4.1 前言
神經病變性疼痛是體感覺系統異常的結果，臨床上不易治療神經病變性疼 痛，是因為對這種疼痛的機制了解仍有限，特別是腦部的反應。儘管臨床上有一 些藥物可以用來緩解神經病變性疼痛，如 gabapentin (GBP)，但我們對 GBP 的作 用位置也不是很確定。上一章我們使用正子造影(FDG-PET)來偵測觸感痛狀態下，
神經損傷大鼠腦部的葡萄糖代謝率變化，以及GBP 對腦中葡萄糖代謝率的影響。
我們發現觸感痛會使神經損傷大鼠島狀皮質(IC)的葡萄糖代謝率增加，而 GBP 會 抑制內側前額葉皮質(mPFC)及前扣帶迴皮質(ACC)的葡萄糖代謝率，卻不會抑制 在IC 增加的葡萄糖代謝率，這可能跟 GBP 的止痛效果有關；但 FDG-PET 的空間 解析度較差，無法提供細胞層級的資訊，且這些核區的代謝率變化是來自於神經 元或膠細胞的活性改變，這個問題需要用不同的方法來研究。
細胞外訊息調節激酶(extracellular-signal regulated kinases, ERK)是部分神經元 細胞質裡存在的一種激酶，當神經元受到適當的外界刺激，這種激酶會活化(磷酸 化，pERK)，既而進入細胞核啟動特定基因的轉錄作用。有研究指出 pERK 可以作 為中樞神經系統裡的突觸可塑性標誌(Gao and Ji, 2009)。在神經損傷大鼠的腦中，
當給予觸感痛刺激時，腹內側前額葉皮質(ventromedial PFC, vmPFC)、ACC 及 IC 都有顯著的pERK 大量表現(Alvarez et al., 2009; Devoize et al., 2011; Wei and Zhuo, 2008)。除了 pERK 外，一種原致癌基因的蛋白質產物 c-Fos，在中樞神經系統內也 可以作為神經元活化的標誌。當給予動物疼痛刺激時，腦中邊緣系統(limbic system) 裡也有大量的c-Fos 表現(Gibney et al., 2010; Lei et al., 2004; Zhang et al., 2014)。因 此pERK 及 c-Fos 等分子標誌，被認為與腦中處理痛覺訊息有關(Gao and Ji, 2009)。
ERK 是一種內生性(endogenous)的激酶，當神經元受到適當的外界刺激，即使時間 短到只有1 分鐘，活化的 pERK 即可表現(Ji et al., 1999)；這麼快速的活化也顯示 pERK 可以調節細胞的興奮度而不用等到基因表現出新蛋白。相較之下，c-Fos 蛋 白的表現就要較長的時間，當神經元受到適當的外界刺激，最快要30 分鐘後 c-Fos 蛋白才會表現，而在刺激後1 到 2 小時間有最大的表現量(Hunt et al., 1987; Williams et al., 1990)。因此這兩種分子標誌可能顯示當動物受到疼痛刺激後，腦中神經元在 不同時間序列(time course)上的反應。
為了解神經損傷大鼠在觸感痛狀態下，腦部的哪些區域細胞會活化，以及在 GBP 止痛作用下，這些活化的細胞有什麼變化，我們使用 pERK 及 c-Fos 來偵測腦 中的神經元活性。如同上一章的實驗設計，我們先給予神經損傷大鼠觸感痛刺激，
接著以免疫組織染色的方式標示pERK 及 c-Fos 在腦中的表現，最後我們比較給予 GBP 止痛處理後，相關活化區域這兩種分子標誌的表現情形。
4.2 材料與方法 4.2.1 動物模式
六週齡的雄性 SD 大鼠(體重約 200 g)購買自樂斯科公司，在動物房中飼養一 週後進行實驗。本研究共使用32 隻大鼠，隨機分配為實驗組(SNI, n = 16)及對照組 (Sham, n = 16)。我們採用 SNI 模式(Decosterd and Woolf, 2000)為神經病變性疼痛模 式(參考第二章)，作法概述如下：在 50 mg/kg pentobarbital 誘導麻醉下，將大鼠左 後腳的坐骨神經分支脛神經及腓總神經結紮並切斷，保留腓腸神經完整，而後分 別縫合肌肉與皮膚；對照組則是暴露坐骨神經及分支後，維持完整並縫合肌肉與 皮膚。
4.2.2 觸感痛測試
為確定SNI 手術後，大鼠具有神經病變性疼痛，我們使用 von Frey hairs 測試 大鼠的縮腳閾值。行為測試一樣採用up-down 方法(Dixon, 1980)進行，我們選用 8 支不同克數的von Frey 尼龍製細毛棒，分別為 0.4、0.6、1、2、4、6、8、15 克。
行為測試由2 克細毛棒開始，待找到會使大鼠縮腳的克數之後，再反覆測試四次。
反應紀錄一樣經由計算得到大鼠的50%縮腳閾值(Chaplan et al., 1994a)。每隻大鼠 的左右後腳掌各作三次測定，取其平均值作為 50%縮腳閾值的克數。為評估神經 色實驗的大鼠隨即接受腹腔注射65 mg/kg pentobarbital 麻醉，並放回飼養籠(home cage)中，10 分鐘後則進行心臟灌流；進行 c-Fos 免疫染色實驗的大鼠，在機械性 刺激結束後，隨即放回飼養籠中，並於刺激結束80 分鐘後接受腹腔注射 65 mg/kg pentobarbital 麻醉，然後繼續放回飼養籠中，10 分鐘(即刺激結束後 90 分鐘)後則
