第 一 節 SO 與 SO 光 學 異 構 物 對 TK6 細 胞 之 毒 性
在 TK6 細 胞 分 別 暴 露 SO 與 其 光 學 異 構 物 24 小 時 後 ， 以 顯 微 鏡 觀 察 細 胞 型 態 ， 以 計 數 細 胞 存 活 率 時 ， 發 現 R - SO 比 S- SO 處 理 的 細 胞 完 整 性 差 ， 而 且 細 胞 數 明 顯 減 少 ， 死 細 胞 數 明 顯 較 多 。 以 細 胞 生 長 遲 緩 情 況 與 細 胞 群 落 形 成 能 力 探 討 細 胞 相 對 毒 性 ， 統 計 方 法 分 析 結 果 顯 示 ， R - SO 致 細 胞 毒 性 沒 有 比 S- SO 高，細 胞 相 對 毒 性 無 法 分 析 出 R - SO 比 S- SO 致 細 胞 毒 性 高 之 原 因 可 能 是 在 計 數 細 胞 時 ， 因 R- SO 處 理 的 細 胞 完 整 較 差 ， 因 此 遺 漏 許 多 細 胞 ， 是 否 造 成 低 估 細 胞 數 之 情形，則有待進一步確認。
在 細 菌 方 面 對 認 為 S- SO 的 細 胞 毒 性 大 於 R - SO，有 學 者 認 為 是 R- SO 較 容 易 被 細 菌 中 之 EH 酵 素 所 水 解 (Pagano et al.,1982)所 造 成 。 相 反 的 在 老 鼠 肝 臟 測 試 發 現 R - SO 對 肝 臟 細 胞 之 毒 性 大 於 S- SO， 而 且 認 為 去 毒 性 酵 素 中 以 SO 主 要 依 賴 EH 酵 素 進 行 代 謝 。 另 外 有 報 告 指 出 ， 在 體 外 老 鼠 肝 臟 細 胞 測 試 與 檢 測 老 鼠 尿 液 中 SO 的 代 謝 物 mercapturic acid 都顯示，R- SO 與 GST 酵 素 之 結 合 力 比 S- SO 強（ H iratsuka et al.,1989，Watabe et al.,1982）。 而 Watabe 的 研 究 指 出 R- SO 大 部 分 經 由 GST 酵 素 進 行 去 毒 性 作 用 ， S- SO 則 經 由 EH 酵 素 進 行 代 謝。由 此 可 見 R - SO 與 S- SO 對 細 胞 的 毒 性 看 法 並 不 一 致 。 本 實 驗 雖 然 在 統 計 分 析 中 ， 無 法 比 較 出 SO 不 同 光 學 異 構 物 對 細 胞 之 毒 性 大 小 ， 但 是 細 胞 在 暴 露 後 ， 以 顯 微 鏡 觀 察 之 結 果 ， R - SO 的 細 胞 毒 性 有 大 於 S- SO 之 趨 勢 。
研 究 顯 示 TK6 細 胞 中 之 GST 酵 素 活 性 為 AHH -1 細 胞（ 人 類 淋 巴 母 細 胞 ） 的 1/5(Cres pi et al.,1985)，而 且 有 報 告 指 出 ， 中 國 倉 鼠 V79 細 胞 株 中 之 EH 酵 素 活 性 比 小 鼠 高 （ Scott et al.,1994 ）。由 此 顯 示 在 不 同 物 種 中 細 胞 內 所 含 之 去 毒 性 酵 素 的 量 與 酵 素 活 性 並 不 相 同 ， 因 此 可 能 造 成 不 同 物 種 間 細 胞 毒 性 的 差 異 。 由 於 去 毒 性 酵 素 一 旦 與 SO 結 合 之 後 ， SO 即 失 去 對 細 胞 的 毒 性 與 致 突 變 性 ， 因 此 TK6 細 胞 中 EH 與 GST 兩 個 去 毒 性 酵 素 的 含 量 與 不 同 SO 光 學 異 構 物 之 作 用 ， 值 得 進一步探討。
研 究 顯 示 以 200μ M 之 SO， 處 理 V79 細 胞 株 3 小 時 ， 其 細 胞 存 活 率 接 近 100％ ， 顯 示 在 此 劑 量 下 ， SO 對 V79 細 胞 株 並 沒 有 造 成 毒 性 （ N ish et al.,1984 ）。 而 以 200 μ M 的 SO 處 理 人 類 周 邊 淋 巴 球 細 胞 2 4 小 時 ， 其 細 胞 存 活 率 約 為 40 ％（ Bastlova et al.,1995）。本 實 驗 以 180μ M 的 (R+S)- SO 處 理 TK6 細 胞 經 24 小 時 ， 細 胞 存 活 率 為 13％。由 以 上 之 結 果 顯 示 ，TK6 細 胞 對 SO 造 成 之 細 胞 毒 性 比 V79 細 胞 與 人 類 周邊淋巴球細胞靈敏度高。
