第一節、前言
台灣國人膳食葉酸含量與血漿葉酸含量呈顯著正相關 (Chen et al., 2005)，而 公衛研究調查結果指出飲食葉酸攝取量與腎絲球過濾率呈負相關 (Hassan, 2015)。
前一章實驗結果得知，葉酸缺乏促使小鼠腎間膈細胞 MES-13 分泌顯著較多的 IL-6 與 MCP-1，且餵食高油飲食 20 週的 C57BL/IL-6J 小鼠腎臟組織的 IL-IL-6 基因表現量 與血清葉酸含量呈顯著負相關。而高油飲食誘發肥胖之高血糖現象易引起腎功能 異常 (Reena et al., 2016)。長期高油飲食促使 C57BL/6J 小鼠腎臟近曲小管、足細胞 與腎間膈細胞的 AMPK 活性降低，最終導致過量脂質堆積於當中，而產生肥胖相 關的腎臟疾病 (Mount et al., 2015)。綜合以上，葉酸對於腎臟免疫可能扮演了抗發 炎的角色，而高油飲食具有誘發腎損傷可能性。因此，本研究設計不同葉酸含量之 高油飲食餵食小鼠，觀察對小鼠腎臟的影響。
台灣末期腎臟疾病罹患率甚高，與誤食含具腎毒性馬兜鈴酸之中草藥有關 (Lai et al., 2009)。有研究為了模擬人類馬兜鈴酸致腎損傷情形，將馬兜鈴酸 (10 mg/kg) 以靜脈注射方式連續 35 天給予 Wistar 大鼠，10 天後發現血液肌酸酐含量 與尿蛋白皆顯著增加，建立了一個短期誘發腎纖維化的動物模式 (Debelle et al., 2002)。過去研究多以注射方式投予馬兜鈴酸誘發腎損傷為主要動物模式，較少添 加於飼料中讓實驗動物自由攝食的方式誘發腎損傷。而本實驗將馬兜鈴酸添加於 飼料中以加速小鼠腎損傷的發生。
因此，本研究藉由不同時間點添加馬兜鈴酸分為兩部分探討葉酸含量對高油 飲食小鼠腎損傷的影響。實驗一: 添加馬兜鈴酸於 16 週 (27 週齡) 不同葉酸高油 飲食小鼠飼料，觀察腎臟損傷情形。實驗二: 觀察長期不同葉酸含量之高油飲食誘 發肥胖與高血糖現象對小鼠腎損傷情形，並於實驗 48 週 (59 週齡) 添加馬兜鈴酸 加速腎損傷。
第二節、材料與方法
一、動物飼養
自國家動物中心購入 6 週大的 C57BL/6J 公鼠 51 隻，個別飼養在不鏽鋼鐵籠 中，自由攝食水及飼料。動物房維持溫度 23 ± 2 oC，光暗循環各 12 小時，每週固 定記錄小鼠體重。給予 chow diet 適應 4 週，接續適應粉狀 AIN-93G 飼料 1 週後，
依體重開始分三組 35.3% (w/w)高油飼料 (high fat, HF) 分別含葉酸 0 mg/Kg 的高 油葉酸缺乏組 (HF-f0/AA)、葉酸 2 mg/Kg 的高油葉酸 1 倍組 (HF-f1/AA 組)、葉 酸 20 mg/Kg 的高油葉酸 10 倍組(HF-f10/AA)和一組 1 倍葉酸含油脂 7% w/w 的正 常油脂組 (NF-f1 組)。實驗一小鼠於 27 週齡添加 8 mg/Kg/day 馬兜鈴酸 (AA, aristolochic acid, A9451, Sigma)觀察生命期，於死亡時立即採取腎臟與肝臟以組織 切片觀察組織型態，分析肝臟脂質含量；實驗二為未添加馬兜鈴酸小鼠繼續餵飼至 59 週齡添加馬兜鈴酸連續三週。
圖 3- 1. 實驗設計
Figure 3-1. Experimental design
表 3- 1. AIN-93G 飼料組成表
Table 3-1. Ingredient of the modified AIN-93G diets.
