國立臺灣大學生命科學院生命科學系 博士論文
Department of Life Science College of Life Science
National Taiwan University Doctoral Dissertation
觸感痛與gabapentin的止痛作用在神經損傷大鼠腦中的 活性變化
The brain activity changes of tactile allodynia and the analgesic effect of gabapentin in the neuropathic rats
林校群 Hsiao-Chun Lin
指導教授：嚴震東 博士 Advisor: Chen-Tung Yen, Ph.D.
中華民國104年1月
January 2015
国立童湾大学博士学位論文
口試委員食害定書
簡威痛興gabapentin的止痛作用在神経損傷大鼠
脳中的活性螢化
ThebrainactlVltyChangesoftactileallodynla
andmeanalgesice餓ectofgabapentin inlheneⅢOPamicrats
本論文係林校群君（学競：D95B41005）在団立を湾大学 生命科学系、所完成之博士学位論文，於民団一〇四年一月二 十九日承下列考試委員審査通過及口試及格，特此誼明
ロ試委員：
生命科学系 系
名
（指等教授）
珪連峰 坊んれ 縫紋 −／ 調停年毎 海南
主任幽44 誘（登名）
致謝
這本論文的完成，首先要感謝我的指導教授嚴震東老師。跟老師相處這幾年 來，有許多印象深刻的記憶。舉幾個例子來說，老師的辦公室從來沒有關上門，
如果有什麼問題，不管是研究上的或生活上的，只要老師坐在裡面，隨時可以進 去跟他討論。老師博覽群書，不管是專業或非專業的書籍，似乎有過目不忘的本 事，常常跟他討論完還要私下翻書才知道剛剛老師說了什麼。最讓我佩服的是許 多實驗技術的傳授，都是老師親自示範給我們看，而換我們自己上場時卻困難重 重，即使筆記寫滿也想不透為什麼自己做不出來。此外還要感謝老師提供了多次 機會，讓我能夠到國外參加課程及研討會。老師並不是緊迫盯人的教導，而是潛 移默化的影響，這些記憶除非我得了阿茲海默症，不然應該是很難忘的吧。再來 要感謝孫維仁教授及謝松蒼教授，你們多次給予我的研究意見，對我都是相當重 要的提醒與指引。孫醫師經常在白板上整理問題並畫出論文的方向，這種化繁為 簡的功力希望我也能學會。謝醫師及中山醫大的曾拓榮老師教我免疫組織染色的 各種技巧及問題解決的方式，讓我了解如何用基本的生物學邏輯去處理複雜的問 題。謝謝台大醫院核醫部曾凱元主任，提供優良的場地、正子造影設備與實驗指 導，以及讓我可以優先排定實驗時程，並在我口試時還抽空前來參加。謝謝中研 院生醫所的徐百川老師及陳建璋老師，以及台大腦心所的曾明宗老師，你們在口 試的提問及討論讓我可以更清楚研究的方向。感謝生科系主任閔明源教授，閔老 師的意見一向相當中肯明確，在動物所及現在的生科系這幾年也受到閔老師許多 的幫助。我要感謝實驗室的陳瑞芬老師，陳老師對學生的關心總是讓人覺得溫暖，
還有陳老師在安排我擔任助教的工作上也提供許多的幫助。謝謝常來實驗室的蔡 孟利老師，蔡老師雖然在宜蘭，但幾乎每週都來實驗室協助大家的實驗及關心研 究進度。謝謝實驗室的助理妍徵及舒婷，如果沒有你們，實驗室大概很難順利運 作。感謝在我就讀博士班這幾年一起為研究努力的夥伴，從白峰學長、佳琦學姐、
儀芳學姐，到同屆已畢業的琬婷與本立，還有已畢業的學弟妹們：建嘉、孟孜、
王楹、慧馨、庭芳、旭偉、慶霖、智羽、郁昕、瑋辰、昕叡、奕君，以及還在研 究路上前進的學弟妹們：玟誼、子豪、瀚元、婉婷、瀚雄、玟樺，和你們相處的 日子很愉快，很難得有機會能和一群具備多樣優點與長才的人朝夕相處；特別要 感謝郁昕及子豪，在本論文的第三章實驗分析上幫助許多。在這幾年的研究生活 中，我的好友們也分擔了我的許多憂愁，感謝恆鍵、文彥、淑菁、鴻欣、柏衡、
之瑋、雨暘，你們的陪伴與傾聽給了我許多鼓勵。最後要感謝我的父母，你們一 直無條件的支持我做自己想做的事，這種無條件的愛給我很多啟發，希望我也可 以像你們一樣。感謝我的老婆英辰，由於妳的包容與支持，讓我可以有力量完成 這本論文。還有我們即將出生的女兒，希望妳將來能懂得妳爸媽對妳無條件的愛，
是來自於我們生命中遇到的這一切幫助。感謝主，賜給我這一切，包括這本論文，
還有貢獻生命於人類知識的大鼠。
摘要
神經病變性疼痛為體感覺系統因疾病或損傷所產生的疼痛，在臨床上不易治 療，因對其病理機制的了解仍有限。觸感痛是神經病變性疼痛的主要症狀，特徵 為對正常人無痛的觸覺刺激卻會引發病人疼痛。目前對觸感痛的研究著重在周邊 感覺神經及脊髓背角的功能性變化，而腦部在觸感痛時扮演的角色仍待了解。
Gabapentin (GBP)是臨床上治療神經病變性疼痛的主要藥物，但其在腦中的作用位 置還不清楚。本論文使用正子造影及免疫組織化學方法，研究神經損傷大鼠腦部 在觸感痛狀態下的功能性變化，及 GBP 在腦部可能的作用位置。我們將大鼠坐骨 神經的分支脛神經及腓總神經結紮後切斷，保留腓腸神經完整。神經損傷大鼠很 快發展出自發性疼痛、觸感痛及痛覺過敏等現象。我們比較神經損傷大鼠在觸感 痛狀態下腦部的葡萄糖代謝率及神經活化標誌的變化，以及給予 GBP 止痛後的改 變。由正子造影的結果顯示，觸感痛會使神經損傷大鼠腦部的島狀皮質前側、丘 腦及小腦的代謝率增加，而給予 GBP 止痛可回復丘腦及小腦的代謝率，並使前額 葉皮質及前扣帶迴皮質代謝率降低。由免疫組織染色的結果顯示，磷酸化細胞外 訊息調節激酶(pERK)及神經活化蛋白(c-Fos)在神經損傷大鼠的前額葉皮質、前扣 帶迴皮質及島狀皮質前側等邊緣皮質有大量的表現。神經損傷大鼠腦中 pERK 細 胞在前額葉皮質及島狀皮質前側較對照組有顯著增加，而 c-Fos 細胞則在前額葉皮 質較對照組有顯著增加；經由給予 GBP 止痛後，這些大量表現的細胞顯著的減少。
