋白基因啟動子片段，在設計前引子及後置引子，把將近 1.8kb 的聚合酶連 鎖反應產物從 BglII 與 HindIII 切點次轉殖入 pGL3Basic 載體，再把這樣的載體轉 殖入 HL-1 心肌細胞，接著再用上述的各種激素來刺激。在初步的實驗當中 (Wu-JRAAS)，發現 Angiotensin II 並不會影響到心肌細胞中 SERCA2 的啟動子表 現，也不會影響到蛋白質的含量或者是 mRNA 的表現量。但相對的，如果是發炎 反應的物質，比如 TNF-α，IL-6 則對啟動子的功能有明顯的抑制作用。由上述的 初步實驗顯示，發炎反應前驅物質如 TNF-α 或者 IL-6 對於 HL-1 心肌細胞中

SERCA2 的量可能有明顯的抑制的作用，也可能透過這樣的機制，影響到心肌細

進而造成 SERCA2 的轉錄轉譯功能受到抑制，鈣離子通透減弱，心臟的舒張功能 也受到影響，透過藥物來阻斷這樣的訊息傳遞，或可以改善心臟的舒張功能。

第四節 臨床族群中和 HFpEF 或左心室舒張功能相關的 biomarkers 1.4.1 發炎反應物質與左心室舒張功能之關聯性

過去在心臟衰竭的研究方面，特別提到免疫發炎反應與心臟衰竭的治療可能相

關，過去的研究也顯示發炎反應物質可能影響心臟的收縮力，影響心室肥大，造 成心肌細胞的凋亡，甚至進一步影響左心室的重塑而進一步造成心衰竭的發生，

尤其系統循環的 IL-6 以及 TNF-α最受到重視。近年來的研究顯示，發炎反應物質，

包括 TNF-α and IL-6 都和心肌細胞的功能退化有關，也有研究顯示發炎反應物 質的濃度高低和心肌功能的退化程度，疾病的分期甚至是可以量化而互相比較的，

而濃度的高低和收縮性心衰竭的預後也是息息相關。這些激素的濃度高低可以經 由影響心肌的收縮力，細胞外間質的堆積而影響到心肌細胞的整體功能(Hirota, Yoshida et al. 1995; Krown, Page et al. 1996; Deswal, Petersen et al. 2001)。近年來一 項基因轉殖老鼠的實驗顯示，如果特別在心臟表現此類激素的功能，將造成早期 心肌細胞的肥大，同時整體的收縮功能也將在心臟擴大以後受到影響，但是在收 縮功能不良之前，激素(IL-6)過度表現的老鼠，首先表現的是心臟舒張出現了變化 (Haugen, Chen et al. 2007)。如同前述，發炎反應物質可能透過許多的機制影響心臟 舒張功能的不良表現，舉心肌細胞纖維化，鈣離子回收功能不良(主要影響

SERCA2)，抑或是活化心肌細胞的凋亡都是可能的機制。儘管如此，臨床是針對 DHF 以及血清中發炎反應激素濃度高低的研究卻是很有限的。舉例來說，一項小 規模的臨床研究發現(Kosmala, Derzhko et al. 2008)，如果病患是穩定型心絞痛的病 患(stable angina)，針對不同嚴重程度的冠狀動脈疾病病患，血清中的 TNF-α，IL-6 的濃度會和病患的左心室舒張功能有關，舒張功能不良的病患血清中的激素指數 較高，但是這個研究並沒有校正各項可能的干擾因子，也沒有去比較激素和舒張 功能各項指標的相關性。另外一個臨床研究是針對在心臟衰竭的病患上

(Chrysohoou, Pitsavos et al. 2009)，慢性發炎反應和左心室舒張功能的相關性研究，

結果發現如果是新診斷的心臟衰竭病患，其左心室的舒張功能指標，和慢性發炎 反應物質的濃度有顯著的相關。同樣的，這個研究是針對在特殊的族群，也是一 個小規模的研究，除此之外，在臨床的族群之中，沒有特殊疾病但發炎反應高的 族群便是體脂肪過高的族群，我們可以用胰島素阻抗性的產生來表達體脂肪過高，

