第 一 節 材 料
( 一 ) 細 胞 來 源
本 實 驗 使 用 人 類 淋 巴 母 細 胞 株 (human lymphoblastoid cell line ； TK6 ) ， 此 細 胞 株 購 自 新 竹 食 品 工 業 發 展 研 究 所 菌 種保存中心(CCRC 60107 )。
( 二 ) 藥 品
styrene oxide、R- phenyloxirane (R-styrene Oxdie) 與 S- phenyloxirane (S-styrene Oxide ) 購 自 Fluka 公 司 。 配 置 RPMI 1640 medium 粉 末 ( 美 國 Gibco BRL)，在 RPMI 1640 medium 中 加 入 Sodium Bicarbonate (NaHCO3)( 美 國 Sigma) 配 置 為 培 養 液，並 以 1N HC l 調 整 pH 值 為 7.2 ∼ 7.4，
分 裝 為 450 ml 置 於 4 ℃ 備 用 ， 使 用 前 加 入 penicillin ， streptomycin (P/S) ， 200mM L -Glutamine ， ( 美 國 Gibco BR ) 、 9 ％ Donor horse (HS) （ 英 國 Selborne Biological Services ） 與 1 ％ H EPES buff er ( 義 大 利 Biological industries)。 降 低 突 變 背 景 值 所 需 之 HAT supplement ( 40 μ M aminopterin ， 1.6 mM thymidine ， 10mM sodium hypoxanthine )、H T supplement ( 1.6 mM thymidine，10mM sodium hy poxanthine ) （ 美 國 Gibco BRL ） 與 2-Deoxycytidine( 美 國 Sigma ) 。 篩 選 h p r t 基 因 突 變 之 選 擇 性 試 劑 為 2- Amino -6- mercaptopurine 6- thioguanine
（ 6- TG ）， 篩 選 tk 基 因 突 變 之 選 擇 性 試 劑 為 Trifluorothymine deoxyriboside (TFT) (美國 Sigma)。
細 胞 計 數 所 需 之 染 劑 為 0.4% Trypan Blue Stain（ 美 國 Gibco BRL ）。 冷 凍 細 胞 所 需 之 sterile dimethyl-sulfoxide (DMSO) ( 美 國 Sigma) 。 細 胞 培 養 瓶 與 所 有 1 5 ml、 50ml 無 菌 試 管 ， 與 過 濾 RPMI 1640 medium 所 需 之 500 ml 無 菌 濾 杯 均 購 自 美 國 Corning 公 司 。 96 孔 平 底 培 養 盤 購 自 美 國 Costar 公司。
第 二 節 方 法
( 一 ) 細 胞 培 養
TK6 細 胞 株 利 用 含 有 9 ％ H S，1 ％ 的 L- Glutamine，1 % penicillin /streptomycin 及 1 ％ HEPES buffer 之 RPMI 1640 細 胞 培 養 液 培 養 ， 將 細 胞 株 置 於 含 有 5 ％ C O2 的 37
℃ 恆 溫 培 養 箱 內 培 養 ， 將 細 胞 培 養 在 1.5 ∼ 2.2 X105 cell/ml，每 天 更 換 細 胞 培 養 液，將 細 胞 維 持 在 對 數 生 長 期（ log phase）。
( 二 ) 細 胞 株 解 凍 與 保 存
1 .細 胞 解 凍
將 以 液 態 氮 保 存 之 細 胞 凍 乾 管 （ vial） 在 37℃ 水 浴 槽 中 回 溫 約 一 分 鐘 ， 使 它 溶 解 後 ， 將 細 胞 放 入 15ml 的 無 菌 試 管 中 ， 緩 慢 加 入 細 胞 培 養 液 ， 充 分 混 合 均 勻 後 以 200g 離 心 4 分 鐘 （ 1100 rpm）， 去 除 上 層 液 ， 再 加 入 細 胞 培 養 液 ， 並 使 用 pipet 將 離 心 後 所 剩 之 pellet 進 行 混 合 ， 混 合 後 取 出 放 入 25cm2 培養瓶中。
2 .細 胞 保 存
log phase 的 細 胞 以 200g 離 心 4 分 鐘 離 ， 去 除 上 層 液 後，加 入 含 有 12%之 無 菌 DMSO 之 細 胞 培 養 液，使用 pipet 進 行 混 合 ， 取 1ml 放 入 凍 乾 管 中 ， 迅 速 放 到 - 80℃ 冰 箱 中 進 行降溫，24 小時後再移至液態氮桶中保存。
( 三 ) 細 胞 計 數
利 用 血 球 計 數 器 計 數 之 ， 其 蓋 玻 片 重 量 將 樣 品 厚 度 壓 為：0.1mm ， 總 樣 品 體 積 為（ V）=1mm ×1mm ×0.1mm
= 0.1(mm)3
= 0.1(10-1cm)3
=10-4ml