我們更進一步確認在腦中這些表現 pERK 或 c-Fos 的細胞是神經元，而非星狀膠細 胞。由本研究的結果可知，觸感痛在神經損傷大鼠腦中主要改變了邊緣皮質的細 胞活性，而 GBP 在腦部的作用位置可能就是在抑制邊緣皮質的細胞活性來達成止 痛作用。
關鍵詞：觸感痛、Gabapentin、前額葉皮質、前扣帶迴皮質、島狀皮質
Abstract
Neuropathic pain is caused by injury or disease of the somatosensory system.
Treating neuropathic pain is difficult because its pathophysiological mechanisms are
understood limitedly. Tactile allodynia, the innocuous touch-evoked pain, is one of the
major symptoms of neuropathic pain patients. So far the studies of tactile allodynia are
focused on the functional alterations in the primary afferents and the spinal dorsal horn
neurons, however, the role of brain in the tactile allodynia is still unclear. Gabapentin
(GBP) is a first-line analgesic to treat neuropathic pain, but its action sites in the brain
remains to be disclosed. In this thesis, we used positron emission tomography (PET)
and immunohistochemical methods to investigate the functional alterations in the brain
of neuropathic rats under allodynic state, and the action sites of GBP in the brain. We
used the spared nerve injury (SNI) model of neuropathic pain. In the SNI model, the
tibia and common peroneal nerves of the sciatic nerve were ligated and cut, and leaving
the sural nerve intact. The nerve-injured rats developed spontaneous pain, tactile
allodynia and thermal hyperalgesia. Then we compared the glucose metabolic rate and
neuronal activation markers in the brain of neuropathic rats under allodynic state, and
the effect of GBP. The PET results showed glucose metabolic rates increased in the
anterior insular cortex (IC), thalamus and cerebellum after nerve-injury, and GBP
treatment reversed the increases in the thalamus and cerebellum, and decreased the
glucose metabolism in the medial prefrontal cortex (mPFC) and anterior cingulate
cortex (ACC). The immunostaining results showed an abundant expression of pERK
and c-Fos in the mPFC, ACC and anterior IC. For pERK study, the pERK-positive cells
in the neuropathic rats increased significantly in the mPFC and IC than control rats. For
c-Fos study, the c-Fos-positive cells in the neuropathic rats increased significantly in the
mPFC than control rats. After GBP treatment, the increased expression of pERK and
c-Fos decreased significantly. We also demonstrated the pERK- or c-Fos-positive cells
were neurons, not the astrocytes. According to our studies, the tactile allodynia affect
the neuronal activities in the limbic cortices of neuropathic rats, and the effect of GBP
was to suppress the activation of limbic cortices.