或者肥胖所引發的病態生理機轉。由於胰島素本身可以抑制身體內脂肪組織分解 出游離性的脂肪酸(free fatty acid)，因此當胰島素阻抗性產生的時候，身體內 就會產生過多的游離性脂肪酸。過多的游離性脂肪酸不但會增加肝臟製造血糖的 程度，也會增加極低密度脂蛋白(VLDL, very low-density lipoprotein)、低密 度脂蛋白(LDL, low-density lipoprotein)以及三酸甘油酯(TG, triglyceride) 的濃度。但是體內高密度脂蛋白(HDL, high-density lipoprotein)的濃度卻是降 低的。也因此過多的游離性脂肪酸會增加動脈粥狀硬化(atherosclerosis)的形成。

另外游離性脂肪酸也會抑制肌肉組織儲存體內血糖的以及肝醣形成的功能，所以 當身體內有過多的血糖還有游離性脂肪酸的時候，胰臟就會增加胰島素的製造，

而產生高胰島素血症(hyperinsulinaemia)(Eckel, Grundy et al. 2005)。高胰 島素血症會導致交感神經的活化、內皮素-1(endothelin-1)的產生還有鈉離子的 再吸收(Kim, Montagnani et al. 2006)，所以這類型的患者常常會伴隨著高血壓 的產生。另外在脂肪組織分解出游離性脂肪酸的同時，脂肪組織也會產生特殊的 細胞激素，像是 TNF-α、IL-6 以及 PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) 等等(Kim, Montagnani et al. 2006)。這些細胞激素除了會增加身體內游離性脂 肪酸以及血糖的濃度外，也會增加肌肉組織對於胰島素的抗性。更要緊的是，這 些細胞激素會幫助肝臟產生血纖維蛋白原(fibrinogen)，使得患者的血管產生血 栓前期(prothrombic state)、血管發炎(vascular inflammation)以及血管內皮 不正常(endothelial dysfunction)的狀態，進而誘發血栓的形成而導致心血管疾 病的產生。所以說胰島素阻抗性會引起糖尿病、肥胖、高血脂以及高血壓並且引 起血管內皮不正常而誘發心血管疾病的產生，因此這個惡性循環是否會如上述透 過發炎反應進而引起左心室舒張功能的改變更是臨床是讓人感興趣的議題。總結 上述的研究，並沒有具體針對臨床上看到的舒張性心衰竭病患血清中的激素和各 種舒張功能指標的相關性研究，另外針對可能引起左心室舒張功能不良的臨床探 討也顯得不足，究竟在臨床的族群之中，發炎反應物質是不是能引起心臟舒張功

能不良的發生，或者只是伴隨出現的指標沒有辦法用現有的資訊回答。

1.4.2 和 DHF 相關新興的生物標記(biomarkers)

為了可以早期診斷 DHF，並且找出治療的標的，近年來血清中的生物標記成為 研究者所感興趣的指標。生物標記除了在過去研究可能引起心臟舒張功能不良的 RAS 系統激素，以及我們所感興趣的血清中的發炎反應物質外，還有一些新興的 指標可以作為後續研究的標的。舉例來說，Galectin-3，是由活化的巨嗜細胞分泌，

可以調節許多生物體上的功能，而導致心衰竭的產生(Yang, Rabinovich et al. 2008)。

過去的研究指出，無論是慢性或者急性心衰竭的病患，血清中的 Galectin-3 指數都 可能隨之上升。在 DHF 的研究上，近年來的研究發現，Galectin-3 和心臟的舒張 功能指標相關(van Kimmenade, Januzzi et al. 2006)，最近的研究也指出，Galectin-3 和 DHF 族群病患的預後也有明顯的關係(de Boer, Lok et al. 2011)，因此，這類的激 素也變為研究的基礎，甚至研發藥物的標的。另外，近年來備受強調和 DHF 相關 的生物標記便是 connective tissue growth factor(CTGF)，CTGF 被認為是一種分泌的 蛋白，身體中很多的組織受到刺激均會分泌，可以再刺激下游的細胞例如纖維母 細胞(fibroblasts)活化(Shi-Wen, Leask et al. 2008)。系統性的疾病血清中的 CTGF 往 往會隨之上升，比如再過去的研究之中發現，肝硬化的病患，血清中的 CTGF 和 纖維化的程度有明顯的正比關係，過去的研究顯示，CTGF 和心衰竭的重要指標 pro-BNP 有一個微妙的平衡關係，平時 pro-BNP 會和 CTGF 有相抗衡的作用，當 平衡存在時，CTGF 的分泌不至於過量，也不會引起系統的纖維化發生，可是當心 衰竭的症狀加劇時，比如說血行動力不穩定，高血壓無法控制的狀況下，或者 fluid overload 發生時，CTGF 便會活化，刺激心臟的纖維母細胞分泌下游的纖維化酵素，

刺激心臟的纖維化，進而導致心肌肥厚，舒張性的心臟病變(Koitabashi, Arai et al.