第 二 節 SO 與 SO 不 同 光 學 異 構 物 之 致 突 變 性
( 一 ) hprt 基 因 突 變 率
Sinsheimer 於 1993 年 對 老 鼠 骨 髓 細 胞 之 S C E 頻 率 與 CA 測 試，結 果 顯 示 S- SO 的 突 變 率 大 於 R - SO（ Sinsheimer et al.,1993），而 本 實 驗 顯 示 S- SO 所 誘 發 TK6 細 胞 的 h p r t 基 因 突 變 率 也 有 高 於 R- SO 趨 勢 ， 並 且 達 到 統 計 上 之 顯 著 差 異
（ p=0.038 ）， 此 結 果 表 示 S- SO 可 能 比 R- SO 更 容 易 引 起 point mutation、frameshift 及 small deletion。
Nish 指 出 ， SO 為 一 種 弱 致 突 變 物 質 （ N ish et al.,1984 ）， 但 是 在 環 氧 化 物 中 EB（ 1.2- epoxybutene ）以 125 μ M 處 理 對 TK6 細 胞 24 小 時 ， 誘 發 hprt 基 因 突 變 率 為 2.5
×10- 6， 此 結 果 顯 示 EB 對 TK6 細 胞 之 致 突 變 性 明 顯 比 SO 小。文 獻 指 出 100 μ M 處 理 V79 細 胞 3 小時， hprt 基 因 突 變 率 增 加 為 原 來 的 <1 × 10-6（ Nish et al.,1984 ）。 Bastlova 於 1995 年 之 結 果 顯 示 ，SO 在 100μ M 劑 量 下 ， 誘 發 人 類 周 邊 血 液 淋 巴 球 細 胞 之 突 變 率 為 11.3 ×10- 6， 約 為 control 的 1.5 倍。而 且 在 本 實 驗 中，在 2 次 獨 立 實 驗 背 景 突 變 率 (1~3 × 10-6) 較 低 之 情 況 下 ， R- SO 與 S- SO 以 120 μ M 誘 發 hprt 基 因 突 變 率 （ 19∼ 27 ×10- 6） 約 為 c o ntrol 的 8∼ 10 倍 左 右 。 以 上 結 果 顯 示 SO 對 TK6 細 胞 所 造 成 致 突 變 率 比 V79 細 胞 與 人 類 周 邊 血 液 淋 巴 球 細 胞 高 出 很 多 。 因 此 SO 是 否 為 弱 致 突 變物質仍有待進一步證實。
曾 有 文 獻 指 出 ， TK6 細 胞 中 h p r t 基 因 背 景 突 變 率 約 在 2.5 ×1 0- 6(Cochrane and Skopek，1994)，正 常 人 之 背 景 突 變 率 在 1.4 ∼ 22.6 ×10-6 之 間 （ H ou et al.,1995）。 本 實 驗 TK6 細 胞 之 背 景 突 變 率 範 圍 在 1.0 ∼ 16.5 ×10- 6， 背 景 突 變 率 一 直 沒 有 很 穩 定 之 原 因，可 能 是 在 處 理 CHAT 降 低 背 景 突 變 率 時 ，CHAT 添 加 三 天 後 ， 需 加 入 CHT 處 理 一 天 ， 此 時 細 胞 應 再 度 回 到 正 常 代 謝 途 徑 （ de novo pathway 與 savage pathway）， 但 是 由 於 操 作 之 關 係 ， 延 遲 了 CHT 加 入 之 時 間 ， 導致細胞背景突變率升高之原因。
( 二 ) tk 基 因 突 變 率
hprt 基 因 為 在 X 染 色 體 上 可 以 偵 測 點 突 變 及 小 段 之 基 因 缺 失 ， 而 由 於 tk 基 因 位 於 體 染 色 體 上 ， 而 且 可 以 偵 測 到 大 段 基 因 缺 失 ， 因 此 本 研 究 首 次 探 討 SO 與 其 光 學 異 構 物 對 TK6 細 胞 中 tk 基 因 所 誘 發 之 突 變 率 。 結 果 顯 示 隨 著 SO 與 SO 光 學 異 構 物 劑 量 增 加 呈 現 良 好 劑 量 反 應 關 係 ， 因 此 證 明 SO 確 實 會 誘 發 tk 基 因 突 變 。 Von der Hude 於 1992 年 發 現 ， 以 S- SO 誘 發 Chinese Hamster V79 細 胞 株 產 生 S C E 的 頻 率 雖 然 略 高 於 R- SO ， 但 是 並 沒 有 達 到 統 計 上 之 顯 著 差 異 。 Watabe 於 1981 年 以 Ames test 對 細 菌 之 測 試 也 發 現 R - SO 與 S- SO 的 致 細 胞 突 變 率 沒 有 差 異 （ Watabe et al.,1981 ）。