所 計 數 之 細 胞 為 104 /ml。 依 不 同 細 胞 濃 度 調 整 所 計 數 之 格 數 ， 使 每 次 計 數 之 細 胞 均 在 100 ∼ 300 cell， 以 確 保 細 胞 計 數 之 精 確 性 。 取 培 養 瓶 中 之 細 胞 液 100μ l 放 到 well 中 ， 加 入 10 μ l 的 0.4% trypan blue stain 染 色 （ 美 國 Gibco BRL）， 以 100X 顯 微 鏡 ( OLYMPUS， IX- 70 ) 觀 察 ， 死 細 胞 之顏色為藍色，計數活細胞數。
( 四 ) 細 胞 毒 性 測 試
1 .未 處 理 組
SO 都 必 須 利 用 DMSO 配 置 成 不 同 的 濃 度 而 才 能 進 一 步 處 理 細 胞，因 此 未 處 理 組 之 細 胞 及 加 入 等 量 的 DMSO 試 劑 為 溶劑控制組（control）。
2 .相 對 細 胞 數 目 （relative cell number； RCN）
去 除 SO 的 細 胞 培 養 液 後 ， 每 天 計 算 其 細 胞 數 ， 並計 算
其 Td 值，若 Td 回 到 正 常 值 (14~18)， 則 處 理 組 累 計 細 胞 生 長 的 倍 數 /控 制 組 累 計 細 胞 生 長 的 倍 數，即 可 以 得 到 細 胞 相 對 毒性 RS％ 。
3 .細 胞 群 落 生 成 率 (plating efficiency； PE)
將 細 胞 經 CHAT 處 理 後 ， 分 別 處 理 SO、 R- SO 與 S- SO 並 將 蓋 子 旋 緊 ， 培 養 在 37℃ 的 培 養 箱 中 ， 經 24 小 時 後 ， 離 心 (200g， 4mins) 去 除 R - SO 與 S- SO， 並 以 10ml 之 RPMI medium 1640 進 行 清 洗 ， 再 離 心 (200g， 4min) ， 去 除 上 層 液，加 入 細 胞 培 養 液，將 細 胞 轉 置 在 75c m2的 培 養 瓶 中 培 養。
去 除 styrene oxide 的 細 胞 培 養 液 後，利 用 細 胞 培 養 液 進 行 連 續 稀 釋，將 細 胞 接 種 到 96 well 的 平 板 中，使 每 個 well 中 的 細 胞 數 控 制 在 2 或 4 cell （ 依 低 劑 量 暴 露 到 高 劑 量 ）， 經 12- 15 天 觀 察 細 胞 生 長 結 果 ， 可 以 計 算 出 細 胞 生 成 率 ， 將 處 理 組 之 細 胞 生 成 率 / 控 制 組 細 胞 生 成 率，即 可 得 到 細 胞 相 對 毒 性（relative survival；RS）
( 五 ) hprt 與 tk 基 因 突 變 率 測 試 (Liber and Thilly ， 1982，Skopek，1993）
取 Td 值 正 常 的 TK6 細 胞，加 入 CHAT(Deo xycytidine 、 HAT supplement 與 HT supplement) 之 培 養 基 後 ， 去 除 上 層 液 ( CHAT 之 成 分 ) ， 加 入 含 有 H T supplement 與 Deoxycytidine (CHT) 之 細 胞 培 養 液 ， 經 2 4 小 時 培 養 後 ( 3 7
℃ ， 5% CO2) 加 入 細 胞 培 養 液 ， 以 血 球 計 數 器 計 算 細 胞 每 天 增加之情況，以測得 Td 值。
以 細 胞 培 養 液 處 理 2∼ 3 天 內 ， 細 胞 之 td 值 必 須 在 正 常
範 圍 內 ( 表 示 細 胞 回 到 正 常 的 對 數 生 長 期 ) ， 在 此 時 進 行 細 胞 生 成 率 測 試 與 突 變 率 測 試 ， 即 可 得 知 細 胞 中 背 景 突 變 率 。細 胞 經 SO 處 理 24 小 時 ， 以 離 心 方 法 去 除 SO 後 ， 經 3~4 天 後 ， 將 細 胞 轉 植 到 96 well plate （ 2cell/well/150μ l 細 胞 培 養 液 ）中，置 於 5％ CO2，37℃ 恆 溫 培 養 相 中 培 養。經 12-15 天 培 養 ， 計 算 細 胞 生 長 結 果 ， 可 以 得 到 未 添 加 TFT 選 擇 性 試 劑 之 PE 。 另 外 將 細 胞 轉 植 到 96 well plate
（ 20000cell/well/150 μ l 細 胞 培 養 液 ） 中 ， 此 細 胞 培 養 液 中 含 有 1μ g/ ml Trifluorthymine deoxy- riboside (TFT) 之 選 擇 性 試 劑 ， 可 以 有 效 篩 選 tk-fast 基 因 突 變 率 ， 將 培 養 盤 置 於 5％ CO2， 37℃ 恆 溫 培 養 相 中 培 養 。 經 12- 15 天 培 養 ， 計 算 細 胞 生 長 結 果 ， 即 可 得 到 tk -fast 基 因 突 變 率 的 細 胞 突 變 率 ， 經 10 天 後 ， 再 加 入 1μ g/ ml TFT 之 選 擇 性 試 劑 ， 即 可得到 tk slow 基因突變率（附圖 4）。
利 用 上 述 之 方 法 ， 細 胞 以 SO 處理後，約 6∼ 7 天後，再 加 入 1μ g/ ml 6- TG 之 選 擇 性 試 劑 ， 即 可 得 到 TK6 細 胞 中 hprt 基因之突變率
( 六 ) 統 計 分 析 方 法
利用無母數分析（Wilcoxon signed rank test）方法分 析。