進行心臟灌流(圖 4-1B)。
4.2.4 免疫組織染色
大鼠在手術兩週後犧牲，鼠腦以心臟灌流法固定後取出進行免疫組織染色。
大鼠在麻醉後，先以4°C 的 100 ml 生理食鹽水將大鼠體內血液沖洗乾淨，為了加 強血液(特別是紅血球)的沖洗效果，每 100 ml 生理實驗水另外加入 0.5 克檸檬酸鈉 (sodium citrate，作為抗凝血劑)，及 0.5 克亞硝酸鈉(sodium nitrite，作為血管舒張 劑)；再以 4°C 的 300 ml 4% paraformaldehyde 固定液(配置於 0.1 M phosphate buffer, PB)進行組織固定。待固定液灌流結束，取出鼠腦，置於相同的固定液中後固定 16
~ 20 小時；接著將固定液置換為含 30%蔗糖的 PB 溶液，待鼠腦沉至溶液下層，即 可進行冷凍切片。取出鼠腦放置於冷凍切片機(sliding microtome)上，先在左腦皮 質上以手術刀淺層的劃一刀，用來區分左右腦的位置；利用乾冰將鼠腦冷凍後，
以厚度50 μm 進行冠狀切片，並將切片置於抗凍劑中以 4°C 低溫儲存(Watson et al., 1986)，以延緩細胞內蛋白的降解(degrade)速度。
進行免疫組織染色時，以固定間隔 500 μm 的距離(即每 10 片挑選一片)，自 bregma 前 3 mm 開始，依序挑出鼠腦切片，至 bregma 後 3 mm 為止。腦切片先以 Tris buffer (0.5 M, pH 7.6)清洗 3 次後，浸入含 1% H2O2的甲醇溶液中30 分鐘，以 去除內生性過氧化氫酶活性；接著以Tris buffer 清洗 3 次後，置於 blocking solution (0.2%安佳脫脂奶粉加 0.2% Triton X-100 的 Tris buffer)中 120 分鐘；再浸入稀釋 500 倍 的 一 級 抗 體 pERK (Phospho-p44/42 MAP kinase antibody, rabbit polyclonal antibody, #9101, Cell Signaling Technology)中，或浸入稀釋 1000 倍的一級抗體 c-Fos (anti-c-Fos rabbit polyclonal antibody, #PC05, Calbiochem)中，於 4°C 冰箱中靜置 20 小時。取出靜置於一級抗體的腦切片後，以Tris buffer 清洗 3 次，放入稀釋 200 倍 的二級抗體(Biotinylated goat anti-rabbit IgG, #BA-1000, Vector Laboratories)中，於室
溫下作用兩小時；以 Tris buffer 清洗 3 次後，再放入稀釋 200 倍的 avidin-biotin complex (ABC kit, #PK-6100, Vector Laboratories)溶液中，於室溫下作用兩小時；再 以Tris buffer 清洗 3 次後，即以含 0.1% DAB (3,3'-diaminobenzidine)與 0.1% H2O2
的PB 溶液中呈色。呈色後的腦切片經過乾燥、序列脫水及二甲苯透化處理後，以 DPX 膠封片(註：已停產)，再進行顯微照相及細胞計數等步驟。為了確定一級抗體 所染出的細胞的確為pERK-positive 或 c-Fos-positive 細胞，在前述處理的切片相鄰 位置，隨機挑選不同組別的鼠腦切片，進行陰性對照組(negative control)染色。操 核 的 一 級 抗 體 NeuN (Mouse anti-neuronal nuclei biotin-conjugated monoclonal antibody, #MAB377, Chemicon)，第二組為稀釋 500 倍的一級抗體 pERK 加上稀釋 1000 倍的標示星狀膠細胞蛋白質骨架的一級抗體 GFAP (Mouse anti-glial fibrillary acidic protein monoclonal antibody, #MAB360, Chemicon)，第三組為稀釋 1000 倍的 一級抗體c-Fos 加上稀釋 1000 倍的一級抗體 NeuN，第四組為稀釋 1000 倍的一級 抗體c-Fos 加上稀釋 1000 倍的一級抗體 GFAP。不同的切片在這 4 組抗體組合中 於4°C 冰箱中靜置 20 小時。之後取出腦切片，以 Tris buffer 清洗 3 次，放入稀釋 200 倍的螢光二級抗體(Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody, #AP132C, Chemicon)加上稀釋 200 倍的二級抗體(Biotinylated horse anti-mouse IgG antibody,
#BA-2000, Vector Laboratories)組合中，於室溫下避光作用兩小時。以 Tris buffer 清 洗 3 次 後 ， 再 放 入 稀 釋 200 倍 的 螢 光 三 級 抗 體(Cy2-conjugated streptavidin,
