苯環氧乙烷光學異構物對人類淋巴母細胞致毒性與致突變性之研究; Cytotoxicity and Mutagenicity of Styrene Oxide Optical Isomers in Human Cultured Lymphoblastoid Cells

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(1)中國醫藥學院碩士論文（初稿）編號：IEH-1006. 苯環氧乙烷光學異構物對人類淋巴母細胞致毒性與致突變性之研究 Cytotoxicity and Mutagenicity of Styrene Oxide Optical Isomers in Human Cultured Lymphoblastoid Cells. 所. 別：環境醫學研究所. 指導教授：江素瑛、賴俊雄學. 生：賴珊湖. 學. 號： 8765006 中華民國八十九年六月.

(2) 目. 錄. 中文摘要 .......................................................................................................... 1 英文摘要 .......................................................................................................... 3 第一章前言 ................................................................................................... 5 第二章研究目的 ........................................................................................... 6 第三章文獻探討 ..................................................................................... 6 第一節苯乙烯 ............................................................................................ 6 第二節苯環氧乙烷 ................................................................................. 10 第三節苯環氧乙烷的光學異構物 ........................................................ 13 第四節 hprt 與 tk 基因 ........................................................................... 18 第四章材料與方法 ..................................................................................... 20 第一節材料 .............................................................................................. 20 第二節方法 .............................................................................................. 21 第五章結. 果 ............................................................................................. 25. 第一節 SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之毒性 ........................... 25 第二節 SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之致突變性 ................... 26 第六章討. 論 ............................................................................................. 28. 第一節 SO 與其光學異構物對 TK6 細胞之毒性 ............................... 28 第二節 SO 與 SO 不同光學異構物致突變性 ..................................... 29 第七章結論 ................................................................................................. 33 第八章參考資料 ......................................................................................... 34. i.

(3) 圖表目錄圖 1. 180μM SO 與 SO 光學異構物誘發 TK6 細胞 ...................... 42 圖 2 .以細胞相對存活率（RCN ）評估 SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之毒性 ..................................................................................... 43 圖 3. 以細胞群落形成能力（PE）評估 SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之毒性 ..................................................................................... 44 圖 4. SO 與 SO 光學異構物在 TK6 細胞誘發 hprt. 突變率 ......... 45. 圖 5. SO 與 SO 光學異構物在 TK6 細胞誘發 tk fast ..................... 46 圖 6. SO 與 SO 光學異構物對在 TK6 細胞誘發 tk total ................ 47 圖 7. SO 與 SO 光學異構物對在 TK6 細胞誘發 tk slow ................ 48. ii.

(4) 致. 謝. 在結婚生子，工作八年之後，能夠完全放棄工作，全心投入學業的人並不多，而我即是那幸運人之一。能夠完成學業最主要是來自先生的支持，雖然因學業與工作的關係，他不在我身邊，但是每次一遇到困難他必定幫我解決，雖然他的脾氣不是很好，但是真的要非常感謝他對我這兩年的體諒與支持。另外！我的兩個可愛的孩子，他們也能夠體諒媽媽陪他們的時間變少了，而且還不能打電動（因為媽媽要用電腦），七月一日即是電腦時間還給他們的日子，雖然他們有少許抱怨，但至少還很體諒。子瑄、禹心，媽媽畢業了！學習是無止盡的，這兩年學到很多，包括人與人之間的問題，技術上之學習。要感謝的人有一拖拉庫，要謝謝賴主任與職安系助教室，那兒常常是無法解決問題時的去處。謝謝江老師在實驗技術上之指導，讓我兩年來學到以前從未學過的技術，並常陪我熬夜到半夜 2、3 點。保萱謝謝你常常隨叫隨到，替我解決許多統計問題。還有謝謝陳昭玲教授，熱心幫我改英文摘要。最後要謝謝我的家人與 Mila 沒有他們替我接送孩子並照顧他們，使我無後顧之憂，沒有他們我想我無法如此順利完成學業。最後希望還在奮戰的老公，你也加油，2 年後我們等著你拿到博士學位。. iii.

(5) 中文摘要苯乙烯 (styrene) 為常用化工原料，在生物體內經由 cytochrome P- 450(CYP -450) 代謝成苯環氧乙烷 (styrene oxide；SO)，SO 具有兩種不同光學異構物 (R - SO 與 S- SO)。 SO 已被證實為動物致癌物，在許多生物系統中可以誘發細胞毒性與突變性，然而目前仍不清楚 R - SO 或 S- SO 何者扮演較重要的角色。本研究之目的是研究 SO 與其光學異構物在人類淋巴母細胞 (human lymphoblastoid cell；TK6)之相對致細胞毒性與致突變性。細胞經不同濃度的 SO 與 SO 其光學異構物處理 24 小時後，藉著測量細胞恢復正常生長所需時間 (growth delay) 與細胞群落形成能力 (plating effecticiency ; PE) ，來探討 SO 與其不同光學異構物之相對細胞毒性。結果顯示 SO 與其光學異構物所誘發的細胞毒性會隨著劑量的增加而增加，且呈現劑量反應關係。在 120μ M 濃度之 R- SO、S- SO 與 (R+S)- SO (racemic styrene oxide ）處理後，TK6 細胞的相對存活率依次為 50.55、56.25 與 51.24％，180μ M 濃度下分別為 12.7、 14.0 與 13.95。 R- SO、 S- SO 與 (R+S)- SO 對 TK6 細胞誘發的細胞毒性沒有達到統計上之顯著差異。利. 用. hypoxanthine. guanine. phosphoribosyl- transferase ( hprt) 與 thymidine kinase (tk) 基因為突變基因指標，探討 SO 與其光學異構物的致突變性。結果顯示 SO 與其光學異構物在 TK6 細胞誘發的 h p r t 與 tk 基因突變機率均呈現良好之劑量反應關係，在 TK6 細胞 S- SO 所誘發之 hprt 基因突變率趨勢高於 R - SO (p<0.05) 。在 120μ M 濃度下 R - SO、 S- SO 與 (R+S)- SO 所引發 hprt 基因的突變率分別為 26.6 ×10 - 6 、 33.0 ×10 -6 與 1.

(6) 35.1 ×10 - 6，在 180μ M 濃度下誘發的 hprt 基因突變率分別為 32.1 ×10 - 6、50.0 ×10 -6 與 45.0. ×10 - 6。 120μ M 濃度. 下 R - SO、 S- SO 與 (R+S)- SO 對 tk-fast 基因 ( tk-fast) 之致突變率分別為 23.05 ×10 - 6、 30.95 ×10 -6 與 28.33 ×10 - 6， tk -slow 基因 ( tk-slow) 之致突變率分別為 41.07 × 10 - 6 、 28.01 ×10 -6 與 31.72 ×10 -6 ，但是都沒有達到統計上之顯著差異（p>0.05）。綜合上述結果顯示 SO 與其光學異構物對 TK6 細胞會誘發細胞毒性與突變性，雖然有劑量反應關係，但是其間的差異並未達到統計上之意義；因此 R - SO 與 S- SO 可能在 SO 誘發的細胞毒性與突變性過程中佔有同樣重要地位。. 2.

(7) 英文摘要 Styrene is widely used in the production of plastics. It is metabolic activated by cytochrome P- 450 to styrene- 7, 8 - oxide (SO) with two enantiomeric isomers, R- SO and S-SO.. SO is a. known animal carcinogen and probable human carcinogen.. It is. unclear which isomer plays a more important role in SO - induced cytotoxicity and mutagenicity. In this study the cytotoxicity and mutagenicity of R- SO, S- SO and racemic styrene oxide ((R+S) - SO) were determined in the human lymphoblastoid cell line (TK6). After exposure to various concentrations (60~180μM ) of SO and its isomers for 24 hours, treated cells were counted and plated to determine the relative survival (RS) by the growth delay curve and the plating efficiency (PE)measurement,. respectively.. SO. and. SO. isomers. cytotoxic to TK6 cells in a dose-dependent manner.. were. The RS of. 120μ M R- SO,S- SO and (R+S) - SO -treated cells were 50.6, 56.3 and. 51.2%,. respectively.. At. 180 μ M. R- SO,S- SO. and. (R+S) - SO-treated cells were 12.7 14.0 and 14.0%, respectively. However, there is no statistically significant difference among SO and its optical isomer-induced cytotoxicity. The relative mutagenic potential of the SO and its isomers was. determined. at. hypoxanthine. guanine. phosphoribosyl-transferase ( hprt) and thymidine kinase (tk) gene in TK6 cells.. The mutant frequencies at the hprt and tk gene. induced by SO and its isomers were dose-dependent. more mutatgenic at hprt gene than R- SO (p<0.05).. S- SO was. Treatment of. 120 μ M R- SO, S- SO and (R+S) - SO induced the hprt gene mutation frequencies of 26.6, 32.96 and 35.1 ×10 - 6 , respectively.. 3.