Key words: allodynia, gabapentin, medial prefrontal cortex, anterior cingulate cortex,
insular cortex
目錄
論文口試委員會審定書 --- i
致謝 --- ii
摘要 --- iii
Abstract --- iv
第一章、緒論 --- 1
1.1 研究神經病變性疼痛的重要性 --- 1
1.2 神經病變性疼痛 --- 1
1.3 腦部對疼痛反應的功能性影像研究 --- 11
1.4 疼痛的細胞分子標記 --- 15
1.5 研究目的 --- 16
第二章、神經損傷大鼠的疼痛行為指標與 gabapentin 的藥效測試 --- 18
2.1 前言 --- 18
2.2 材料與方法 --- 19
2.3 結果 --- 24
2.4 討論 --- 25
第三章、神經損傷大鼠在觸感痛狀態下的腦部葡萄糖代謝率變化與 gabapentin 止痛 的作用位置 --- 29
3.1 前言 --- 29
3.2 材料與方法 --- 30
3.3 結果 --- 36
3.4 討論 --- 39
第四章、神經損傷大鼠在觸感痛狀態下的腦部神經活化標誌的變化與 gabapentin 的止痛反應 --- 45
4.1 前言 --- 45
4.2 材料與方法 --- 46
4.3 結果 --- 52
4.4 討論 --- 55
第五章、綜合討論與結論 --- 60
參考文獻 --- 65
附表 --- 81
附圖 --- 85
第一章、緒論
1.1 研究神經病變性疼痛的重要性
慢性痛(chronic pain)是臨床醫療上的重要問題。慢性痛的定義不易界定，一般 認為持續超過三個月的疼痛就可診斷為慢性痛(Apkarian et al., 2009)。慢性痛的病 人在受到長期疼痛的折磨下，不僅嚴重影響生活品質，也易導致焦慮及憂鬱等疾 患(Asmundson and Katz, 2009; Doth et al., 2010; Fishbain et al., 2010; Gormsen et al., 2010)。在法國有個大規模的慢性痛流行病學調查，其中有 21.7%的慢性痛肇因於 神經病變性疼痛(neuropathic pain) (Bouhassira et al., 2008)。美國有項調查估計，每 年因神經病變性疼痛而就醫的直接醫療支出約有一億美元，而因疼痛發作而無法 工作造成的產值下降也約有一億美元，可見神經病變性疼痛造成了嚴重的醫療及 經濟負擔(McCarberg and Billington, 2006)。因此，研究神經病變性疼痛的病理機 制，並找尋合適的藥物或治療方式，是刻不容緩的工作。
1.2 神經病變性疼痛 1.2.1 疼痛的生理機制
疼痛是一種主觀的經驗。國際疼痛研究協會(International Association for the Study of Pain, IASP)對痛的定義是：一種不愉快的感覺或情緒上的經驗，與實際上 或潛在的組織傷害有關。當周邊組織受到傷害性刺激(noxious stimulus)時，會引起 痛覺受器(nociceptor)的反應。痛覺受器為分布在表皮層的痛覺神經末梢的游離分 支，與觸覺或壓覺具有的特殊受器形態不同。痛覺神經分為寡髓鞘的Aδ 神經及無 髓鞘的C 纖維神經，位於皮膚底下的痛覺受器是它們的周邊突起(peripheral process) 的末梢，而其細胞本體則位在背根神經節(dorsal root ganglion, DRG)內；這些 Aδ 及 C 纖維神經的中樞突起(central process)則伸入脊髓(spinal cord)的背角(dorsal horn)內，與第二級的痛覺神經細胞形成突觸。第二級的痛覺神經也分為兩種，一
種是單純接受第一級痛覺神經訊號的痛覺專一性神經(nociceptive specific, NS)，主 要分布在脊髓背角的表淺層；另一種除了接受痛覺神經訊號外，也接受負責觸覺 的Aβ 神經的訊號，因此稱為寬廣動態範圍神經(wide dynamic range, WDR)，主要 分 布 在 脊 髓 背 角 的 較 深 層 的 區 域 。 第 二 級 的 痛 覺 傳 遞 神 經 以 脊 髓 丘 腦 徑 (spinothalamic tract, STT)神經為主要投射路徑，它們的軸突會交叉到脊髓對側的方 位，並一路上行直到丘腦內(Almeida et al., 2004)。來自頸部以下的痛覺訊號會在丘 腦的腹後側核(ventral posterolateral nucleus, VPL)內，藉由第三級神經上傳到初級體 感覺皮質(primary somatosensory cortex, S1)；而來自臉部的痛覺訊號則在丘腦的腹 後中央核(ventral posteromedial nucleus, VPM)內，一樣透過第三級神經上傳到初級 體感覺皮質。這個由脊髓背角經由腹後側核傳遞到初級體感覺皮質的痛覺路徑，
