第二章、 葉酸含量對腎間膈細胞 MES-13 與高油飲食小鼠腎臟促發炎細胞激素基因表現
第二節、 材料與方法
一、細胞實驗
自食品工業發展研究所生資中心/國家衛生研究院細胞庫 (新竹，台灣) 購入，
生資中心編號 BCRC 60366，細胞株名稱 SV40 MES 13，組織來源為 glomerular mesangial cells from an SV40 transgenic mouse。培養基為 RPMI medium 1640 (11875-085，Gibco), 95% 與 FBS 5% 以及 14 mM HEPES，培養條件為 37℃與 5%CO2環 境下。繼代培養方式為移除培養基，用 1×PBS 洗滌細胞 2 次後移去 PBS，加入 trypsin-EDTA 溶液，使其能 rinse 所有細胞後，移去 trypsin-EDTA，放在 37℃作用 5 分鐘後，輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入新鮮培養基，均勻混合後轉移至新 的培養瓶中。不同葉酸含量三組分別為: F0 為 RPMI medium 1640 without Folic Acid (27016-021，Gibco)、F1 為 RPMI medium 1640 與 F10 為 RPMI medium 1640 中額 外添加 9 倍葉酸粉末 (F8758-5G，Sigma)。
圖 2- 1. 細胞實驗設計
Figure 2-1. Cell culture experimental design
二、動物飼養
自國家動物中心購入 4 週大的 C57BL/6J 公鼠 24 隻，個別飼養在不鏽鋼鐵籠 中，自由攝食水及飼料。動物房維持溫度 23 ± 2 oC，光暗循環各 12 小時，給予 chow diet 適應 2 週後，依體重分為個組間無統計差異的三組，依飼料內葉酸含量不同分 為 HF-f0 組 (高油葉酸缺乏組，葉酸 0 mg/Kg)、HF-f1 組 (高油葉酸 1 倍組，葉酸 2 mg/Kg)、HF-f10 組 (高油葉酸 10 倍組，葉酸 20 mg/Kg)，不同葉酸高油組給予 30% (wt/wt) 高油飼料 (high fat diet, HFD)，實驗餵食 20 週後進行犧牲。
圖 2- 2. 動物實驗設計
Figure 2-2. Animal study experimental design
表 2- 1. AIN-93G 飼料組成表
Table 2-1. Ingredient of the modified AIN-93G diets.
成分 (g/kg diet) HF-f0 HF-f1 HF-f10
Casein (Sigma, C7078) 254 254 254
Cellulose (JRS PHARMA, Germany) 61 61 61
Sucrose (台糖精緻細砂) 321 321 321
Soybean oil (台糖) 10 10 10
Butter (安佳無水奶油) 290 290 290
AIN-93G mineral mix (MP Biochemicals) 44.5 44.5 44.5 AIN-93G vitamin mix w/o folic acid (MP Biochemicals) 12.5 12.5 12.5
L-cystine (Wako, Japan) 4 4 4
Choline (Sigma, C1879) 3 3 3
Folate, mg (Sigma, F7876) - 2 20
熱量 (kcal/1000g)
CHO/calorie (%) 25.6 25.6 25.6
Protein/calorie (%) 20.57 20.57 20.57
Fat/calorie (%) 53.83 53.83 53.83
三、腎間膈細胞之細胞激素測定
（一）eBioscience ELISA kit
【試劑】
1. Coating buffer：將 10x coating buffer 以一次水稀釋 10 倍。
2. Assay buffer：將 5x assay diluents buffer 以一次水稀釋 5 倍。
3. Wash buffer：添加 0.05% Tween 20 的 PBS
4. Capture antibody (1oAb)：Purified anti-mouse MCP-1, TGF-β, IL-5, IL-17A 5. Detection antibody (2oAb)： Biotin-conjugated anti-mouse MCP-1, TGF-β, IL-5,
IL-17A
7. 過氧化酵素基質液：Tetramethylbenzibine (TMB) 8. Stop solution：2N H2SO4
【方法】
於 96 孔盤中加入 100 μL 1oAb，於 4℃放置隔夜，以 PBST 清洗 4 次後以 200 μL assay buffer 進行 blocking 1 小時，清洗 5 次後加入以 assay buffer 稀釋的樣品及 標準品50 μL，反應 2 小時，清洗 6 次後加入 100 μL 2oAb 反應 1 小時，清洗 7 次 後再加入100 μL avidin-HRP，反應 30 分鐘後，清洗 8 次後加入 100 μL TMB，呈 色至適當顏色時，加入50 μL stop solution，測定 450 nm 吸光值。
（二）BioLegend ELISA kit
【試劑】
1. Coating buffer：將 5x coating buffer 以一次水稀釋 5 倍 2. Assay buffer：將 5x assay diluents buffer 以 PBS 稀釋 5 倍 3. Wash buffer：添加 0.05% Tween 20 的 PBS
4. Capture antibody (1oAb)： Purified anti-mouse IL-6, IL-10, IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-13