成分 (g/kg diet) HF-f0 HF-f1 HF-f10 NF-f1 /AA /AA /AA /AA Corn starch (Samyang Genex Corporation, Korea) - - - 529.5 Casein (Sigma, C7078) 264.6 264.6 264.6 200 Cellulose (JRS PHARMA, Germany) 54 54 54 50 Sucrose (台糖精緻細砂) 33.1 33.1 33.1 100
Fructose 231.5 231.5 231.5 -
Soybean oil (台糖) 10 10 10 70
Butter (安佳無水奶油) 342.8 342.8 342.8 - AIN-93G mineral mix (MP Biochemicals) 44.5 44.5 44.5 35 AIN-93G vitamin mix w/o folic acid (MP Biochemicals) 12.5 12.5 12.5 10 L-cystine (Wako, Japan) 4 4 4 3 Choline (Sigma, C1879) 3 3 3 2.5 Folate, mg (Sigma, F7876) - 2 20 2
熱量 (kcal/1000g) 5292 5292 5292 3948
CHO/calorie (%) 20 20 20 63.8
Protein/calorie (%) 20 20 20 20.2
Fat/calorie (%) 60 60 60 16.0
二、血清葉酸濃度測定
本研究以 Lactobacillus casei (ATCC 7469)微生物法測定葉酸含量(Grossowicz et al., 1981)。葉酸為 Lactobacillus casei 生長之必須營養素，菌生長與繁殖速度與 樣品中葉酸的含量成一定的對應關係，利用此關係可對樣品中葉酸進行定量。
(一) 菌液製備
已滅菌之養菌管中加入 5 mL 培養液，取 200 µL 冷凍之 Lactobacillus casei 至管中，37°C 震盪培養並接種 2 代。使用前觀察養菌管底有白色的 pellet，取懸
浮液 1 mL 至微量離心管，以 12000 rpm 離心 20 秒，倒掉上清液，加入 1 mL 0.9% NaCl 洗菌(此步驟重複 3 次)；最後加入 1 mL 0.9 % NaCl 懸浮菌為菌液，
以 Folic acid casei medium 將菌液稀釋 2000 倍。
【試劑】
1. 培養液：將 1.9 g Lactobacilli Broth AOAC (290110, DIFCO) 粉末溶於 50 mL 一 次水，經 121°C 滅菌 15 分鐘，存於 4°C。
2. 0.9 % NaCl：秤取 0.45 g NaCl，加入 50 mL 一次水溶解，121°C 滅菌 30 分鐘。
3. Folic acid casei medium (1259786, BD)：秤 4.7 g Folic acid casei medium 粉末溶 於 50 mL 二次水，加入 25 mg L-Ascorbic acid (A7506, Sigma)，121°C 滅菌 5 分鐘，使用時新鮮配。
(二) 葉酸測定
於滅菌 96 孔盤中加入以 Phosphate buffer 稀釋之樣品與標準品，加入等體積 以 Folic acid casei medium 稀釋之菌液後蓋上無菌蓋，37°C 培養 16~18 小時，測 定 620 nm 吸光值，每個樣品做三重複，全程以避光進行。
【試劑】
1. Phosphate buffer：1 倍無菌 PBS 加 0.05% L-Ascorbic acid，121°C 滅菌 5 分鐘。
2. 葉酸標準品：用二次水將葉酸粉末(F8758, Sigma)配成 0.5 mg/mL，稀釋至 200 μg/mL 於-80°C 保存，測定前稀釋至 0.5 ng/mL 使用。
三、血糖分析
實驗動物禁食 12 小時，空腹眼窩採血。採用市售試劑組 (Randox Cat. No.