又稱為外側痛覺路徑(lateral pain pathway)，主要可以傳遞疼痛的強度、定位及種 類；另外由脊髓背角的神經還會傳遞到丘腦中線的核區，如背中央核區(Mediodorsal nucleus, MD)，並轉換第三級神經傳遞到前扣帶迴皮質(anterior cingulate cortex, ACC)，這條痛覺路徑稱為內側痛覺路徑(medial pain pathway)，與疼痛時的情緒與 認知有關(Almeida et al., 2004)。
正常的疼痛是一種保護機制。當周邊組織受傷的時候，因其產生的疼痛，使 我們避免使用或碰觸該受傷組織，如此可幫助組織修復及傷口癒合。痛覺神經除 了傳遞疼痛訊息外，它們還具有敏感化的特性，使得疼痛訊息有放大的效果。痛 覺神經的敏感化有兩種：周邊敏感化(peripheral sensitization)與中樞敏感化(central sensitization) (Cesare and McNaughton, 1997; Woolf, 2011)。周邊敏感化發生在周邊 神經系統，也就是第一級的痛覺神經。當周邊組織受傷或發炎的時候，傷口周圍 會聚集白血球及免疫細胞，它們會釋放一些發炎介質(inflammatory mediator)，如前 列腺素(prostaglandin)、緩激肽(bradykinin)、組織胺(histamine)或神經生長因子(nerve growth factor, NGF)等，這些發炎介質會與痛覺神經上的專屬受器結合，使痛覺神
經改變原本的狀態，產生了更多的受器蛋白並移動到周邊突起的細胞膜上，最終 使得痛覺神經更易興奮產生動作電位，也降低了疼痛的閾值。中樞敏感化發生在 中樞神經系統，目前了解較多的是位在脊隨背角的第二級痛覺神經的變化。中樞 敏感化是痛覺傳遞路徑上一個獨特的現象，當周邊的傷害性刺激以一定的強度且 重複性出現時，即會誘發脊髓背角神經發展出中樞敏感化現象(Woolf, 1983)。中樞 敏感化會使脊髓背角神經改變其原本的細胞膜興奮度(excitability)及突觸可塑性 (synaptic plasticity)，造成脊髓背角神經更易產生動作電位，將傷害性訊息往腦部傳 遞(Latremoliere and Woolf, 2009)。當第一級痛覺神經的軸突末端傳來了動作電位，
不僅會釋放興奮性的傳導物質麩氨酸(glutamate)，也會釋放神經胜肽類如 P 物質 (substance P)或 CGRP (calcitonin gene-related peptide)。P 物質或 CGRP 與第二級痛 覺神經突觸上的專屬受器結合後，會活化一連串的細胞內訊號傳遞路徑，最終使 得更多的AMPA 及 NMDA 等麩氨酸受器移動到突觸，使第二級痛覺神經改變其可 塑性而更易被興奮。痛覺神經具有的敏感化特性，經常讓疼痛訊息過度放大而使 得病人難以忍受；若能夠減少這種敏感化的現象，在臨床上可用來作為止痛的方 法。如白血球中的嗜中性球(neutrophil)，在受傷組織處活化時，會製造環氧化酶 (cyclooxygenase-2, COX-2)，使得花生四烯酸(arachidonic acid)轉變為前列腺素，而 增加了周邊敏感化的現象；非固醇類抗發炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)如阿斯匹靈等，會抑制 COX-2 製造，減少前列腺素的生成，因而在臨床 上常用為消炎止痛藥(Seibert et al., 1994; Vane, 1971)。
1.2.2 神經病變性疼痛的定義
正常痛覺為當傷害性刺激或發炎反應消失之後，疼痛也會跟著消失；但若體 感覺系統(somatosensory system)受到損傷，不管是外傷(如脊髓損傷)、病毒感染(如 泡疹病毒)，或是代謝性疾病(如糖尿病)等，會使得痛覺神經產生異常生理變化，
結果造成慢性的神經病變性疼痛(Costigan et al., 2009; Treede et al., 2008)。神經病變
性疼痛有三個主要的症狀，包括自發性的疼痛(spontaneous pain)、對痛覺刺激過度 敏感(hyperalgesia)，以及對正常人不痛的觸覺或溫覺刺激卻感到疼痛(allodynia)等 症狀(Baron, 2006)。由於這種疼痛在臨床上描述為像針刺的、撕裂的、燒灼的，或 像被電擊了一般的疼痛，因此造成了病人在心理上的焦慮與壓力(Asmundson and Katz, 2009; Bair et al., 2003)。神經病變性疼痛在臨床上不易治療(Dray, 2008)，因為 受傷的是神經而非一般軟組織，所以給予 NSAIDs 並無法止痛；即使進一步投予 鴉片類藥物(如嗎啡)，其止痛效果也因病人的情況而異(Arner and Meyerson, 1988;
Finnerup et al., 2005; Kalso et al., 2004)。由於神經病變性疼痛的來源為受傷的感覺 神經產生了異常的活動，因此唯有建立類似的動物模式才有辦法藉由研究其病理 機制，進而找出有效的止痛方式。
1.2.3 周邊神經病變性疼痛：動物模式