2007)。而臨床的研究也發現，舒張性心衰竭的病患，其組織中的 CTGF 染色的確 比對照組來的高的許多(Koitabashi, Arai et al. 2007)。由這樣的機轉可以發現，CTGF 在心臟的纖維化方面扮演了啟動的角色，也可能可以作為一個治療的目標。後續

的研究也發現使用 micro-RNA 來抑制 CTGF，的確可以使得心臟肥厚的程度改善，

也可以避免下游的心臟纖維化發生(Duisters, Tijsen et al. 2009)。因此除了一些血清 中的激素可能可以透過影響 SERCA2 等的鈣離子，迅速的影響到心臟的舒張功能 之外，DHF 的產生需要透過許多不同的機制，其中一項很重要的指標便是心臟纖 維化的程度，在影響心臟的纖維化方面，最上游可能影響的生物標記便是 CTGF，

但是血清中 CTGF 和纖維化程度的相關性，是否會受到血行動力的影響，和心臟 舒張功能程度的相關，這些重要的議題則沒有被探討過，闡述這些相關性可以幫 助我們了解是否可以用血清中的 CTGF 來找到早期的 DHF 病患，進而加以積極的 治療。

1.4.3 總結及研究展望

總結上述的各項敘述，DHF 的發生和 RAS 的基因多型性經過去的實驗證明在台 灣人的族群上有明顯的相關性，在心肌細胞的測試之上，發現對於影響 DHF 發生 最重要的鈣離子通道蛋白-SERCA2 的 promoter 功能影響最明顯的激素是 TNF-α、

IL-6 等發炎反應前期激素，臨床上血清中的 TNF-α、IL-6 是否和左心室的舒張功 能相關，過去鮮少有研究探討過。除此之外，可能影響 DHF 發生另外一個很重要 的因素就是心臟的纖維化，特別是 CTGF 這個生物標記的影響。

針對 DHF 病患或者左心室舒張功能不良的發生有幾個目前所未知，且是我們一 序列的研究之後所感興趣的議題。(1) 在基因的層面，RAS 基因多型性，過去我們 的研究指出可能和 DHF 的發生有相關性，這些基因多型性是否和疾病的預後有關，

甚至具有特殊 RAS 基因型的病患，對於 RAS 系統抑制劑的反應會不會較其他病患 不同。(2) TNF-α、IL-6 等發炎反應激素是透過甚麼樣的機制影響心肌細胞 SERCA2 的表現，是否會因此而改變心臟的舒張功能，利用藥物的作用來抑制這樣的發炎 反應激素，是否也可以阻斷這樣的機制，甚至改善心臟的舒張功能。(3) 臨床上 TNF-α、IL-6 這樣的發炎反應激素和舒張功能指標的相關性如何? 慢性發炎的病患，

如肥胖的族群，特殊洗腎的族群，是否也會因為這樣的機制使得心臟舒張功能不

良提早發生? (4) CTGF 被認為是心臟纖維化的指標，血清中的 CTGF 是否可代表 系統纖維化的程度，進而反應心臟的纖維化以及舒張功能衰退的程度。另外是否 血行動力的變化也將影響 CTGF 的變化?

第五節 研究目的與假說- 本博士班包括下列五大部分之研究:

研究一. TNF-α 及 IL-6 可能透過 transcription level 的抑制，影響 SERCA2 的表現

先前的研究發現，TNF-α 及 IL-6 等發炎反應物質似乎對於 SERCA2 的促進 子影響較強，因此本研究的目的希望測試不同濃度，不同時間點的發炎反應物質 激素對於 SERCA2 的促進子，mRNA，蛋白質的表現，決定影響的層面，同時也 測量鈣離子的電流經過激素作用後的影響，確定 SERCA2 的功能是否有所改變。