GL2623)。利用 glucose oxidase 與 peroxidase 的作用所產生的紫紅色色素，藉由測 量此色素之吸光值，計算 glucose 之含量。加入經過系列稀釋的標準液 (100 mg/dL) 及以 dd H2O 稀釋 8 倍之血清 10 μL 於 96 孔盤中，再加入 250 μL 之反應試劑，於 37oC 反應 10 分鐘後測定 490 nm 之吸光值。
四、血脂質分析
實驗動物血脂質分析皆禁食 12 小時，空腹眼窩採血。
1. 血清三酸甘油酯含量測定
採用市售試劑組 (Randox Cat. No. TR 213)，先將緩衝液 (含有 pipes buffer, pH 7.6, 4- chlorophenol, magnesium ions) 與 Enzyme Reagent (含有 4-aminophenazone, ATP, lipase, glycerol-kinase, glycerol-3-phosphate oxidase, peroxidase) 混合均勻配成 反應試劑，再加入系列稀釋的標準溶液 (12.5-200 mg/dL) 及以二次水稀釋 4 倍之 血清10 μL 於 96 孔盤中，接著加入 250 μL 之反應試劑，於 37 oC 反應 10 分鐘後 測定 490 nm 之吸光值。
2. 血清膽固醇含量測定
採用市售試劑組 (Randox Cat. No. CH 201)，將經系列稀釋的標準溶液 (12.5-200 mg/dL) 及以二次水稀釋 4 倍之血清 10 μL 於 96 孔盤中，接著加入 250 μL 之 試劑組試液(含 4-aminoantipyrine, phenol, peroxidase, cholesterol esterase, cholesterol oxidase, pipes buffer, pH 6.8)，於 37 oC 反應 10 分鐘後測定 490 nm 之吸光值。
五、肝臟脂質萃取與測定
採用 Folch 等人 (1957) 的方法，取約 0.2 g 肝臟置於 20 cm 樣品瓶內，以剪刀 剪碎組織後加入少量萃取溶劑(CHCl3：CH3OH = 2：1，v/v)後用均質機磨碎，以 1 號 濾紙過濾後用萃取溶劑定容至 10 mL。取少量脂質萃取液至 10 cm 玻璃試管內，置於 通風除使溶劑揮發後以試劑組分析 (同第四點血清脂質分析)。
六、血液與腎臟組織 galectin-3 含量測定
選用 BOSTER Immunoleader 的 mouse galectin-3 ELISA Kit (EK0765)。於 96 孔 盤中加入以 sample diluent buffer 稀釋的樣品及標準品 100 μL，於 37℃放置 90 分 鐘，拍打 4 次後加入 100 μL Biotinylated anti-mouse Galectin-3 antibody working solution ，於 37℃放置 60 分鐘，以 PBST 放置孔盤中一分鐘，重複清洗 3 次且拍 乾後加入 100 μL ABC working solution，於 37℃放置 30 分鐘，清洗 5 次後加入 90 μL TMB 呈色劑，於 37℃放置 30 分鐘且避光，呈色至適當藍色時，加入 100 μL TMB stop solution，測定 450 nm 吸光值。
七、組織細胞單離培養
（一）脾臟細胞之取得與培養
【試劑】
1. 裂殖素：ConA 1.25 μg/mL (Concanavalin A, Sigma C-5275) LPS 10 μg/mL (Lipopolysaccharide, Sigma L-2654)
2. TCM/RPMI 培養液：20 mL 之 TCMTM 代用血清 (Celox laboratories, Inc.) ， 加入 1L 之 RPMI-1640 medium (Gibco 11875)，並加入 10 mL 之三合一抗生素 (Sigma A-5955；成分包含 10000 units/mL penicillin、10 mg/mL streptomycin 及 25 μg/mL amphotericin)。
3. HBSS 緩衝液：HBSS 緩衝液粉末 (Sigma H2387) 溶於去離子水中，並定容 為 1L，經 121oC，30 分鐘滅菌後，加入 10 mL 三合一抗生素 (Sigma A-5955)，
再以 7.5% NaHCO3 將顏色調整為桃紅色。
4. ACK lysing buffer：NH4Cl 8.29 g、Na2EDTA 37.2 mg、KHCO3 1.0 g，加入滅 菌水定容至 1L，再以 0.22 μm filter 過濾。
【方法】