由於神經病變性疼痛的成因很多，臨床上的治療方式也相當複雜，且其治療 效果也不一。以現在作為第一線治療神經病變性疼痛的抗痙攣藥(anticonvulsants) 來說，同樣屬於抗痙攣藥的carbamazepine 對三叉神經痛(trigeminal neuralgia)的止 痛效果不錯，但對皰疹後神經痛(post-herpetic neuralgia)的效果就不佳；而另一種抗 痙攣藥gabapentin 則適合用來治療皰疹後神經痛(Finnerup et al., 2005)。由藥物的治 療差異性也反映出，不同成因的神經病變性疼痛可能由不同的病理機制所產生。
早期由於缺乏適當的疼痛動物模式，因此對於神經病變性疼痛的了解相當有限，
直到Bennett and Xie (1988)在大鼠的坐骨神經上用了四個可以壓迫神經卻不至於 綁死的單結，製造出類似神經病變性疼痛病人的動物模式，自此才有合適的動物 模式以供進一步研究。目前有關神經病變性疼痛的動物模式，大多採用手術造成 周邊神經的部分損傷為主(Jaggi et al., 2011)。以坐骨神經的手術操作來說，除了上 述所提的慢性壓迫性傷害模式(chronic constriction injury, CCI)外，常見的還有 Seltzer et al. (1990)的局部坐骨神經結紮模式(partial sciatic nerve ligation, PSL)，Kim
and Chung (1992)的脊神經結紮模式(spinal nerve ligation, SNL)，及 Decosterd and Woolf (2000)的分支選擇性傷害模式(spared nerve injury, SNI)等。其中 SNL 及 SNI 兩種模式，因為損傷的位置及程度很明確，近年來更是常用來研究神經病變性疼 痛。SNL 模式為將老鼠的 L5 及 L6 脊神經分離後以手術縫線緊緊地結紮，而 SNI 模式為將坐骨神經三分支中的脛神經(tibia nerve)及腓總神經(common peroneal nerve)分離後結紮並切斷遠心端的連結，只保留完整的腓腸神經(sural nerve)。本研 究將採用 SNI 模式，因為它的手術簡單，當老鼠發展出神經病變性疼痛後，其觸 感痛的行為可維持至半年(Decosterd and Woolf, 2000)，且老鼠也常表現出明顯的自 發性疼痛行為(Lee et al., 2012)。
1.2.4 周邊神經病變性疼痛的機制
經由對神經病變性疼痛動物模式的研究了解，學者們提出一些造成神經病變 性疼痛的可能機制，但目前仍未有一致的結論。本節以背根神經節及脊髓背角兩 部分的變化簡要敘述。
1.2.4.1 背根神經節的變化
背根神經節的神經元屬於感覺神經，其細胞本體在神經節內，周邊突起分布 在皮膚表層上，中樞突起則分布在脊髓背角的不同層(lamina)上。背根神經節裡的 感覺神經元有三種，一種是負責觸覺訊息，體積較大，有較厚髓鞘包覆的Aβ 細胞 (神經傳導速率約 14 ~ 30 m/s)；另外兩種是負責傷害性訊息(nociceptive signal)，體 積較小的細胞，依髓鞘的有無，可分為具有較薄髓鞘的 Aδ 細胞(神經傳導速率約 2.2 ~ 8 m/s)，及無髓鞘的 C 纖維細胞(神經傳導速率約< 1.4 m/s)。周邊神經損傷會 刺激 Aβ 細胞的軸突萌芽(sprouting)，利用基因晶片的偵測，可發現此萌芽現象藉 由活化與神經再生有關的基因來達成形態上的變化(Costigan et al., 2002)。神經病變 性疼痛的一個特徵是有觸感痛(tactile allodynia)，即一般無痛的觸覺刺激在神經損
傷後會造成疼痛，這個可能與負責傳遞觸覺訊息的 Aβ 細胞，在周邊神經損傷之 後，產生了形態上的變化，將其原本分布在lamina III 到 V 層的軸突，延伸到了脊 髓背角的lamina I 及 II 位置，造成了觸覺訊息卻興奮了痛覺神經(Lekan et al., 1996;
Soares et al., 2002; Woolf et al., 1992)。除了形態上的變化，Aβ 細胞原本不製造與痛 覺有關的神經傳導物質P 物質及 CGRP，但在周邊神經損傷後，卻能夠開始製造這 些 傳 導 物 質 ， 這 種 表 型 轉 換(phenotypic switch) 也 會 增 強 傷 害 性 訊 息 的 傳 遞 (Nitzan-Luques et al., 2011; Weissner et al., 2006)。
鈉離子通道(voltage-gated sodium channel)是形成動作電位的蛋白質通道之 一，其構成的次單元有主要形成通道(pore)的 α 次單元，及附屬的 β 次單元。根據 α 次單元的胺基酸序列不同，鈉離子通道可以分為 Nav1.1 ~ 1.9 九種異構體 (isoform)。這九種鈉離子通道又可依據對河豚毒素(tetrodotoxin，簡稱 TTX)的感受 力分為TTX 敏感型(TTX-sensitive)及 TTX 不敏感型(TTX-resistant)，其中 Nav1.1 ~ 1.4 及 Nav1.6 ~ 1.7 為 TTX 敏感型，Nav1.5 及 Nav1.8 ~ 1.9 為 TTX 不敏感型。在成 年大鼠的背根神經節內，鈉離子通道具有TTX 敏感型的 Nav1.1 及 Nav1.6 ~ 1.7，
