材料與方法

本研究使用的實驗動物均為雄性Sprague-Dawley (SD)品系大鼠。SD 大鼠購買 自樂斯科(BioLASCO)生物科技股份有限公司。每隻大鼠自運抵實驗室後，即飼養 在台灣大學生命科學館的動物房內，並至少經過一週的適應之後才開始進行實 驗。每 2 至 3 隻大鼠飼養在同個鼠籠內，並充分提供食物及飲水。動物房的光暗 週期各為12 小時，恆溫控制在 23 ± 2°C。所有實驗動物操作均遵照台灣大學實驗 動物管理與使用規範。

2.2.2 動物模式建立

本研究使用的神經病變性疼痛動物模式為大鼠的坐骨神經分支選擇性傷害(簡 稱SNI)模式(Decosterd and Woolf, 2000)。進行 SNI 手術前，以腹腔注射 65 mg/kg pentobarbital 誘導麻醉後，將大鼠的左後腳剃毛，固定在鼠板上。以 70%酒精及優 碘先後消毒後，切開皮膚與肌肉，暴露出坐骨神經及其分支。以玻璃鉤仔細分出 脛神經及腓總神經，在遠心端處以6-0 絲線結紮並切斷，保留腓腸神經完整。手術 後依序縫合肌肉與皮膚，以優碘消毒後，將大鼠放在熱燈下維持體溫，等待其甦 醒。將手術後大鼠送回動物房後，連續三天每日檢查傷口復原情況。我們另作假 手術(Sham)的老鼠作為對照組，假手術的作法與 SNI 大致相同，惟在暴露坐骨神 經後即縫合，並未傷害坐骨神經及其分支。

2.2.3 觸感痛行為測定

為了確定SNI 大鼠是否具有觸感痛，我們使用購買自 North Coast Medical 公

司的 von Frey hairs 來測定大鼠的觸覺閾值。八週齡的雄性 SD 大鼠(體重約 300 克)，隨機分配為 SNI 組(n = 6)及 Sham 組(n = 6)。我們選用 8 支不同克數的 von Frey 尼龍製細毛棒，分別為0.4、0.6、1、2、4、6、8、15 克。行為測試前，大鼠先移 至透明壓克力籠中，其底部為不鏽鋼製網格地板，可供細毛棒穿過並刺激大鼠的 後腳掌外側部位，即腓腸神經支配的區域。為避免大鼠在測試籠中躁動，至少需 在開始測試前15 分鐘放入大鼠，使其適應環境並保持清醒靜止的狀態。行為測試 開始時，先以2 克的細毛棒接觸後腳掌，再使細毛棒彎曲以傳遞足夠的刺激強度，

並保持彎曲狀態6 至 8 秒，若大鼠快速地縮起後腳掌，間隔約 5 秒後則以 1 克的 細毛棒刺激；若大鼠對2 克的細毛棒刺激沒有反應，間隔約 5 秒後繼續以 4 克的 細毛棒刺激；此即為up-down 方式(Dixon, 1980)。當找出大鼠後腳掌對細毛棒刺激 的縮腳克數時，在此克數刺激上下再反覆測試4 次，可得到閾值刺激的反應模式，

查Chaplan et al. (1994a)的附表後將此模式的值帶入下述公式計算：

50% g threshold = (10^{[Xf + κδ]}) / 10000

Xf 為最後一次測試所使用的 von Frey hair 克數(換算為 log 表示)；

κ 為閾值刺激模式的查表值；

δ 為所選用 von Frey hairs 克數差的平均值(換算為 log 表示)，在此為 0.225。

每隻大鼠的左右後腳掌各作三次測定，取其平均值作為 50%縮腳閾值的所需 強度(克數)。為評估神經損傷疼痛的發展過程，不同處理組的大鼠皆在手術前 1 日，

手術後第3、5、7、14 日等測定機械性觸感痛程度。

2.2.4 熱痛覺過敏行為測定

為了確定SNI 大鼠是否具有痛覺過敏的現象，我們使用輻射熱(radiant heat)刺

激來測定大鼠的熱痛覺過敏行為(Hargreaves et al., 1988)。Plantar Analgesia Meter 三個區域。中間為灰色牆面的中性區(neutral room)，長 10 公分，並有兩扇拉門通 往左右的選擇區。兩側的選擇區除了大小相同外(長均為 30 公分)，其牆面(黑白直 條紋或橫紋)與地板(光滑或有均勻分布的孔洞)可將此二區域作一明顯的區別。八 週齡的雄性SD 大鼠(體重約 300 克)，隨機分配為 SNI 組(n = 6)及 Sham 組(n = 3)，

大鼠在手術後7 天進行 CPP 實驗。CPP 實驗包括連續三天的環境適應期，第四天 的藥物與環境配對及第五天的位置偏好選擇。CPP 實驗皆在白天期間進行(上午 9