(8) Treatment of 180 μ M R- SO, S- SO and (R+S)- SO induced hprt gene. mutation. respectively.. frequency. of. 32.1,. 50.0. and. 45.0. × 10 - 6 ,. Treatment of 120μ M R- SO, S- SO and (R+S)- SO. induced tk-fast mutant frequency of 31.0, 23.1 and 28.3× 10 - 6 , respectively. Treatment of 120 μ M R- SO, S-SO and (R+S)- SO induced tk- slow mutant frequency of 28.0, 41.1 and 31.7×10 - 6 , respectively. No statistically significant difference among R- SO, S- SO. and. (R+S) - SO- induced. tk-fast. and. tk- slow. mutant. optical. induced. frequencies was found. Results. of. this. study. show. SO. and. SO. cytotoxicity and mutagenicity in a dose dependent relationship,. but they were not significal.. Taken together, these data. suggest that R- SO and S- SO may play a similar important role in (R+S)-SO-induced cytotoxicity and mutagenicity.. 4.

(9) 第一章. 前言. 苯乙烯 (styrene) 在塑膠製品工業中，為製程中不可缺少的原料，而且使用量逐年升高。 Styrene 在生物體內的代謝主要經由細胞內質網上的細胞色素. CYP- 450. (cytochrome - P450 mediated monooxygenase) 酵素代謝為為苯環氧乙烷 (styrene oxide ； SO) ， SO 再經由體內去毒性酵素作用後排出體外。在動物實驗已證實 SO 具有致癌性，而其致癌的生物機轉目前為止仍不清楚。有關 SO 在動物實驗與人體暴露調查之相關研究很多，其探討內容包括， SO 代謝的相關酵素、 SO 之細胞毒性、半致死劑量（ L D 5 0 ＝ 1.5 nmol/egg ）(Vainio et al.,1977)、SO 在 D N A 上產生的 DNA 共價鍵結物（ DNA adduct）、 SO 的致突變性、人體暴露在 styrene 作業環境下之勞工所造成的姊妹染色體交換（ sister chromatid exchange； SCE）與染色體變異 (chromosomal aberration； CA）等。而 SO 具有兩種光學異構物（ R -styrene oxide ； R- SO 與 S-styrene oxide ； S- SO），然而對於 SO 的光學異構物產生的細胞毒性與致突變性之探討並不多。本研究首次以人類淋巴母細胞 (TK6) 來探討 SO 光學異構物在人類細胞的致細胞毒性與致突變性。利用 TK6 細胞生長情形與細胞群落形成能力來測試細胞毒性，並且使用 hprt (hypoxanthine guanine phosphoribosyl- transferase) 基因與 tk (thymidine kinase ）基因為標的基因進行突變性的測試，這些結果有助於進一步瞭解 SO 與其光學異構物之相對致細胞毒性與致突變性。. 5.

(10) 第二章研究目的比較不同光學異構物(R-SO 與 S-SO)對人類淋巴母細胞(human lymphoblastoid cell ;TK6)的致細胞毒性與致突變性，進而了解 SO 光學異構物在人類細胞中何者扮演較重要的角色。. 第三章. 文獻探討. 第一節苯乙烯 ( 一)苯乙烯之物化特性 styrene 是一種重要的工業用化學單體，廣泛應用於塑膠、樹脂、塗料等化學工業。據估計 1992 年一年中 styrene 的產量約 1600 萬噸（ Scott，1994 ），以民國七十三年為例，我國全年使用之 styrene 約高達 22 萬公噸 ( 經濟部，1979) 。 styrene 又名 vinylbenzene ， 1- phenylethylene (CAS No.100 -42- 5 ）是無色或淡黃色的液體，其密度為 0.9059 g/ml，分子量 104.1 6 g/mol，沸點為 145 .14 ℃，其分子結構如附圖 9( Pfaffli and Saamamene ， 1993) 。 styrene 在水中的溶解度很低，在 25℃ 中約為 3mM (Howard et al .,1989) ，但是可溶於醇類（ alcohol）、酯類（ ether）、丙酮（ acetone ）及二硫化碳（carbon disulfide）(ATSDR，1990)。 styrene 在空氣中會和氫氧基及臭氧反應，其半衰期約為 3.5 ∼ 9 小時 ( Howard， 1989) 。在空氣中經陽光照射或是環境溫度超過 200℃ 時會產生聚合反應 ( Keith et al.,1987) 。 6.

(11) 低濃度之 styrene 氣體有芳香氣味，高濃度時有令人厭惡之惡臭味。. ( 二)苯乙烯的毒性與致癌性暴露在 styrene 環境下，會有自覺性的頭痛、疲倦、眩暈、嗜睡、抑鬱、精神不易集中的感覺，其他自覺症狀有平衡障害、反應時間延遲與眼、鼻、呼吸道和皮膚的刺激等症狀。(Seppalainen et al., 1976)。動物暴露在含有 styrene 的空氣中，並不會造成癌症，但是對於暴露在 styrene 工作環境中是否會造成基因的傷害，看法並不一致。將大鼠與小鼠長時間(2 年)暴露在含有 styrene 的空氣中（ 50ppm~100ppm）發現，其肝臟細胞中每 10 8 核. 酸序列，在 guanine 的 O 6 位置上產生的 DNA. adduct 約有 100 個，而作者認為每 10 8 核. 酸中有 200 ∼. 500 個 DNA adduct 還不會使小鼠與大鼠發生腫瘤，因此他認為. styrene. 是一個非常弱的親電子性 (weakly. electrophilic activity) 之化學物質，其與 D N A 之結合力不大，而且在大鼠細胞血漿（ plasma ）中半衰期只有 20 分鐘，而且產生之 DNA adduct 的量很低（ Otteneder and Lutz， 1999）。 1978 年有學者對 31 位勞工進行生物檢測與作業環境測定，在空氣中檢測到 styrene 含量為 10 及 40ppm，mandelic acid 在尿液中之含量約為 40 及 100 mg/L，雖然有 14 位勞工其 mandelic acid 的代謝產物在尿液中之含量約為正常人的 36 倍，也發現他們的染色體缺損現象，但是彼此間並沒有劑量反應關係，相同的情況也發生在 SCE 現象中。而作者認為空氣中 styrene 含量與染色體缺損之現象，沒有劑量反應 7.

(12) 關係之原因可能是 styrene 不是直接造成染色體有缺損之主要物質，可能有其他因素造成染色體缺損（ Scott and Preston，1993）。以工廠中非現場作業勞工作為低暴露組，以實驗室研究員作為未暴露組，分析 9 位暴露在 styrene 環境中（ 7 個月）之勞工的周邊血液淋巴球與顆粒球（ granulocytes ）中 O 6- guanine DNA adduct 與 DNA strand breaks。研究顯示，利用. 32. P- postlabelling 方法檢測 DNA adduct，發現暴露在. styrene 環境下之勞工，在 guanine 上 O 6 位置所產生之 DNA adduct 明顯高於低暴露組 (p<0.0001) 。在 h p r t 基因突變率方面雖然暴露組（ 17.5 ×10 - 6 ）比低暴露組 ( 15.7 ×10 - 6) 突變率稍高，但是並沒有達到統計上之顯著差異，而暴露組 (18.7 × 10 - 6) 之突變率比未暴露組 (11.8. × 10 - 6) 高. （ P<0.021）。因此作者認為暴露在 styrene 工作環境中之勞工，可能會引發基因傷害，高暴露者的 hprt 基因突變率並沒有明顯高於低暴露組，但明顯高於未暴露組 (Vodicka et al.,1995)。在 27 個獨立研究之調查顯示，有 11 個報告指出暴露在 styrene 環境中之勞工，染色體變異有明顯高於非暴露者之趨勢， 12 個研究微核（ micronuclei； MN ）現象中有 4 個研究有明顯差異，13 個研究 SCE 現象中有 3 研究有明顯差異。總計在 52 個獨立研究中，有 18 個研究認為，暴露在 styrene 環境中的勞工有染色體傷害的形成（ Scoot and Preston， 1994）。在許多流行病調查發現，styrene 會使致癌的風險提高，包括直腸癌、淋巴瘤、喉頭癌等。 Vodicka 指出 styrene 作業勞工中因白血病與淋巴瘤而死亡人數有升高之趨勢，在一 8.