參考過去的間接證據，假設這些激素都可能透過 transcription level 直接影響 SERCA2 質與量的表現。

研究二. 探討 TNF-α 可能影響 SERCA2 的機轉(pathway)，是否直接影響心 臟舒張功能以及是否可以被藥物所反轉-細胞及動物實驗模式

初步的研究發現 TNF-α 對於促進子的影響最為明顯，本研究的目的在探討 TNF-α 可能影響促進子的機轉，並找到結合在促進子的作用位置(binding site)，了 解詳細的機轉可以幫助我們使用藥物來改變整體的機制，提升 SERCA2 的質與量，

進一步研究藥物是否可以改善心臟的舒張功能。研究的假設是 TNF-α 可能透過 NF-кB 或者活化 MAP kinase 等可能的機轉影響到 SERCA2 促進子的表現，透過 直接降低 TNF-α 的 level 或者阻斷可能的 pathway 均有可能提升心肌細胞的 SERCA2 含量，甚至可以改善心臟的舒張功能

研究三. 探討臨床 DHF 病患，加護病房嚴重發炎反應的病患，發炎反應物質 與心臟舒張功能的關係以及預後的影響

依循上述基礎的機制探討，本研究的目的希望探討實際臨床的 DHF 族群發炎

反應與各項心臟舒張功能的指標之間的相關性(心臟超音波下各項心臟舒張功能指 標)。觀察是否因為發炎反應上升，牽動臨床舒張功能的改變，也希望能收羅臨床 上高發炎反應的住院病患，包括加護病房(ICU)的病患治療前後心臟舒張功能的改 變，以及燒燙傷病房極高發炎指數的傷患心臟舒張功能是否為影響預後的獨立因 子。本研究亦假設心臟的各項舒張功能指標都會在高發炎反應的病患上呈現與發 炎指數更為相關的關係，同時經過治療後，心臟舒張功能也會得到改善，另外心 臟舒張功能更可能是影響病患預後的獨立因子。

研究四. 一般族群中 subclinical inflammation 是否會影響左心室舒張功能的 產生，可能的機轉如何?

推衍上述的機制到一般族群中，研究目的希望看到常見的發炎反應較高的一 般族群如體脂肪較高的族群，甚或是台灣常見的腹膜透析族群，已知發炎指數較 一般常人高，是否也會影響左心室的舒張功能產生。根據上述的假說，也會發現 發炎指數和左心室舒張功能之間的相關性，假說如下: 肥胖的病患可能因為體脂肪 引起發炎指數上升，腹膜透析病患則因為腹膜透析的長期刺激，引起兩者之間的 交互作用(interaction)，使得左心室舒張功能出現的機會因此而上升。

研究五. 新的左心室纖維化標的 CTGF 和 DHF 的相關性以及可能影響機轉 扣除掉鈣離子通道的影響，本研究的目的希望探討左心室纖維化的上游可能 影響因子，CTGF 在左心室舒張功能不良的細胞及動物模式是否明顯的上升，研究 在細胞模式中是否很敏感的受到拉力的影響，同時研究在動物模式是否很靈敏的 依存血行動力的變化而有改變。另外也希望在臨床的族群中觀察血清中的 CTGF 是否可以作為判斷早期左心室舒張功能不良的一個良好指標。研究假說是，CTGF 被發現可能為心肌細胞分泌並刺激下游的纖維化產生，因此極可能會是最早期受 到拉力因素，或者血壓上升影響心肌分泌的一個敏感的指標，在臨床族群也可能 看到血清中的 CTGF 和左心室舒張功能的各項指標有相關性，甚至組織纖維化的 程度也透過血清分泌的 CTGF 來表現。

第二章 研究方法及材料 (Materials and Methods)

第一節 TNF-α 及 IL-6 可能透過 transcription level 的抑制，影響 SERCA2 的表 現

HL-1 細胞培養與過渡性轉染

由於新生心臟心肌細胞的低轉染率 (約 10%)，我們使用 HL-1 心肌細胞進行其他需 要進行過渡性轉染的心肌細胞實驗。由美國紐奧良路易西安那大學所取得的 HL-1 細胞株衍生自成年小鼠心房組織(Claycomb, Lanson et al. 1998)，可依製造商說明以 使用 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) 進行過渡性轉染實驗，過去許多實驗已經證 明此細胞雖為心房組織取出，不過離子通道特性，蛋白質表現均可代表整體心臟 之功能(Tang, Tian et al. 2012)，故在本論文中以此細胞代表心臟細胞之舒張功能細 胞模式。根據 GFP 螢光顯示，轉染成功率為 60~80%。細胞轉染後 24 小時，接著 進行 Luciferase 融合質體嵌入與西方墨點分析等實驗。每 0.5μg luciferase 報告者質 體和0.5 μg pRL-TK 載體進行共轉染，pRL-TK 載體為當作內部控制。轉染後 24 小時將細胞進行下一步實驗。標準化的 luciferase 活性以雙 luciferase 報告者質體分 析系統測量，並且用自動冷光儀讀取。