在 一 次 的 獨 立 實 驗 之 結 果 顯 示 ， tk- total 背 景 突 變 率 為 5~22
×10- 6 之 狀 況 下 ， 沒 有 看 出 SO 不 同 光 學 異 構 物 對 TK6 細 胞 致 突 變 之 差 異。此 結 果 顯 示 R - SO 與 S- SO 有 可 能 對 TK6 細 胞誘發相同的 tk-toatl 基因突變率。
本 實 驗 結 果 顯 示 S O 與 SO 光 學 異 構 物 對 tk-fast 基 因 突 變 率 並 沒 有 達 到 統 計 之 顯 著 差 異，此 結 果 顯 示 R - SO 與 S- SO 誘 發 TK6 細 胞 中 tk -fast 基 因 之 突 變 率 有 可 能 沒 有 差 異 。 在 tk -slow 基 因 之 突 變 率 明 顯 高 出 tk-f a s t 基 因 ， 而 且 在 三 次 之 獨 立 實 驗 中 ， R - SO 造 成 TK6 細 胞 中 tk -s l o w 基 因 之 突 變 率 比 S- SO 高，顯 示 R - SO 造 成 TK6 細 胞 中 較 大 段 之 基 因 突 變。
研 究 顯 示 在 human N -ras codon 61 中 Adenine 結 構 上 的 N6 位 置 合 成 R - SO 與 S- SO 的 DNA adduct，經 細 菌 D N A 複 製 後 測 試 點 突 變 ， 結 果 發 現 只 有 在 S( 6 1，2 )位 置 上 之 DNA adduct 會 引 發 約 1.6 ％ 的 A→ G 突 變 ， 由 此 顯 示 不 同 光 學 異
構 物 所 造 成 之 DNA adduct 並 不 一 定 會 造 成 突 變 。SO 與 SO 光 學 異 構 物 細 胞 突 變 率 受 到 許 多 因 素 之 影 響 ， 包 括 去 毒 性 酵 素 之 作 用 、DNA adduct 形 成 之 能 力 、DNA 修 補 酵 素 對 DNA adduct 之 修 補 與 DNA adduct 被 D N A 聚 合 誤 認 之 機 率 所 影 響 ， 甚 至 在 突 變 基 因 旁 邊 之 基 因 序 列 也 會 影 響 基 因 突 變 率 (Latham et al.1993)。
tk -slow 基 因 突 變 率 與 細 胞 毒 性 有 相 同 趨 勢 （ R - SO ≧ S- SO ）， 雖 然 都 沒 有 達 到 統 計 上 之 顯 著 意 義 ， 但 是 tk-s l o w 基 因 突 變 率 主 要 在 測 試 較 大 段 的 基 因 突 變 或 缺 損 ， 因 此 顯 示 較 大 段 基 因 突 變（ tk-solw 基 因 ）率 比 hprt 或 tk-fast 基 因 的 突 變 率 高 。 雖 然 只 要 發 生 突 變 都 會 使 hprt 酵 素 或 tk 酵 素 功 能 喪 失 ， 但 是 因 為 在 tk 基 因 旁 邊 有 許 多 生 長 必 須 之 基 因 ， 因 此 SO 與 其 光 學 異 構 物 對 TK6 細 胞 所 造 成 大 段 基 因 缺 損 之 情 況，可 能 比 點 突 變 或 小 段 基 因 缺 損 之 影 響 較 大，尤其是 R - SO 對 TK6 細胞大段基因缺損之影響可能比 S-SO 重要。
因 此 本 實 驗 選 擇 hprt 基 因 與 tk 基 因 作 為 指 標 基 因，以 測 試 SO 光 學 異 構 物 之 致 突 變 性 ， 希 望 能 將 具 有 基 因 突 變 之 細 胞 收 集 ， 日 後 將 進 一 步 分 析 DNA 序 列 以 建 立 突 變 圖 譜 ， 探 討 SO 誘 發 hprt 基 因 突 變 之 主 要 突 變 位 置 與 所 發 生 的 突 變 種 類，以進一步瞭解 SO 與其光學異構物之分子突變機制。