(13) 項針對歐洲地區大規模流行病學調查研究指出，在塑膠成型工業中之勞工因為癌症而死亡的比例有增加，而且在部分塑膠成型工業勞工族群中，工作超過一年者得到白血病與淋巴瘤的危險性有小幅度升高之趨勢（ Vodicka et al., 1995)。由以上結果顯示 styrene 是否對人體造成基因傷害，在暴露勞工中之研究與流行病學之調查都尚未有定論。文獻指出澳洲、比利時、芬蘭、瑞士、英國和美國設定勞工暴露在 styrene 環境中之標準為 100 ppm，丹麥、挪威及日本為 50 ppm，捷克及東德為 47 ppm，波蘭為 24 ppm，匈牙利為 1 ppm (Scandinavian，1979 )。我國行政院勞工委員會公告之勞工作業環境空氣中有害物質容許濃度標準， styrene 暴露之時量平均容許濃度 (PEL - TWA) 為 50 ppm，短時間時量平均容許濃度 (PEL- STEL) 為 62.5 ppm ( 行政院勞工委員會，1995)。從上述顯示各國所訂標準 styrene 之容許濃度標準有差異，但因其體內代謝物 SO 可能誘發人類產生致癌，因此 styrene 的容許濃度有日漸下降之趨勢。 styrene 本身的細胞毒性很低，超出生物檢測所能偵測到之範圍，必須藉由生物體內代謝後才會產生毒性（Scott et al.,1994）。. ( 三)苯乙烯的代謝 styrene 主要在肝臟進行代謝，而少部分在肺臟、腎臟、腸、皮膚、淋巴系統與紅血球等其他組織進行代謝 (Leibman et al.,1968，Belvedere and trusi，1981）。在 1993 年 Nakajima 等人利用體外試驗發現，在動物體內參與代謝的 CYP - 450 酵素有物種上的差異，因此在不同物種間所造成之細胞毒性與致突變性也可能會不同（ Nakajima et al.,1993）。文獻指出在大鼠體內，參與 styrene 代謝為 SO 9.

(14) 的 CYP -450 酵素主要為 CYP 2E1 、 CYP 2B1、 CYP1A 1/2 與 CYP 2C 11；在人體中參與 styrene 代謝為 SO 的酵素主要有 CYP 2E1 ， CYP 2B6 、 CYP 1F1 等 (Gadberry et al.,1996) 。而 C arlson 利用 α- naphthoflavone （ α- NF ）與 α- methylbenzylaminobenzotriazole （ MBA）分別抑制 CYP 2B 與 CYP 1A 之活性，發現 CYP 2B 與 CYP 1A 並不是參與代謝 styrene 的主要酵素，人體中主要參與代謝 styrene 的主要酵素為 CYP 2E1 (Carlson et al.,1998) 。顯示不同物種間參與 styrene 代謝為 SO 的酵素並不相同，縱使同一物種，在不同器官中其酵素種類與含量也會有差異。 Styrene 經 CYP- 450 代謝為 SO 後，在生物體內經由 glutathione. ( GST) 酵素或. S- transferases. epoxide. hydrolase ( EH) 酵素進行去毒性作用，再隨著尿液排出體外。 SO 在體內經由 GST 酵素會產生硫醇酸（ mercapturic acid），經由 EH 酵素作用其代謝產物為苯乙烯甘油（ styrene glycol）或苯乙醇酸 (mandelic acid； MA) ，其代謝簡圖見附圖 2.(Barale，1991）。. 第二節. 苯環氧乙烷. ( 一)苯環氧乙烷的致毒性與致癌性 SO 曾被報導會造成生殖毒性，例如會導致大鼠 preimplantation loss 頻率增加，且對於懷孕的大鼠有增加體內缺鈣的現象， SO 也會造成早期懷孕的動物胎兒的毒性，但是並沒有足夠證明會造成畸形兒（Liodbohm，1993）。 SO 經由動物實驗證實，會引發老鼠產生癌症，包括餵食 SO 會造成老鼠的胃癌（ forestomach tumours）(Lijinski， 10.

(15) 1986)，而皮膚接觸 SO 會造成皮膚癌。SO 在 1994 年被 IARC (International Agency for Research on Cancer) 歸類為 2 A group 致癌物 ( 動物實驗已被證實會造成癌症，但是人類流行病學調查還沒有足夠證據證實會致癌)。. ( 二 ) DNA 共價鍵結物（ DNA adduct） Styrene 代謝為 SO 後，SO 結構中的 Oxirane ring 會攻擊 D N A，形成 DNA adduct， DNA adduct 可被 D N A 修補酵素修補，未修復之 DNA adduct 在 DNA 複製時可能產生錯誤配對或造成複製程序被終止，進一步造成基因突變或細胞死亡。 SO 會攻擊 D N A 許多位置，於體外試驗顯示在 guanine 中 N -7、N 2 與 O 6 等位置都會產生 DNA adduct，其發生比例依次為 72：23：3.7。SO 除了攻擊 guanine 位置而產生 DNA adduct 外，也會在 adenine 的 N -1 及 N 6 、 cytosine 的 N 4 、 N-3 及 O 2 與 thymine 的 N- 3 等位置產生 DNA adduct (Bastlova et al.,1996)。 SO 主要藉著 Oxirane ring 的 α 與 β 碳與 DNA 結合（附圖 1），DNA 與 α 碳位置結合後，其型態較類似環狀芳香環， DNA 與 β 碳位置結合後較親脂性。而 α / β 碳結合所佔的比例會受到親核性物質不同而影響，研究顯示，在 guanine 中 N-7 位置上，與 α /β 碳位置結合的比例為 47/53；N 2 位置上只會與 α 碳位置結合； O6 位置上與 α /β 碳位置結合的比值為 4.41（H emminki and Vodicka ，1995），此現象顯示，在 guanine 不同的位置上，與 Oxirane ring 之結合位置也有所差異。在所有產生 DNA adduct 的核 11. 酸中，發生於 guanine.

(16) 中 N -7 上的 Adduct 比例最高，但是 guanine 中 N- 7 並不參加 DNA 複製時的鹼基配對，但是其可能因為自發性或修補酵素的作用而產生去鹼基位置（ abasic site ），進而造成 DNA 複製終止或錯誤配對。另外 guanine 中 O 6 位置形成 DNA adduct 的機率雖然比較低，但是因為這個位置會參與 D N A 的鹼基配對，因此在 O 6 位置所形成之 D N A adduct 對基因突變的影響可能佔有重要地位。利用 alkaline elution 技術，測量白血球中 DNA strand breaks 之情形，能夠有效的偵測到 styrene 低濃度（ 20ppm）下所造成的 DNA 損傷（ Walles et al.,1993 ），一項調查研究顯示，大鼠肝臟細胞細胞質（ hepatocytes ）暴露 3mM 之 styrene 經 3 小時，會造成 DNA strand breaks，而 SO 則只需 0.3 mM 就會造成 DNA strand break（Barale，1991）。. ( 三)苯環氧乙烷之基因毒性在許多針對哺乳類細胞之體外試驗與動物體內（ mouse ）試驗顯示 SO 確實會造成染色體異常之現象（Barale，1991）。 SO 會導致人類周邊血液淋巴球細胞、 Chinese hamster 細胞中染色體傷害（ chromosome damage；C A）（ Scott and Preston， 1994 ）。將人類周邊血液之淋巴球細胞分離，並暴露在 100μ M 之 SO 中，經 22∼ 72 小時，即有明顯 SCE 增加之情形（ C hakrabarti et al.,1997）。以 SO 濃度 200μ M 下處理不同人類周邊血液之淋巴球細胞 24 小時，而其引發的 hprt 基因突變率分別為 15.0 ×10 - 6 /cell）約為未處理組的 3.6 倍 (Bastlova et al .,1995)。以 SO 濃度（ 200 ∼ 400 μ M）下處理人類周邊血液之淋巴球細胞 6 天，而其引發的 hprt 12.