點至下午4 點)。在前三天的環境適應期，每隻大鼠每天進入 CPP 行為箱中自由探 索 30 分鐘，並無使用拉門阻擋。在第三天的自由探索中，前 15 分鐘記錄大鼠在 不同區域的停留時間，作為制約前紀錄。若在此制約前紀錄中受測鼠有明顯的偏 好某個區域(停留超過 80%時間，即 12 分鐘)，此受測鼠將排除不作後續實驗。在 第四天的藥物與環境配對中，上午時受測鼠以腹腔注射生理食鹽水(vehicle，體積 為1 ml/kg)後，隨機放入某個選擇區中 30 分鐘，並將拉門關閉。4 小時後，受測鼠 以腹腔注射GBP (100 mg/kg)後，隨即放入另一個選擇區中 30 分鐘，並將拉門關 閉。第五天，即注射GBP 20 小時後，讓受測鼠在 CPP 行為箱中自由活動，並記 錄15 分鐘大鼠在不同選擇區中的停留時間。

2.2.6 GBP 藥效測試

為測試GBP 的止痛效果，我們選用不同的劑量，並配合觸感痛行為測試，來 確定 GBP 的止痛藥效。試藥級(純度 98%以上)的 GBP 購買自 TCI 公司(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd; Japan)，使用前溶於無菌生理食鹽水中。我們以生理食 鹽水、10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg 及 100 mg/kg 五種劑量測試 SNI 大鼠的縮腳 閾值變化，每個劑量用4 隻雄性 SNI 大鼠(體重約 300 ~ 400 克)為測試對象。測試 的時程共3 小時，分別在打藥前及打藥後 30、60、90、120、150 及 180 分鐘分別 測試大鼠的縮腳閾值，每隻大鼠在每個時間點共測 3 次，每次測量間隔時間為 3 分鐘(Park et al., 2010)。

2.2.7 運動平衡感測試

為確認我們所使用的劑量是否會使大鼠有運動失調的現象，我們也測量了大 鼠在滾筒式跑步機上的平衡感與動作協調性(Hamm et al., 1994)。滾筒式跑步機 (single lane rotarod, MK-630B)購買自日本的 Muromachi Kikai 公司。我們一樣採用 生理食鹽水、10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg 及 100 mg/kg 五種劑量來測試大鼠在

滾筒式跑步機上的停留時間，每個劑量用4 隻雄性 SNI 大鼠(體重約 300 ~ 400 克)。

測試的時間點如同GBP 藥效測試，在給藥前及給藥後每隔 30 分鐘測試，一直到 3 小時後。滾筒式跑步機的測試條件為定速15 rpm 的轉速，看大鼠能否在滾筒上維 持 150 秒鐘而不掉落。若大鼠在 150 秒內掉落則記錄掉落時間；若大鼠持續跑步 到150 秒而不掉落，就停止測試並將大鼠放回籠子中。每個時間點每隻大鼠共測 3 次，每次測試間隔時間為3 分鐘(Park et al., 2010)。

2.2.8 統計分析

本研究的統計分析，均使用SigmaStat 3.1 的軟體進行計算。在觸感痛測定的 結果分析，SNI 組及 Sham 組的同側(手術側)及對側腳掌的縮腳閾值分別以重複取 樣單因子等級變異數分析(one-way repeated measures of ANOVA on ranks)進行統計 分析，若結果顯示有差異時再進行事後(post hoc)檢定，事後檢定採用 Tukey 方式 檢定，並設p < 0.05 為顯著差異。單側腳掌的閾值變化皆對手術前的基準值作比 較。在熱痛覺過敏測定的結果分析，SNI 組及 Sham 組的同側(手術側)及對側腳掌 的縮腳時間差分別以單因子重複取樣變異數分析(one-way repeated measures of ANOVA)進行統計分析，若結果顯示有差異時再進行事後檢定，事後檢定採用 Tukey 方式檢定，並設 p < 0.05 為顯著差異。在自發性疼痛的結果分析，SNI 組及 Sham 組的不同環境配對結果以 paired t-test 檢定，並設 p < 0.05 為顯著差異。在 GBP 藥效試驗的結果分析，同一劑量的不同時間縮腳閾值變化，採用與觸感痛測 定的相同分析方法，而事後檢定為不同時間點對施打藥物前的基準值作比較，並 設p < 0.05 為顯著差異。在運動平衡感的結果分析，以單因子重覆取樣變異數分析 (one-way repeated measures of ANOVA)進行檢定，若有差異時再進行事後檢定，採 用Tukey 方式，以 p < 0.05 設為顯著差異。統計分析之後的結果，若無特別註明，

皆以平均值(mean) ± 標準差(standard deviation, SD)呈現。