#016-220-084, Jackson ImmunoResearch Laboratory)溶液中，於室溫下避光作用兩小 時。以Tris buffer 清洗 3 次後，即將腦切片貼於含膠載玻片上，以 DPX 封片膠(註：
已停產)直接封片，並在螢光顯微鏡底下觀察。部分切片在共軛焦顯微鏡(Leica TCS SP5)下觀察並拍照記錄。
4.2.6 細胞計數
封片後的免疫組織染色結果，以體視學(stereology)的方法進行細胞計數。計數 的範圍依據大鼠腦圖譜(Paxinos and Watson, 2007)描繪感興趣的區域(ROI)，包括 vmPFC、ACC、MCC (mid-cingulate cortex，中扣帶迴皮質)、IC、S1HL (hindlimb region of primary somatosensory cortex，初級體感覺皮質的後腳區域)，CeA (central nucleus of amygdala，杏仁體中央核)。選擇這些核區是因為在免疫組織染色之後，這些核 區有比較明顯的pERK 及 c-Fos 表現。vmPFC 的計數範圍為+3.0 mm 到+2.5 mm。
ACC 與 MCC 的邊界約在 bregma 處(Vogt and Paxinos, 2014)，所以 ACC 的計數範 圍為+3.0 mm 到+0.5 mm，MCC 的計數範圍為 bregma 到-1.5 mm。IC 的計數範圍 相當長，本研究將其分為前側(anterior part, aIC)及後側(posterior part, pIC)分別計 數，aIC 的計數範圍為+3.0 mm 到+0.5 mm，pIC 的計數範圍為 bregma 到-2.5 mm。
S1HL 的計數範圍為 bregma 到-2.0 mm。CeA 的計數範圍為-2.0 mm 到-3.0 mm。在 進行細胞計數時，對pERK-positive 細胞來說，只有清晰完整的細胞本體並有清楚 細胞核的細胞才予以計數；對 c-Fos-positive 細胞來說，只有清晰完整的細胞核才 予以計數。左右腦的核區則分別進行計數。
體視學量測系統包括光學顯微鏡(Olympus BX51)，具備即時顯示(Live View) 功能的CCD，軟體自動控制的載台雙向步徑馬達，以及 MicroBrightField 公司出版 的Stereo Investigator (Version 9.10, MBF Bioscience, Williston, USA)體視學軟體，其 中的Optical Fractionator Probe 程式提供無偏差(unbiased)的細胞計數方法。在計數
細胞時，先在4 倍物鏡的視野下描繪 ROI，然後在 60 倍油鏡(N.A.值為 1.25)的視 野下計數細胞。所有描繪的ROIs 皆被程式隨機擺放的固定格線方塊(Grid, 150 μm × 150 μm)切割為數量不一的區域，每一區域內有單一的計數框(counting frame, 75 μm
× 75 μm)，每個計數框為三維結構(厚度約為 16 μm)，只有細胞完全落入計數框及 可採計邊框的範圍內才予以計數。當同一個鼠腦的左右皮質皆計數完成後，Stereo Investigator 軟體即透過公式計算得出估計的細胞總數，以及該估計值的誤差係數 (coefficient of error, CE)。計算估計的細胞總數公式如下(West et al., 1991)：
N = ΣQ- × t/h × 1/asf × 1/ssf
Q-為每一切片所計數的細胞數目；
t 為切片的厚度；
h 為計數框的厚度；
asf 為計數框佔格線方塊的比率；
ssf 為每隔多少切片挑選一片。
CE 值一般認定只要低於 0.1 即為具可信度的估計值，我們採用的是 Gundersen (m=1)公式計算的 CE 值(Gundersen et al., 1999)。
4.2.7 統計分析
本研究的統計分析，均使用SigmaStat 3.1 的軟體進行計算。在觸感痛測定的 結果分析，SNI 組及 Sham 組的手術側後腳縮腳閾值分別以重複取樣單因子等級變 異數分析(one-way repeated measures of ANOVA on ranks)進行統計分析，若結果顯 示有差異時再進行事後檢定，事後檢定採用Tukey 方式檢定，並設 p < 0.05 為顯著 差異。縮腳閾值變化皆對手術前的基準值作比較。大鼠犧牲前進行的機械性刺激，
我們將縮腳次數轉換為縮腳比率，各處理組的縮腳比率以單因子變異數分析 (one-way ANOVA)進行統計分析，若結果顯示有差異時再進行事後檢定，事後檢定 採用Tukey 方式檢定，並設 p < 0.05 為顯著差異。在細胞計數的結果分析，對 pERK
我們將縮腳次數轉換為縮腳比率，各處理組的縮腳比率以單因子變異數分析 (one-way ANOVA)進行統計分析，若結果顯示有差異時再進行事後檢定，事後檢定 採用Tukey 方式檢定，並設 p < 0.05 為顯著差異。在細胞計數的結果分析，對 pERK