(17) 基因突變率（ 10 ∼ 20 × 10 - 6 /cell ）約為未暴露組的 4 倍 (Bastlova et al.,1995)。因此作者推測長時間暴露在 styrene 之環境下之作業勞工，比高濃度短時間的暴露，所引發 hprt 基因突變與 DNA adduct 會較嚴重(Bastlova et al.,1995)。. 調查研究顯示，在人類白血球細胞中加入 styrene （ 2.6 mM ）經 72 小時後，在淋巴球中誘發染色體異常之現象，而在相同實驗中，SO 的劑量只要在 0.7 mM 即可看到染色體異常現象（Barale，1991）。對 styrene 暴露的勞工， hprt 基因突變與 DNA adduct 進行研究，發現他們的 hprt 基因突變率約為一般非暴露者的 1.5 ∼ 2 倍，而且在 3∼ 4 次的採樣中， hprt 基因突變的突變率高於非暴露者，但是只有一次達到統計上之顯著意義，並且同時發現 DN A adduct 也明顯增加，但是在 4 次之採樣分析顯示， hprt 基因突變與 DNA adduct 並沒有呈現良好的關係，顯示 hprt 基因突變可能會受到其他許多不明原因之影響，包括飲食、生活習慣等因素影響（ Lambert et al.,1995 ）。. 第三節苯環氧乙烷的光學異構物 ( 一)苯環氧乙烷光學異構物之致毒性有關於 R - SO 與 S- SO 之致毒性的文獻並不多，在細菌與動物實驗顯示，不同物種對不同 SO 光學異構物，所造成的細胞毒性結果並不一致。作者利用. Salmonella. typhimurium TA100 經不同 SO 光學異構物暴露後， R - SO 處理的細胞存活比率為陰性對照組的 76%， S- SO 為 2%， 13.

(18) 此結果顯示： S- SO 對細菌的毒性比 R - SO 大 (Pagano et al.,1982)，而 Seiler 於 1990 年以相同的細胞與測試方法，其所得到之結果也相同（Seile，1990）。 Gadberry 等人將 R - SO 與 S- SO 以注射方式處理小鼠 24 小時後，藉著測量小鼠肝臟與肺臟釋放之酵素的活性，作為毒性大小之指標，結果顯示 R - SO 處理的老鼠，肝臟所釋放出的酵素活性比 S- SO 處理的酵素活性高，雖然大部分都沒有達到統計上之顯著意義，在 R - SO 與 (R+S)- SO 處理的肝臟其釋放出來 SDH 的酵素活性明顯高於 S- SO 處理組（ Gadberry et al.,1996）。Watabe 也認為在 S- SO 較容易被大鼠肝臟中 mEH 酵素分解，所以 R- SO 處理的大鼠肝細胞之毒性可能高於 S- SO（Watabe and Yoshikawa ， 1981 ）。此顯示 R- SO 對肝臟產生的毒性大於 S- SO，而這些老鼠所測試的結果恰與細菌之毒性結果相反 ( Pagano et al .,1982) 。. 1 .CYP-450 酵素之影響將 phenobarbital（ PB）與 β- naphthoflavone (β -NF) 注射到大鼠體內，分別誘發 CYP 2B 與 CYP1A 酵素，以 PB 與 β-NF 注射之老鼠其肝臟微粒體 (microsome)與 styrene 反應後，所產生的 R- SO/S- SO 分別為 0.92 與 1.25 ，而沒有經過藥物注射的老鼠，其 R- SO/S- SO 為 0.65。此現象顯示 CYP 2B 與 CYP1A 酵素雖然不是主要代謝 SO 之酵素，但是在生物體內之 CYP- 450 中某些酵素活性增加時，會造成不同 SO 光學異構物生成率不同，因此生成率高者，其所造成的毒性也可能較高 (Foureman e t al.,1988)，但是 SO 光學異構物的細胞毒性會受到其他去毒性酵素之影響。. 14.

(19) 2 .GST 酵素之影響 GST 酵素對不同 SO 光學異構物之結合力有 2 種不同看法。H iratsuka 等人於 1989 將老鼠肝臟細胞質 (cytosol) 與 SO 反應後，測試 SO 光學異構物與 GSH 的鍵結物，結果顯示 R- SO 與 GST 酵素的結合力約為 S- SO 的 1.8 倍，顯示大鼠中之肝臟內 GST 酵素對 R - SO 代謝速率比 S- SO 快 (Hiratsuka et al.,1989) 。老鼠體內測試顯示，將 SO 光學異構物注射到老鼠體內，發現有 28％的 R- SO 會與 GST 酵素作用，產生 R- SO 的 mercapteria acid 代謝產物， S- SO 則約為 19%(Linhart et al.,1998) ，而在 Watabe 於 1982 年也有類似之報告 (Watabe et al.,1982) ，這些結果都顯示 R - SO 與 GST 酵素可能有較高之結合力。 Foureman 於 1988 年對老鼠肝臟微粒體 ( microsome)進行體外試驗，其結果與上述 2 位研究者看法相反。他利用 [ 1 4C ]SO 處理肝臟微粒體，測量 SO 與肝臟中 GST 的鍵結物，發現 R- SO/S- SO 的比例為 0.65 ，此結果顯示老鼠肝臟中 GST 酵素與 S- SO 的結合力較高。將老鼠注射 β - NF，會降低體內 CYP- 450 酵素活性，此時將肝臟取出，萃取肝臟微粒體，但是當微粒體中 EH 酵素活性被 CHO (cyclohexene oxide)抑制後， SO 不同光學異構物大部分經由 GST 酵素進行去毒性作用，GST 酵素與 SO 不同光學異構物作用，發現 R- SO/S- SO 的比例為 1.25 (Foureman et al.,1988 )。此結果顯示與 SO 光學異構物與 GST 酵素之結合力也會受到 CYP-450 在生物體內活性的影響。有學者萃取老鼠肝臟細胞之酵素，發現老鼠肝臟細胞 GST 3 - 3，3- 4，4- 4（被分類為 mu 酵素）對 R - SO 的結合力較強，其中尤其以 GST3- 3 對 R- SO 具有高度之結合力，而 15.

(20) G S T 1-1， 1- 2， 2- 2（被分類為 α 酵素）與 S- SO 結合力較強。而以化學物質誘發老鼠產生肝癌中的主要 GST 酵素 (GST 7-7) ，發現其與 S- SO 結合力較強。此現象更明顯顯示，不同的 GST 酵素對 SO 光學異構物之結合力不同，而在人體肝臟中酵素與 SO 之結合力大小依次為 GSTµ ＞ GST π ＞GST α~ε (Hiratsuka et al.,1989)。. 3 .Epoxide hydrolase（ EH）酵素之影響在細菌方面之研究顯示，利用從細菌中純化出 recombinant 所產生之 EH 水解酵素來水解 SO，發現 EH 酵素會將 R - SO 先水解，而 R - SO 水解約 90%時， S- SO 才開始快速與 EH 酵素進行作用，因此認為 EH 酵素對 R- SO 結合力較高(Spelberg et al.,1998)。 SO 除了經由 GST 進行去毒性作用外，還會經由 EH 進行水解，學者在 EH 酵素對 SO 光學異構物之結合力也有不同的看法。有學者將 (R+S)- SO 注射到老鼠體內經 24 小時，並同時給予 TPCO(3，3，3- tr ichloropropene oxide) 阻斷 EH 代謝路徑，測量小鼠肝臟與肺臟釋放之酵素活性，因為肝細胞與肺細胞被破壞，會分別大量釋放出 SDH (serum sorbitol dehydrogenase) 與 LDH (lactate dehydrogenase) 、 GGT (gamma - glutamyl. transpeptidase) 酵素。先以. BSO. (buthionine sulfoxamine) 抑制 GST 酵素之活性後，再注射 (R+S) - SO，肝臟與肺臟中這些酵素的量卻沒有明顯增加，此結果顯示阻斷 GST 酵素之活性並不會對肝與肺細胞造成傷害。因此作者認為 EH 代謝路徑為 SO 之主要代謝途徑 (Watabe et al.,1982，Gadberry et al.,1996)，此結果與細菌方面之結果相反。 16.