與TTX 不敏感型的 Nav1.8 ~ 1.9 (Rush et al., 2007)。不同鈉離子通道對疼痛形成的 角色不同，利用基因剔除(gene knockout)的方式去掉 Nav1.7 或 Nav1.9 通道，可減 低小鼠對多種發炎物質的疼痛行為(Amaya et al., 2006; Nassar et al., 2004)；利用基 因弱化(gene knockdown)的方式去抑制 Nav1.8 通道的表現，可改善神經病變性疼痛 大鼠的觸感痛及痛覺過敏(Lai et al., 2002)。特別的是 Nav1.3 通道，在正常成年大 鼠的背根神經節並不具有此通道，但在發炎痛的情況下卻會明顯表現(Black et al., 2004)；而在脊髓損傷(spinal cord injury)造成的神經病變性疼痛，Nav1.3 也會大量 表現在脊髓的第二級痛覺神經上(Hains et al., 2003)。似乎這幾種鈉離子通道的異常 表現會與神經病變性疼痛有關，但Nassar et al.利用基因剔除的方式去掉 Nav1.3、
Nav1.7 及 Nav1.8，小鼠還是一樣會發展出神經病變性疼痛，因此這些鈉離子通道
的角色仍需要進一步研究(Nassar et al., 2005; Nassar et al., 2006)。
周邊神經損傷時通常在受傷處的神經會形成神經瘤(neuroma)，而會使得部份 鈉離子通道大量表現(England et al., 1996)，像這類大量表現的鈉離子通道可能是造 成異位性放電(ectopic discharge)的主要原因(Matzner and Devor, 1994)。除了神經瘤 外，受傷的背根神經節細胞，甚至是相鄰的未受傷神經纖維也會具有異位性放電 的現象；特別是不屬於痛覺神經的Aβ 細胞的異位性放電，與神經病變性疼痛的引 發有關(Amir et al., 2005; Devor, 2009; Wu et al., 2001)。周邊感覺神經的自發異位性 放電除了與自發性疼痛有關，也與中樞敏感化現象有關，因為它的自發性放電行 為提供了滿足中樞敏感化的要件，且在周邊組織缺少傷害性刺激時一樣會使周邊 感覺神經傳遞傷害性訊息，並改變了第二級痛覺神經的特性，最終放大了疼痛訊 號(Balasubramanyan et al., 2006; Coderre and Katz, 1997; Devor, 2009)。
1.2.4.2 脊髓背角的變化
周邊神經損傷使得脊髓背角處發生了最主要的變化，就是中樞敏感化現象。
中樞敏感化指的是因周邊的傷害性刺激、組織損傷或神經損傷，造成了脊髓背角 的體感覺神經改變了突觸可塑性，而這種改變是迅速發生的，結果使得第二級的 痛覺神經增加了興奮度(Latremoliere and Woolf, 2009)。神經病變性疼痛的症狀之一 是痛覺過敏，痛覺過敏又可分為直接的痛覺過敏(primary hyperalgesia)，即受傷處 的痛覺反應增大，與間接的痛覺過敏(secondary hyperalgesia)，即受傷處周圍位置 也降低了疼痛閾值。中樞敏感化會使脊髓背角的痛覺神經擴大感受域(receptive field)，因此與間接的痛覺過敏有關(Campbell and Meyer, 2006)。
脊髓背角裡有一群GABAergic 中間神經元，當周邊神經損傷時會導致這類神 經元大量凋亡(apoptosis)，因而失去對痛覺神經的抑制作用(disinhibition)；若給予
caspase inhibitor 抑制細胞凋亡的現象，則可以降低動物觸感痛及痛覺過敏的現象 (Scholz et al., 2005)。在脊髓背角的第一層(lamina I)裡具有 GABAA受器的神經元，
其細胞膜上表現有第二型鉀離子-氯離子共同輸送蛋白(K+-Cl- cotransporter 2, KCC2)，這種蛋白的功能是將鉀離子及氯離子排出細胞外，以維持細胞內的離子濃 度；當周邊神經損傷後，KCC2 的表現量下降，使得細胞內的氯離子濃度增加，因 此當GABAA受器因GABA 活化而打開氯離子通道時，結果反而是氯離子向外流，
造成這些在lamina I 的具有 GABAA受器的神經元因去極化而產生動作電位，導致 部分GABAergic 細胞失去對痛覺神經的抑制作用，這也可能是神經病變性疼痛的 原因之一(Coull et al., 2003)。
周邊神經損傷時會伴隨著瓦勒氏退化(Wallerian degeneration)，而活化大量的 巨噬細胞(macrophage)來清除殘餘的細胞碎片。微膠細胞(microglia)是中樞神經系 統裡的巨噬細胞，在周邊神經損傷後，損傷部位所對應的脊髓處也會活化大量的 微膠細胞，並釋放許多免疫介質(如 TNF-α, IL-1β 等)，此與神經病變性疼痛的誘發 及維持有關(Beggs and Salter, 2007; Suter et al., 2007)。微膠細胞上有表現一種獨特 的受器蛋白P2X4，是屬於ATP 的受器(ionotropic ATP receptor)之一，這種受器蛋白 並不顯現在神經元或星狀膠細胞(astrocyte)上。當周邊神經損傷的時候，P2X4受器 也會大量表現在脊髓背角處，若抑制這種受器的表現，可以減低觸感痛的程度 (Tsuda et al., 2003)。有一種細胞內的激酶 p38，只表現在脊髓背角的微膠細胞內，