建構 SERCA2 啟動子-Luciferase 融合質體

利用聚合酶連鎖反應複製一段 1754bp 老鼠 SERCA2 基因啟動子片段，使用根據已 發表的老鼠心肌細胞 ATPase, Ca++ transporting 基因序列 (GenBank accession number NW_047375)設計而來的前置引子與後置引子： (5’-

AGAGAGGTCATGACCTTC-3’ [-1720 to –1703] 與

把將近 1.8kb 的聚合酶連鎖反應產物從 BglII 與 HindIII 切點次轉殖入 pGL3Basic 載體(Tsai, Wang et al. 2007)。HL-1 的心肌細胞轉殖入SERCA2 啟動子-Luciferase 融 合質體或者是單純pGL3Basic 載體作為對照組。同時另一組 HL-1 細胞僅加入 pRL-TK 載體 (Promega Corporation)作為內對照組。確定轉殖成功之後，便加入不

同濃度的 TNF-α(50pg/mL, 500pg/mL, 5ng/mL, 50ng/mL)或者 IL-6(100pg/mL, 1ng/mL, 10ng/mL, 100ng/mL)刺激細胞達 24 小時，以冷光儀測定 Luciferase 的表現 量。

利用 Fluo-3 染料染色與共軛焦雷射掃描顯微鏡作細胞內鈣離子記錄

利用 Fluo3-AM 螢光染料來測量細胞內鈣離子濃度 [Ca2+]i。細胞在含有10 μM Fluo 3-AM、且以 dimethyl sulfoxide (最後濃度 0.1%) 與 pluronic F-127 (最後濃度

<0.025%)溶解的 DMEM 中放置 15 分鐘。然後，蓋玻片用標準細胞外溶液浸潤後 移至記錄盒。利用反式共軛焦雷射掃描顯微鏡 (LSM 510, Carl Zeiss, Jena, Germany) 來測量 Fluo-3 螢光。至於螢光激發，則使用 488-nm 波帶的氬雷射。使用 long-pass 過濾套組來記錄螢光放射。每 1.5 毫秒獲取線掃描影像。利用共軛焦設備的時間軟 體裝置來作影像處理。鈣離子量用 F/F0 來表示，F0 代表靜止態或舒張期的 Fluo-3 螢光；鈣離子濃度利用公式 C=Kd×R/(Kd/C0+1-R) (Chen et al., 1993)來計算，R 表 示 F/F0、Kd 表示(=1.1 μmol/L)細胞質內 Fluo-3 的解離常數、C0 (=150 nmol/L) 表 示靜止態的鈣離子量。實驗在 30±0.5 °C 進行。同樣加入便加入 TNF-α(5ng/mL) 或者 IL-6(10ng/mL)刺激細胞之後測定鈣離子通道的表現量。

RNA 萃取與實時定量反轉錄聚合酶連鎖反應

在 HL-1 細胞加入 TNF-α(5ng/mL)或者 IL-6(10ng/mL)刺激細胞 0,2,6,12 或者 24 小 時之後測定 SERCA2 的 mRNA 表現量。利用 TRIZOL 方法萃取細胞總 RNA，接 著用 RQ1 RNase-free Dnase 以及 M-MμLV transciptase with oligo-dT primers 來進行 反轉錄。利用 SYBR 綠色染料將單股 cDNA 擴增 (ABI-Prism 7900, Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA)。同時測定細胞內 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) mRNA 當作內控制組。對老鼠 SERCA2 而言，前置引子 為 5’-CCATCTGCTTGTCCATGTCACT-3’，後置引子為

5’-CAAATGGTTTAGGAAGCGGTTACT-3’。對 GAPDH而言，前置引子為

5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’，後置引子為5’-GATGCAGGGATGATGTTC-3’，