(21) 有學者也發現小鼠肝臟細胞中 EH 之酵素活性就比中國倉鼠高 ( Norppa，1979)。在 1989 年 Drummond 等人與 1987 年 Korn 等人偵測人體中 styrene 經由 EH 代謝其 mandelic acid 尿中代謝物，推估 R - SO 與 S- SO 的比例在 0.5 ~2.2 之間（ D rummond et al.,1989 ， Korn et al.,1987）。因此不同物種中去毒酵素的含量可能不同，對 SO 光學異構物之結合力也可能不同，因此會影響 SO 光學異構物對細胞毒性反應。. ( 二)苯環氧乙烷光學異構物之致突變性 1982 年 Pagano 等人利用 Salmonella typhimurium TA100 進行 Ames test 顯示， R - SO 致突變率高於 S- SO，而(R+S)-SO 之突變性介於兩者中間(Pagano et al.,1982)。. 老鼠骨髓細胞中觀察 C A 與 SCE 之情形顯示， S- SO 的致突變性大於 R - SO (Sinsheimer et al.,1993) 。在細胞株 (C hinese hamster V79)方面之研究顯示： S- SO 造成 SCE 的頻率高於 R-SO (von der hude et al.,1992)。. 而影響光學異構物致突變之因子除了不同光學異構物與去毒性酵素之反應外， SO 光學異構物與 DNA 形成 D N A adduct 也是一個重要因子。 Seiler 在 1990 年的報告中指出，不同光學異構物所造成的 DNA adduct 有所不同，因此認為不同型態的 DNA adduct 在經過 D N A 修復與複製過程中，所造成基因突變的頻率也會不同 ( Sinsheimer et al.,1993)。 Latham 於 1993 年在體外以 human N -ras 61 codon 中 Adenine 結構上的 N 6 位置合成 R- SO 與 S- SO 的 DNA 17.

(22) adduct，將此具有 DNA adduct 的 gene 植入細菌內，經 DNA 複製後測試點突變 ( 附圖 3)，結果發現只有在 S ( 6 1. ， 2). 位置上. 之 DNA adduct 會引發約 1.6 ％的 A→ G 的突變，而且認為除了 DNA adduct 形成的位置會影響突變率，另外在 adduct 附近之序列也會影響突變率，影響突變率的因子包括形成 D N A adduct 的能力、D N A 的修復能力與 DNA 聚合. 錯誤判斷所. 造成的錯誤配對能力(Latham et al.,1993)。. 第四節 hprt 與 tk 基因 1 .hprt 基因 hprt 基因位於 X 染色體上，具有 9 個 exon 與 8 個 intron，約有 4 0 0 0 0 base pair ，因此只要在 hprt 基因上發生單一突變就可以被選擇性試劑（ 6- Thioguanine ）偵測出來，而因為 hprt 基因不是細胞生長的必需基因（ essential gene ），為偵測突變之良好標的基因。 hprt 基因已經被定序，因此再配合基因序列分析就可以明確檢測出點突變或基因缺失的種類與位置 (Casciano et al.,1999) ，經由 DNA adduct 分析可以推測出造成基因突變的可能的來源。. 2 .tk 基因 tk 基因因為突變位置不同，導致生長速度的表現也不同，第一種為 tk 基因突變後，細胞生長比較快之型態 ( tk-fast growing mutants ； tk-fast) ，其所測得之突變率為點突變或小段基因缺失或嵌入；另一種 tk 基因突變會使 tk 基因的兩旁 (flanking) 造成缺失，使得細胞長的比較慢（ tk -slow growing mutants ； tk- slow），主要可以測得 DNA 大片段的 18.

(23) 缺失（ deletion）。 tk 基因的突變很容易被 Trifluorothymine deoxyriboside （ TFT ）選擇性試劑所篩選。 tk 基因能夠測量非常廣泛的突變，包括點突變與嚴重的染色體改變或對偶基因的缺失（ allele loss ），可以說是一個良好的基因指標（Honma et al.,1997）。. 綜合前人之研究結果顯示，SO 光學異構物在不同生物種類中，其扮演的致毒性與致突變的角色可能會有所差異，而且不同研究對不同 SO 光學異構物所造成的細胞毒性與致突變性看法並不一致，而目前仍沒有以人類細胞來探討 R- SO 或 S- SO 誘發細胞毒性與突變率的相關研究報告。我們首次以人類淋巴球細胞對 SO 與 SO 光學異構物所造成之細胞毒性與致突變性進行探討，希望能進一步瞭解 SO 與其光學異構物對人類淋巴球細胞之相對細胞毒性與致突變性。. 19.

(24) 第四章材料與方法第一節材料. ( 一)細胞來源本實驗使用人類淋巴母細胞株 (human lymphoblastoid cell line ； TK6 ) ，此細胞株購自新竹食品工業發展研究所菌種保存中心(CCRC 60107 )。 ( 二)藥品 styrene oxide、R- phenyloxirane (R-styrene Oxdie) 與 S- phenyloxirane (S-styrene Oxide ) 購自 Fluka 公司。配置 RPMI 1640 medium 粉末 ( 美國 Gibco BRL)，在 RPMI 1640 medium 中加入 Sodium Bicarbonate (NaHCO3)( 美國 Sigma) 配置為培養液，並以 1N HC l 調整 pH 值為 7.2 ∼ 7.4，分裝為 450 ml 置於 4 ℃ 備用，使用前加入 penicillin ， streptomycin (P/S) ， 200mM L-Glutamine ， ( 美國 Gibco BR ) 、 9％ Donor. horse (HS) （英國 Selborne Biological. Services ）與 1 ％ H EPES buff er ( 義大利. Biological. industries)。降低突變背景值所需之 HAT supplement ( 40μ M. aminopterin ， 1.6. mM. thymidine ， 10mM. sodium. hypoxanthine )、HT supplement ( 1.6 mM thymidine，10mM sodium. hy poxanthine ) （美國. Gibco. BRL ）. 與. 2-Deoxycytidine( 美國 Sigma ) 。篩選 h p r t 基因突變之選擇性試劑為. 2- Amino -6- mercaptopurine. （ 6- TG ），篩選. tk. 6- thioguanine. 基因突變之選擇性試劑為. Trifluorothymine deoxyriboside (TFT) (美國 Sigma)。 20.

(25) 細胞計數所需之染劑為 0.4% Trypan Blue Stain（美國 Gibco BRL ）。冷凍細胞所需之 sterile dimethyl-sulfoxide (DMSO) ( 美國 Sigma) 。細胞培養瓶與所有 15ml、 50ml 無菌試管，與過濾 RPMI 1640 medium 所需之 500 ml 無菌濾杯均購自美國 Corning 公司。 96 孔平底培養盤購自美國 Costar 公司。. 第二節方法 ( 一) 細胞培養 TK6 細胞株利用含有 9％ H S，1％的 L- Glutamine，1 % penicillin /streptomycin 及 1 ％ HEPES buffer 之 RPMI 1640 細胞培養液培養，將細胞株置於含有 5％ CO 2 的 37 ℃ 恆溫培養箱內培養，將細胞培養在 1.5 ∼ 2.2 X10 5 cell/ml，每天更換細胞培養液，將細胞維持在對數生長期（ log phase）。. ( 二) 細胞株解凍與保存. 1 .細胞解凍將以液態氮保存之細胞凍乾管（ vial）在 37℃ 水浴槽中回溫約一分鐘，使它溶解後，將細胞放入 15ml 的無菌試管中，緩慢加入細胞培養液，充分混合均勻後以 200g 離心 4 分鐘（ 1100 rpm），去除上層液，再加入細胞培養液，並使用 pipet 將離心後所剩之 pellet 進行混合，混合後取出放入 25cm2 培養瓶中。. 21.

(26) 2 .細胞保存 log phase 的細胞以 200g 離心 4 分鐘離，去除上層液後，加入含有 1 2 %之無菌 DMSO 之細胞培養液，使用 pipet 進行混合，取 1ml 放入凍乾管中，迅速放到 - 80℃ 冰箱中進行降溫，24 小時後再移至液態氮桶中保存。. ( 三)細胞計數利用血球計數器計數之，其蓋玻片重量將樣品厚度壓為：0.1mm ，總樣品體積為（ V）=1mm. ×1mm. ×0.1mm. = 0.1(mm) 3 = 0.1(10 -1cm) 3 =10 -4ml 所計數之細胞為 10 4 /ml。依不同細胞濃度調整所計數之格數，使每次計數之細胞均在 100 ∼ 300 cell，以確保細胞計數之精確性。取培養瓶中之細胞液 100μ l 放到 well 中，加入 10 μ l 的 0.4% trypan blue stain 染色（美國 Gibco BRL），以 100X 顯微鏡 ( OLYMPUS， IX- 70 ) 觀察，死細胞之顏色為藍色，計數活細胞數。. ( 四)細胞毒性測試. 1 .未處理組 SO 都必須利用 DMSO 配置成不同的濃度而才能進一步處理細胞，因此未處理組之細胞及加入等量的 DMSO 試劑為溶劑控制組（control）。 2 .相對細胞數目（relative cell number； RCN）去除 SO 的細胞培養液後，每天計算其細胞數，並計算 22.