並不表現在神經元或星狀膠細胞內(但會表現在 DRG 神經元內) (Jin et al., 2003)；
當周邊神經損傷後，會活化微膠細胞內的p38 (磷酸化，phospho-p38)，而抑制 p38 的活化可防止觸感痛的發展(Tsuda et al., 2004)。除了微膠細胞外，星狀膠細胞的活 化也和神經病變性疼痛有關。當周邊神經損傷後，星狀膠細胞的蛋白標誌 glial fibrillary acidic protein (GFAP)也會跟著增加，而這種增加是因為星狀膠細胞變形膨 大(hypertrophy)，並不是因其數量增加或移動的結果(Garrison et al., 1991)；若給予
麩氨酸的NMDA 受器的拮抗劑 MK-801，除了可減低觸感痛的現象，也能夠抑制 GFAP 的表現(Garrison et al., 1994)。星狀膠細胞的活化會晚於微膠細胞的活化，因 此星狀膠細胞的變化可能與神經病變性疼痛的維持有關(Zhuang et al., 2005)。
由上述這些研究可知，周邊神經病變性疼痛的可能機制，與背根神經節細胞 的活性增加，促成了脊髓背角的中樞敏感化，加上中間神經元失去了抑制作用，
還有神經膠細胞與神經元之間的交互關係，總總造成了痛覺訊息的不正常傳遞；
但目前的研究多著重在脊髓背角處的變化，至於大腦的變化，目前仍有待釐清。
1.2.5 治療神經病變性疼痛的主要藥物：Gabapentin
Gabapentin (簡稱 GBP)的化學名為 1-(aminomethyl)cyclohexane acetic acid，它 的化學結構類似於γ-aminobutyric acid (GABA)，即抑制性的神經傳導物質，但 GBP 並不會作用於 GABA 受器(Taylor et al., 1998)。GBP 是鈣離子通道(voltage-gated calcium channel)上的 α2δ 次單元的配體(ligand) (Gee et al., 1996)，當它結合到 α2δ 次單元時，會抑制鈣離子經由鈣離子通道流入神經元，減少軸突末梢的興奮性神 經傳導物質麩氨酸釋放(Fink et al., 2000)。GBP 原本作為治療癲癇的臨床用藥，但 自從Rosner et al. (1996)報告 GBP 可以用來作為神經病變性疼痛的止痛藥以來，
GBP 及它的新型類似物 pregabalin (簡稱 PGB)目前已經是臨床上治療神經病變性疼 痛的第一線用藥。
有關GBP 的止痛機制目前還沒有明確的結論，比較被接受的論點是它可結合 鈣離子通道上的α2δ 次單元，以達成止痛的效果(Taylor, 2009)。鈣離子通道廣泛存 在於體內的肌肉、神經與內分泌細胞上，其構成的次單元有主要形成通道的 α1次 單元，及附屬的 β、γ、δ、α2等次單元；其中 α2次單元位於細胞膜外，透過雙硫 鍵(disulfide bond)與 δ 次單元相連，因此常稱為 α2δ 次單元(Arikkath and Campbell,
2003; Catterall, 2000)。根據 α1次單元的胺基酸序列不同，鈣離子通道又可分為L (Cav1.1 ~ 1.4)、P/Q (Cav2.1)、N (Cav2.2)、R (Cav2.3)、T (Cav3.1 ~ 3.3)等不同類型，
但並非所有類型的鈣離子通道都具有α2δ 次單元，目前已知 L、P/Q、N 類型的鈣 離子通道具有α2δ 次單元，而 T 類型的鈣離子通道可能不具備 α2δ 次單元(Davies et al., 2007; Perez-Reyes, 2003)。不同類型的鈣離子通道分布在細胞上的位置也不一 致，以神經元來說，L 類型的鈣離子通道主要分布在細胞本體，它的功能與鈣離子 依賴(calcium-dependent)的基因轉錄(gene transcription)有關；而 P/Q 及 N 類型的鈣 離子通道則分布在突觸前的神經末梢，它們的功能與鈣離子依賴的神經傳導物質 釋放有關(Catterall, 2000; Gomez-Ospina et al., 2006; Jarvis and Zamponi, 2007; Reid et al., 2003)。Chaplan et al.利用脊髓腔內(intrathecal)給藥的方式，測試不同類型鈣 離子通道的拮抗劑(antagonist)效果，發現只有給予 N 類型通道的拮抗劑，才能有 效的減緩神經損傷大鼠的觸感痛(Chaplan et al., 1994b)。後續的研究顯示，N 類型 鈣離子通道在神經病變性疼痛扮演重要的角色(Yaksh, 2006)。