5. Detection antibody (2oAb)：Biotin-conjugated Purified anti-mouse IL-6, IL-10, IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-13
6. BioLegend Avidin-Horseradish Peroxidase (HRP)：以 assay buffer 稀釋 1000 倍 7. 過氧化酵素基質液：Tetramethylbenzibine (TMB)
8. Stop solution：2N H2SO4
【方法】
於 96 孔盤中加入 100 μL 1oAb，於 4℃放置隔夜，以 PBST 清洗 4 次後以 200 μL assay buffer 進行 blocking 1 小時，清洗 4 次後加入以 assay buffer 稀釋的樣品及
後再加入100 μL avidin-HRP，反應 30 分鐘後，清洗 5 次後加入 100 μL TMB，呈 色至適當顏色時，加入50 μL stop solution，測定 450 nm 吸光值。
四、腎臟組織基因表現量分析
（一）總 RNA 之抽取
取約 0.1 g 腎臟，以 TRIzol reagent 均質至無大塊組織後，以 12000 g 離心 1 分 鐘，取上清液至滅菌的管內，加入等體積的絕對酒精後劇烈震盪，並將液體注入 Zymo-Spin IIC Columnin 中，置於 collection tube 上，以 12000 g 離心 1 分鐘後將 collumn 移到新的 collection tube 上，加入 RNA wash buffer 後離心 1 分鐘，直接在 膜上加入 DNase I cocktail 並置室溫反應 15 分鐘，離心 30 秒後加入 RNA prewash buffer 離心 1 分鐘，倒掉 collection tube 中的液體，重複此步驟。加入 RNA wash buffer 並離心 1 分鐘，倒掉管中的液體後再離心 2 分鐘以完全去除 wash buffer，之 後將 collumn 移到 RNase-free tube 上，加入 DNase/RNase free-H2O 於膜上，離心 1 分鐘後，取得總 RNA 溶液，以 NanoDrop 2000 Spetrophotometer 測定 RNA 濃度。
【試劑】
Direct-zolTMRNA MiniPrep kit (Cat. No 2052, Zymo Research, USA)
(二) 總 RNA 反轉錄成 cDNA
使用反轉錄試劑套組(High Capacity cDNA Archive Kit)，將取得的總 RNA 溶液 以 DEPC 水稀釋至 0.2 μg/μL 後取 10 μL 的 RNA，加入 10X RT buffer 2 μL、25X dNTP mixture 0.8 μL、10X RT random primer 2 μL、無菌水 4.2 μL 與 RTase 1 μL，
總體積為20 μL(含 RNA 樣品)，進行反轉錄，條件為 25°C10 分鐘，37°C 反應 120 分鐘，85°C5 秒鐘，最後冷卻至 4°C。
【試劑】
反轉錄試劑套組(High Capacity cDNA Archive Kit, P/N: 4368814, Applied Biosystems, USA)
(三) Real-time qPCR
利用 Taqman Universal PCR Master Mix 試劑分析，以 GAPDH 做為 internal control。將 cDNA 稀釋成 10 ng/μL 後取 10 μL 的樣品，加入 Taqman Universal PCR Master Mix 12.5 μL、Probe/primer mixture 1.25 μL、無菌水 1.25 μL，總體積為 25 μL，注入 96-well reaction plate 並封膜，將 plate 短暫離心後上機。上機條件為 50°C 2 分鐘 (stage 1)、95°C10 分鐘 (stage 2)、95°C15 秒 (stage 3)、60°C1 分鐘 (stage 4)，再回到 (stage 3)，重複 55 個循環。
【試劑】
1. TaqmanR Universal PCR Master Mix (2X, Part. No. K00861, Applied Biosystems) 2. Probes from Applied Biosystems, USA
a. TNF-α (Mm00443260_g1) b. IL-6 (Mm00446191_m1) c. IL-1β (Mm01336189_m1) d. MCP-1 (Mm00441242_m1) e. TGF-b1(Mm01178820_m1) f. GAPDH (Mm99999915_g1)
3. MicroAmpRFast 96-well reaction plate (Part No. 4346907, Applied Biosystems) 4. Optical Adhesive Covers (Part No. 4360954, Applied Biosystems)
5. ABI StepOnePlusTMReal-Time PCR System
【儀器】
核酸即時定量偵測系統(BioRad MyiQ)
(四) 計算
Ct 值(Threshold cycle)：每個試驗的螢光訊號到達設定閾值所經過的循環數，若目 標基因在樣本中的含量越多，到達閾值所需的循環數越少，Ct 值越小。
1. Ct(目標基因) -Ct (Internal control) = ΔCt(sample) 2. ΔCt(sample)–ΔCt(mean of control) = ΔΔCt
3. 基因表現量以 2–ΔΔCt表示
五、統計方法
實驗數據以 Mean ± SD 表示，使用 Student’s t-test 或利用 SAS 9.3 軟體進行 ANOVA 分析，以 Duncan's multiple range test 進行多重比較。以*p < 0.05 表示顯著 差異與 0.05 < #p < 0.1 表示有趨勢。