(27) 其 Td 值，若 Td 回到正常值 (14~18)，則處理組累計細胞生長的倍數 /控制組累計細胞生長的倍數，即可以得到細胞相對毒性 RS％。. 3 .細胞群落生成率 (plating efficiency； PE) 將細胞經 CHAT 處理後，分別處理 SO、 R- SO 與 S- SO 並將蓋子旋緊，培養在 37℃ 的培養箱中，經 24 小時後，離心 (200g， 4mins) 去除 R - SO 與 S- SO，並以 10ml 之 RPMI medium 1640 進行清洗，再離心 (200g， 4min) ，去除上層液，加入細胞培養液，將細胞轉置在 75c m2 的培養瓶中培養。去除 styrene oxide 的細胞培養液後，利用細胞培養液進行連續稀釋，將細胞接種到 96 well 的平板中，使每個 well 中的細胞數控制在 2 或 4 cell （依低劑量暴露到高劑量），經 12- 15 天觀察細胞生長結果，可以計算出細胞生成率，將處理組之細胞生成率 / 控制組細胞生成率，即可得到細胞相對毒性（relative survival；RS）. ( 五 ) hprt 與 tk 基因突變率測試 (Liber and Thilly ， 1982，Skopek，1993）取 Td 值正常的 TK6 細胞，加入 CHAT(Deo xycytidine 、 HAT supplement 與 HT supplement) 之培養基後，去除上層液 ( CHAT. 之成分 ) ，加入含有. HT. supplement. 與. Deoxycytidine (CHT) 之細胞培養液，經 24 小時培養後 (37 ℃ ， 5% CO 2 ) 加入細胞培養液，以血球計數器計算細胞每天增加之情況，以測得 Td 值。以細胞培養液處理 2∼ 3 天內，細胞之 td 值必須在正常 23.

(28) 範圍內(表示細胞回到正常的對數生長期)，在此時進行細胞生成率測試與突變率測試，即可得知細胞中背景突變率。細胞經 SO 處理 24 小時，以離心方法去除 SO 後，經 3~4 天後，將細胞轉植到 96 well plate （ 2cell/well/150μ l 細胞培養液）中，置於 5％ CO 2，37℃ 恆溫培養相中培養。經 12-15 天培養，計算細胞生長結果，可以得到未添加 TFT 選擇性試劑之. PE 。另外將細胞轉植到. 96. well. plate. （ 20000cell/well/150 μ l 細胞培養液）中，此細胞培養液中含有 1μ g/ ml. Trifluorthymine deoxyriboside (TFT) 之選. 擇性試劑，可以有效篩選 tk-fast 基因突變率，將培養盤置於 5％ CO 2 ， 37℃ 恆溫培養相中培養。經 12- 15 天培養，計算細胞生長結果，即可得到 tk -fast 基因突變率的細胞突變率，經 10 天後，再加入 1μ g/ ml TFT 之選擇性試劑，即可得到 tk slow 基因突變率（附圖 4）。利用上述之方法，細胞以 SO 處理後，約 6∼ 7 天後，再加入 1μ g/ ml 6- TG 之選擇性試劑，即可得到 TK6 細胞中 hprt 基因之突變率. ( 六)統計分析方法利用無母數分析（Wilcoxon signed rank test）方法分析。. 24.

(29) 第五章結. 果. 第一節 SO 與 SO 光學異構物在 TK6 細胞之致細胞毒性 ( 一 ) 細胞生長恢復情形 (growth delay) 以不同劑量（ 60、120、160 與 180μ M）的 R- SO、S- SO 與 (R+S)- SO 處理 TK6 細胞經 24 小時後， 180 μ M 濃度之 R- SO、 S- SO 與(R+S) - SO 處理之細胞顯示，細胞生長恢復情形明顯比 control 組慢，在暴露 72 小時後， R- SO 處理的細胞生長倍數為原來的 3.2 倍， S- SO 為原來的 2.6 倍， (R+S) - SO 為原來的 3.0 倍（圖 1），由此顯示 SO 與 SO 學異構物對 TK6 細胞所產生之細胞相對毒性沒有差異。. 以不同劑量（ 60、120、160 與 180μ M）的 R- SO、S- SO 與 (R+S)- SO 處理 TK6 細胞經 24 小時，每日計算細胞生長倍數，在細胞培養 48 小時後，control 組細胞增加為原來 7.36 倍，依暴露劑量增加，細胞有生長遲緩之現象，顯示有劑量反應關係（圖 2）。. SO 與其光學異構物對 TK6 細胞之毒性顯示， R - SO、 S- SO 與(R+S) - SO 三者間對 TK6 細胞之毒性沒有達到統計上之顯著差異。. ( 二 ) 細胞群落形成能力 (PE) 利用細胞群落形成能力 (PE) 試驗顯示，隨著 R - SO、S- SO 與 (R+S)- SO 劑量的增加，所引發的細胞毒性也隨著增加， 25.

(30) 而且呈現劑量反應關係。以 120 μ M 濃度之 R - SO、S- SO 與 (R+S) - SO 處理 TK6 細胞，其細胞相對存活率依次為 50.55、 56.25 與 51.24％（圖 4）。由以上結果顯示，三者間對 TK6 細胞的毒性結果並無差異，此結果與細胞生長恢復情形之結果相似。. 第二節 SO 與 SO 光學異構物在 TK6 細胞之致突變性 ( 一 ) hprt 基因突變率 Pagano 與 Seiler 認為 R - SO 對細菌細胞致突變率明顯比 S- SO 高，此顯示 SO 光學異構物對細菌細胞內之致突變機制，顯然與老鼠細胞和人類淋巴球細胞不同。 TK6 細胞之 hprt 基因背景突變率為 1.0 ∼ 18.8 ×10 - 6 ，隨 SO 暴露劑量（ 60、120 與 180 μ M），hprt 基因的突變率有增加之趨勢（圖 4）。在 120 μ M 濃度下 R - SO、 S- SO 與 (R+S) - SO 所引發 hprt 基因的突變率分別為 25.1 ×10 -6 、 24.1 ×10 - 6 與 35.0 ×10 - 6 ，在 180μ M 濃度下引發 hprt 基因突變率分別為 29.8 ×10 - 6 、 50.4 ×10 - 6 與 45.0 ×10 - 6 。 R- SO 與 S- SO 對 TK6 細胞之突變機率有劑量反應關係，而且 S- SO 之整體突變機率有高於 R - SO 之趨勢，並且達到統計上之顯著不同（ p<0.05）。此結果顯示 S- SO 可能引發 TK6 細胞中 hprt 基因突變率略高 R-SO。. ( 二 ) tk-fast 基因突變率 tk -fast 基因突變率結果顯示， TK6 細胞的 tk-fast 基因之背景突變率為 0.6 ∼ 18.9 ×10 - 6 。隨著 SO 劑量增加， 26.