小鼠採用 CO2窒息法安樂死，取出脾臟置於有 3 mL TCM/RPMI 培養液的 3 cm dish 中。以無菌針筒尾端將脾臟磨碎，將上層細胞懸浮液吸取至 15 mL 離心管 中，再加入 3 mL 的 HBSS 緩衝液至 dish 中，繼續磨碎剩餘組織，並吸取至離心管 中，最後用 3 mL HBSS 緩衝液沖洗 dish，收集殘留細胞。細胞懸浮液以 300 x g 離 心 10 分鐘後，倒去上清液，再加入 ACK lysing buffer 去除紅血球，靜置 1 分鐘後 加入 3 mL HBSS 緩衝液，以 300 x g 離心 10 分鐘後，用 HBSS 緩衝液洗 3 次，洗 去 ACK lysing buffer。以 2 mL TCM/RPMI 培養液使成細胞懸浮液。計算細胞總 數，將細胞密度調整至 1x107 cell/mL，取 500 μL 培養於 48 孔盤中，加入 500 μL 含有 ConA 或 LPS 的 TCM/RPMI 培養液，使最終細胞密度為 5 x 106 cell/mL，培 養 48 小時後，收取上清液分析細胞激素。
八、組織、血清與細胞之細胞激素測定
同第二章第二節腎間膈細胞之細胞激素測定。
九、尿液 creatinine 含量測定
採用市售試劑套組 (BioAssay Systems DICT-500)，將 50μL RA、50μL RB 與 100μL 一次水混勻配成反應試劑。將收集到的小鼠尿液樣本與標準樣品個取 5μL 於 96 孔盤。分別於加入反應試劑後和第 5 分鐘個測一次 520 nm 吸光值，再將其 吸光值代入算式計算樣本中 creatinine 含量。
尿液 creatinine 含量計算:
十、尿液或腎臟組織蛋白質測定
為定量尿液或腎臟組織蛋白質含量，本研究利用 Bio-Rad Bradford 之蛋白質定 量法進行測量 (Bradford, 1976)，其原理為 Coomassie blue dye 中的苯環與硫酸根，
與蛋白質發生親和作用而呈色。標準樣品選用 BSA (bovine serum albumin, Sigma, A4503)，以二次水 2 倍稀釋尿液樣本或 100 倍稀釋腎臟組織樣本和系列稀釋標準 樣本後取 10 μL/well 於 96-well ELISA plate，再加入 Bio-Rad protein assay dye 試劑 200 μL，室溫下等候 5 分鐘，以 ELISA reader 測 620 吸光值，利用標準曲線計算尿 液或腎臟組織蛋白質濃度。
十一、血清 BUN 測定
採用市售試劑套組 (BioAssay Systems DIUR-500)，將 100μL RA 與 100μL RB 混勻配成反應試劑。將血清樣本、標準樣品與二次水 (blank) 個取 5μL 於 96-well ELISA plate 後。加入反應試劑於室溫等待 20 分鐘測 520 nm 吸光值，再將其吸光 值代入算式計算樣本中 creatinine 含量。
十二、組織染色切片
肝臟與腎臟組織部分泡入 10%的甲醛中，委託台大獸醫系與台大附設醫院實 驗動物中心進行石蠟包埋切片，以 PAS 與 H&E 染色觀察肝臟脂質堆積情形與腎 臟受損情形和型態變化。
十三、統計方法
實驗數據以 Mean ± SD 表示，使用 Student’s t-test 或利用 SAS 9.3 軟體進行 ANOVA 分析，以 Duncan's multiple range test 進行多重比較。以*p < 0.05 作為顯著 差異，0.05 <# p < 0.1 為趨勢性的差異。**p < 0.01，存活率分析利用 SAS 的 Kaplan-Meier 法，以 Wilcoxon test 分析。
第三節、結果與討論 (實驗一)
(一) 不同葉酸含量之高油飲食小鼠添加 AA 後的體重與生命期
本實驗給予不同葉酸含量高油飲食 16 週後，高油飲食組體重顯著較正常油脂 組較 重 ，顯示高油飲食成功誘導小鼠肥胖。 之後開始每天給予馬兜鈴酸 (8 mg/kg/day) 以誘發小鼠腎損傷，並觀察不同葉酸含量對小鼠體重變化與生命期的 影響。結果如圖 3-2 所示給予馬兜鈴酸後的四組體重持續下降，且正常油脂組下降 幅度最為明顯，而高油飲食三組體重之間皆無顯著差異。正常油脂組小鼠因體重最 先下降至 20 公克以下而最早出現死亡現象，而後為高油葉酸缺乏組、高油葉酸一 倍組與高油葉酸十倍組 (圖 3-3)，高油飲食組中葉酸缺乏組最早出現死亡現象。
研究指出，馬兜鈴酸藉由調控 3T3-L1 脂肪細胞的 Akt 與 ERK 1/2 代謝路徑中 PPAR-γ 與 C/EBP-α 的表現，進而抑制脂質的堆積。動物實驗也進一步證實，馬兜
研究指出，馬兜鈴酸藉由調控 3T3-L1 脂肪細胞的 Akt 與 ERK 1/2 代謝路徑中 PPAR-γ 與 C/EBP-α 的表現，進而抑制脂質的堆積。動物實驗也進一步證實，馬兜