(31) tk -fast 基因突變機率也增加（圖 5），但是彼此間沒有達到統計上之顯著差異（ p>0.05），此表示 R - SO 與 S- SO 在 TK6 細胞所誘發之 tk-fast 基因突變率並無差異。. ( 三 ) tk-slow 基因突變率在 TK6 細胞中 tk- slow 基因之背景突變率在 2.3~23.7 ×10 - 6 之間， tk-s l o w 之基因突變率隨著 SO 劑量增加呈現良好劑量反應關係。在 120 μ M 劑量作為比較，R- SO 引發 tkslow 基因之突變率為 41.1 × 10 -6，S-SO 為 28.0 × 10 -6 ， (R+S) - SO 為 31.7 ×10 - 6 ，而 180 μ M 劑量下 R - SO 之突變率為 89.5 ×10 - 6 ， S- SO 為 66.0 ×10 - 6 （圖 6）， (R+S) - SO 為 78.2 ×10 - 6 （圖 7）。此突變率之結果明顯比 tk -fast 基因突變率高出許多，而且 R - SO 對 TK6 細胞中 tk-slow 基因致突變率高於 S-SO。. ( 四 ) tk-total 基因突變率在 TK6 細胞中 tk - toatl 基因之背景突變率在 12.3 ×10 - 6 ∼ 20.1 ×10 -6 之間， tk- total 之基因突變率隨著 SO 劑量增加呈現良好劑量反應關係。以 120 μ M 的劑量作為比較， R- SO 引發 tk- total 基因之突變率為 64.1 ×10 - 6 ， S- SO 為 55.2 ×10 - 6 ，(R+S) - SO 為 57.8 ×10 - 6 ，而 180μ M 劑量下 R- SO 之突變率為 123.6 ×10 - 6 ， S- SO 為 87.8 ×10 - 6 （圖 6），(R+S) - SO 為 119.5 ×10 - 6 。在三次獨立實驗中的結果顯示，在 60、120 與 180μ M 三種劑量測試中 R - SO 之突變率都比 S-SO 高，但是沒有達到統計上之顯著差異。 27.

(32) 第六章討. 論. 第一節 SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之毒性在 TK6 細胞分別暴露 SO 與其光學異構物 24 小時後，以顯微鏡觀察細胞型態，以計數細胞存活率時，發現 R - SO 比 S- SO 處理的細胞完整性差，而且細胞數明顯減少，死細胞數明顯較多。以細胞生長遲緩情況與細胞群落形成能力探討細胞相對毒性，統計方法分析結果顯示， R - SO 致細胞毒性沒有比 S- SO 高，細胞相對毒性無法分析出 R - SO 比 S- SO 致細胞毒性高之原因可能是在計數細胞時，因 R- SO 處理的細胞完整較差，因此遺漏許多細胞，是否造成低估細胞數之情形，則有待進一步確認。. 在細菌方面對認為 S- SO 的細胞毒性大於 R - SO，有學者認為是 R- SO 較容易被細菌中之 EH 酵素所水解 (Pagano et al.,1982)所造成。相反的在老鼠肝臟測試發現 R - SO 對肝臟細胞之毒性大於 S- SO，而且認為去毒性酵素中以 SO 主要依賴 EH 酵素進行代謝。另外有報告指出，在體外老鼠肝臟細胞測試與檢測老鼠尿液中 SO 的代謝物 mercapturic acid 都顯示，R- SO 與 GST 酵素之結合力比 S- SO 強（ H iratsuka et al.,1989，Watabe et al.,1982）。而 Watabe 的研究指出 R- SO 大部分經由 GST 酵素進行去毒性作用， S- SO 則經由 EH 酵素進行代謝。由此可見 R - SO 與 S- SO 對細胞的毒性看法並不一致。本實驗雖然在統計分析中，無法比較出 SO 不同光學異構物對細胞之毒性大小，但是細胞在暴露後，以顯微鏡觀察之結果， R - SO 的細胞毒性有大於 S- SO 之趨勢。 28.

(33) 研究顯示 TK6 細胞中之 GST 酵素活性為 AHH -1 細胞（人類淋巴母細胞）的 1/5(Cres pi et al.,1985)，而且有報告指出，中國倉鼠 V79 細胞株中之 EH 酵素活性比小鼠高（ Scott et al.,1994 ）。由此顯示在不同物種中細胞內所含之去毒性酵素的量與酵素活性並不相同，因此可能造成不同物種間細胞毒性的差異。由於去毒性酵素一旦與 SO 結合之後， SO 即失去對細胞的毒性與致突變性，因此 TK6 細胞中 EH 與 GST 兩個去毒性酵素的含量與不同 SO 光學異構物之作用，值得進一步探討。. 研究顯示以 200μ M 之 SO，處理 V79 細胞株 3 小時，其細胞存活率接近 100％，顯示在此劑量下， SO 對 V79 細胞株並沒有造成毒性（ N ish et al.,1984 ）。而以 200 μ M 的 SO 處理人類周邊淋巴球細胞 24 小時，其細胞存活率約為 40％（ Bastlova et al.,1995）。本實驗以 180μ M 的 (R+S)- SO 處理 TK6 細胞經 24 小時，細胞存活率為 13％。由以上之結果顯示，TK6 細胞對 SO 造成之細胞毒性比 V79 細胞與人類周邊淋巴球細胞靈敏度高。. 第二節 SO 與 SO 不同光學異構物之致突變性. ( 一 ) hprt 基因突變率 Sinsheimer 於 1993 年對老鼠骨髓細胞之 SCE 頻率與 CA 測試，結果顯示 S- SO 的突變率大於 R - SO（ Sinsheimer et al.,1993），而本實驗顯示 S- SO 所誘發 TK6 細胞的 h p r t 基因突變率也有高於 R- SO 趨勢，並且達到統計上之顯著差異 29.

(34) （ p=0.038 ），此結果表示 S- SO 可能比 R- SO 更容易引起 point mutation、frameshift 及 small deletion。 Nish 指出， SO 為一種弱致突變物質（ N ish et al.,1984 ），但是在環氧化物中 EB（ 1.2- epoxybutene ）以 125 μ M 處理對 TK6 細胞 24 小時，誘發 hprt 基因突變率為 2.5 ×10 - 6 ，此結果顯示 EB 對 TK6 細胞之致突變性明顯比 SO 小。文獻指出 100 μ M 處理 V79 細胞 3 小時， hprt 基因突變率增加為原來的 <1 × 10 -6 （ Nish et al.,1984 ）。 Bastlova 於 1995 年之結果顯示，SO 在 100μ M 劑量下，誘發人類周邊血液淋巴球細胞之突變率為 11.3 ×10 - 6 ，約為 control 的 1.5 倍。而且在本實驗中，在 2 次獨立實驗背景突變率 (1~3 × 10 -6 ) 較低之情況下， R- SO 與 S- SO 以 120 μ M 誘發 hprt 基因突變率（ 19∼ 27 ×10 - 6 ）約為 c o ntrol 的 8∼ 10 倍左右。以上結果顯示 SO 對 TK6 細胞所造成致突變率比 V79 細胞與人類周邊血液淋巴球細胞高出很多。因此 SO 是否為弱致突變物質仍有待進一步證實。. 曾有文獻指出， TK6 細胞中 h p r t 基因背景突變率約在 2.5 ×10 - 6(Cochrane and Skopek，1994)，正常人之背景突變率在 1.4 ∼ 22.6 ×10 -6 之間（ H ou et al.,1995）。本實驗 TK6 細胞之背景突變率範圍在 1.0 ∼ 16.5 ×10 - 6 ，背景突變率一直沒有很穩定之原因，可能是在處理 CHAT 降低背景突變率時，CHAT 添加三天後，需加入 CHT 處理一天，此時細胞應再度回到正常代謝途徑（ de novo pathway 與 savage pathway），但是由於操作之關係，延遲了 CHT 加入之時間，導致細胞背景突變率升高之原因。. 30.

(35) ( 二 ) tk 基因突變率 hprt 基因為在 X 染色體上可以偵測點突變及小段之基因缺失，而由於 tk 基因位於體染色體上，而且可以偵測到大段基因缺失，因此本研究首次探討 SO 與其光學異構物對 TK6 細胞中 tk 基因所誘發之突變率。結果顯示隨著 SO 與 SO 光學異構物劑量增加呈現良好劑量反應關係，因此證明 SO 確實會誘發 tk 基因突變。 Von der Hude 於 1992 年發現，以 S- SO 誘發 Chinese Hamster V79 細胞株產生 SCE 的頻率雖然略高於 R- SO ，但是並沒有達到統計上之顯著差異。 Watabe 於 1981 年以 Ames test 對細菌之測試也發現 R - SO 與 S- SO 的致細胞突變率沒有差異（ Watabe et al.,1981 ）。在一次的獨立實驗之結果顯示， tk- total 背景突變率為 5~22 ×10 - 6 之狀況下，沒有看出 SO 不同光學異構物對 TK6 細胞致突變之差異。此結果顯示 R - SO 與 S- SO 有可能對 TK6 細胞誘發相同的 tk-toatl 基因突變率。. 本實驗結果顯示 S O 與 SO 光學異構物對 tk-fast 基因突變率並沒有達到統計之顯著差異，此結果顯示 R - SO 與 S- SO 誘發 TK6 細胞中 tk -fast 基因之突變率有可能沒有差異。在 tk -slow 基因之突變率明顯高出 tk-fast 基因，而且在三次之獨立實驗中， R - SO 造成 TK6 細胞中 tk -s l o w 基因之突變率比 S- SO 高，顯示 R - SO 造成 TK6 細胞中較大段之基因突變。. 研究顯示在 human N -ras codon 61 中 Adenine 結構上的 N 6 位置合成 R - SO 與 S- SO 的 DNA adduct，經細菌 DNA 複製後測試點突變，結果發現只有在 S(61. ， 2). 位置上之 DNA. adduct 會引發約 1.6 ％的 A→ G 突變，由此顯示不同光學異 31.

(36) 構物所造成之 DNA adduct 並不一定會造成突變。SO 與 SO 光學異構物細胞突變率受到許多因素之影響，包括去毒性酵素之作用、DNA adduct 形成之能力、DNA 修補酵素對 DNA adduct 之修補與 DNA adduct 被 DNA 聚合. 誤認之機率所. 影響，甚至在突變基因旁邊之基因序列也會影響基因突變率 (Latham et al.1993)。. tk -slow 基因突變率與細胞毒性有相同趨勢（ R - SO ≧ S- SO ），雖然都沒有達到統計上之顯著意義，但是 tk-s l o w 基因突變率主要在測試較大段的基因突變或缺損，因此顯示較大段基因突變（ tk-solw 基因）率比 hprt 或 tk-fast 基因的突變率高。雖然只要發生突變都會使 hprt 酵素或 tk 酵素功能喪失，但是因為在 tk 基因旁邊有許多生長必須之基因，因此 SO 與其光學異構物對 TK6 細胞所造成大段基因缺損之情況，可能比點突變或小段基因缺損之影響較大，尤其是 R - SO 對 TK6 細胞大段基因缺損之影響可能比 S-SO 重要。. 因此本實驗選擇 hprt 基因與 tk 基因作為指標基因，以測試 SO 光學異構物之致突變性，希望能將具有基因突變之細胞收集，日後將進一步分析 DNA 序列以建立突變圖譜，探討 SO 誘發 hprt 基因突變之主要突變位置與所發生的突變種類，以進一步瞭解 SO 與其光學異構物之分子突變機制。. 32.

(37) 第七章. 結論. 本實驗比較 R - SO、 S- SO 與(R+S) - SO 對 TK6 細胞的毒性與致突變性，以無母數分析方法進行分析，其結果顯示 R- SO 與 S- SO 之致細胞毒性未達到統計上之顯著差異，顯示在 SO 光學異構物間，對 TK6 細胞之毒性並無差異。. S- SO（ 60，120 與 180 μ M）對 TK6 細胞 hprt 的突變率比 R- SO 高（ p<0.05 ）。在 tk-fast 基因上不同光學異構物之致突變性經統計分析結果，沒有達到顯著差異（ p>0.05 ）。 tk - total 與 tk -solw 基因之致突變性顯示，在三次獨立實驗中 S- SO 的致突變性都雖有高於 R - SO 的趨勢，但是仍然沒有達到統計上之顯著差異（p>0.05），. 以上結果顯示 R - SO、S- SO 與 (R+S)- SO 三者對人類淋巴球細胞之致毒性與致突變性並沒有顯著差異，造成彼此間沒有差異之原因為，不同 SO 光學異構物對 TK6 細胞之致突變，除了酵素影響外，還會受到不同 SO 光學異構物與 D N A 之結合力、DNA 修補與 DNA 複製時被誤認之機率所影響，而也可能是 R- SO 與 S- SO 彼此間互相拮抗，導致 R - SO 與 S-SO 之致細胞突變率無差異之原因。. 33.

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(46) 30 R S R+S control. RCN (Fold). 25 20 15 10 5 0 0. 1. 2. 3. DAY 圖1. 180μM SO 與 SO 光學異構物誘發 TK6 細胞之生長遲緩現象. 42.

(47) 140. Relative surviva (%). 120. R S. 100. R+S. 80 60 40 20 0 60. 120. 160. 180. dose (μM). 圖 2.以細胞相對存活率（ RCN）評估 SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之毒性. 43.

(48) 120. R. Relative survival (%). 100. S 80. R+S. 60 40 20 0 60. 120. 160. 180. dose (μM). 圖 3. 以細胞群落形成能力（ PE）評估 SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之毒性. 44.

(49) R. -6. hprt MUTANT FREQUENCY (X 10 ). 70. S. 60. R+S 50 40 30 20 10 0 0. 60 120 dose(μM). 180. 圖4. SO 與 SO 光學異構物在 TK6 細胞誘發 hprt 突變率. 45.

(50) 60 R ). S. tk MUTANT FREQUENCY (X 10. -6. 50. R+S. 40. 30. 20. 10. 0 0. 60. 120 160 dose (μM). 180. 圖 5 SO 與 SO 光學異構物在 TK6 細胞誘發 tk fast 基因突變率. 46.

(51) R. tk MUTANT FREQUENCY (X 10. -6. ). 140 120. S R＋S. 100 80 60 40 20 0 0. 60. 120. 160. 180. dose (μM). 圖 6. SO 與 SO 光學異構物對在 TK6 細胞誘發 tk total 因突變率. 47.

(52) tk MUTANT FREQUENCY (X 10 -6 ). 120 R 100. S R+S. 80 60 40 20 0 0. 60. 120. 160. 180. dose(μM). 圖 7 SO 與 SO 光學異構物對在 TK6 細胞誘發 tk slow 基因突變率. 48.

(53) 表 1. SO 與 SO 光學異構物對 TK6 細胞之致突變率 R-SO Dose (μM). S-SO. (R+S)-SO. Mutant Frequencies (X10 -6). Hprt 基因 control. 8.86. 9.31. 11.05. 60. 16.68. 21.83. 26.1. 120. 26.56. 32.96. 35.03. 180. 32.08. 50.04. 45.03. control. 7.25. 9.50. 9.30. 60. 19.33. 14.05. 14.25. 120. 23.05. 30.95. 28.33. 180. 33.67. 34.64. 44.08. control. 7.55. 9.71. 15.98. 60. 30.86. 22.25. 30.81. 120. 41.07. 28.01. 31.72. 180. 89.52. 66.04. 78.18. control. 12.23. 17.53. 20.65. 60. 46.68. 33.80. 45.10. 120. 64.13. 55.17. 57.80. 180. 123.58. 87.84. 119.50. tk-fast. tk-slow. tk-total. 49.

(54) (A). H CH. C H. (B). (C). H. O. O. CH CH2. CH CH2 H. α. β. 附圖 1 SO 與 SO 光學異構物之化學結構（A）styrene (B)R-SO （C）S-SO. 50.

(55) Styrene CYP-450. SO. DNA adduct. ((R+S)-SO) Epoxide. 51. glutathione. hydrolase. S-transferases. (EH). (GST) mercapturic acid. styrene glycol mandelic acid. 附圖 2. Styrene 之活化與去活化路徑. Mutation.

(56) 1. 2. 3. 5’-C GGA CAA GAA G-3’ 60. 61. 62. H C. H CH2OH. C. NH. NH N. N. N. N N. S-isomer. CH2OH. N. N. N. R-isomer. 附圖 3. SO 光學異構物與人類 N-ras 基因 codon. 61 上之 adenine 中 N7 位置形成之 DNA adduct （Latham et al.,1993）.

(57) 人類淋巴母細胞 ( T K 6 )經 C H A T 處理 7 2 小時去除 C H A T 後，繼續培養 3-4 天以 R - S O 、 S-SO 或 S O 處理 2 4小時. 53. 離心後去除化學物質 (2) 細胞毒性. (1) 突變率以正常培養基培養. 立刻接種於 96 3∼ 4天. 6∼ 7天. 接種於含 6-T G 之培養基中 12∼ 1 5天. 接種於含 TFT之培養基中. well plate 12 ∼ 1 5天. RCN. 10 天. 再加 TFT. 計算細胞增加倍數. 以細胞群落 (c o l o n y ) 數目計算細胞相對毒性（ R S）. 10 天. 以細胞群落 (c o l o n y ) 數目 , 計數突變率. 附圖 4. 測量細胞毒性與突變率之實驗流程.

(58)