雖然不是所有的鈣離 子通道都具有α2δ 次單元，但 α2δ 次單元的存在可協助並促進 α1次單元由內質網運 送(trafficking)到細胞膜上，以形成鈣離子通道(Arikkath and Campbell, 2003; Felix et al., 1997; Jarvis and Zamponi, 2007)。在神經病變性疼痛大鼠模式中，可發現周邊神 經損傷在背根神經節及脊髓背角上有顯著的 α2δ 次單元大量表現，而這些增加的 α2δ 次單元也與大鼠的疼痛行為有關(Li et al., 2004; Li et al., 2006; Luo et al., 2001)。GBP 類藥物(gabapentinoid，包括 GBP 及 PGB)在周邊神經中可結合 α2δ 次 單元，抑制 α1次單元的運送，減少鈣離子通道在突觸前的神經末梢形成，最終達 成止痛的效果(Bauer et al., 2009; Field et al., 2006; Hendrich et al., 2008)。但 α2δ 次單 元不只存在於背根神經節及脊髓背角，腦中一樣有大量的 α2δ 次單元存在(Cole et al., 2005)；GBP 也一樣會結合到腦中的許多位置(Hill et al., 1993; Thurlow et al., 1996)。當神經病變性疼痛病人服用 GBP 之後，由於 GBP 可以通過血腦屏障 (blood-brain barrier)，它的止痛機制是否只影響脊髓處的神經活動，在腦中的影響
又是什麼，因此有關GBP 的止痛機制仍待進一步研究。
1.3 腦部對疼痛反應的功能性影像研究 1.3.1 疼痛與腦
研究神經病變性疼痛，經常使用周邊神經損傷的動物模式(Jaggi et al., 2011)，
而多數研究強調在脊髓背角處發生的變化，因為理論上由周邊神經上傳的疼痛訊 息增加的情況下，病人本來就會感覺到異常的疼痛；相反地，研究腦部在疼痛狀 態下的功能性變化卻不多，這可能歸因於難以取得合適的受試者。若想要直接記 錄腦部不同神經元對疼痛刺激的反應，可藉由神經電生理記錄(electrophysiological recording)。電生理記錄是研究神經系統重要的實驗技術，但進行電生理記錄時需 要侵入性的手術與麻醉，這也是要研究腦部神經對疼痛刺激反應的困難處之一。
早期研究動物在接受疼痛刺激時的腦部功能性變化中，除了電生理記錄外，也常 採用自體放射顯影法(autoradiography) (Kuhar et al., 1986)。自體放射顯影法是將不 同的放射性追蹤劑注入動物體內，再給予周邊的疼痛刺激，觀察不同的實驗狀態 下腦部各區域發生了什麼樣的變化。比如說可利用偵測局部腦血流(regional cerebral blood flow, rCBF) 變 化 的 放 射 性 追 蹤 劑 如 99mTc-Exametazime 或
14C-Iodoantipyrine，分別針對不同的疼痛動物模式，觀察在給予疼痛刺激時，腦部 的局部血流量有哪些改變(Paulson et al., 2007; Wang et al., 2008; Wang et al., 2009)；也有利用 2-DG (14C-2-deoxyglucose)這個葡萄糖的類似物注入動物體內，觀 察神經病變性疼痛的動物在休息狀態(可能有自發性疼痛)下，腦部各核區的葡萄糖 代謝率發生了哪些變化(Mao et al., 1993)。但是高階的腦部可能不只是單純地對上 傳的疼痛訊息做出回應，不同的腦區在中樞敏感化的情況下，也會改變神經元的 可塑性，如杏仁核與前扣帶迴皮質等(Neugebauer et al., 2004; Shyu and Vogt, 2009)。我們假設大腦在神經病變性疼痛狀態下，可能也參與了疼痛訊息的放大或 調控的角色，所以了解大腦對於神經病變性疼痛狀態下的變化是重要且值得探討
的問題。近年來，因為腦部功能性造影的技術有大幅度的發展，因此可藉由這些 非侵入性的檢查來研究大腦對於疼痛的反應(Tracey, 2008)，而主要的技術有功能性 磁振造影(functional magnetic resonance imaging, fMRI)及正子斷層造影(positron emission tomography, PET)。
1.3.2 功能性磁振造影
功能性磁振造影(fMRI)乃利用血氧濃度相依(blood-oxygenation level dependent, BOLD)的方式，來偵測腦組織中血氧濃度變化的程度(Ogawa et al., 1990)。當腦部 受到某項刺激而反應時，活化的神經元會增加能量代謝的需求，造成局部腦組織 血流容積與血流量的增加，使得活化區域有較多的含氧血紅素。含氧血紅素為逆 磁性物質，而去氧血紅素為順磁性物質。利用功能性磁振造影即可量測到與血氧 濃度差異相關的訊號，這些訊號的變化顯示出腦部功能性的改變。使用功能性磁 振造影有下列的優點：它的檢查過程為非侵入性的掃描，且掃描過程不具放射性，
病人可重複掃描而對身體無明顯的傷害，掃描所得的影像有好的軟組織對比，影 像的空間解析度高，可同時取得大腦不同切面的影像等。功能性磁振造影在正常 受試者或病人方面的檢查日益普及，在疼痛的研究上也提供了頗具潛力的工具 (Davis, 2011)。
1.3.3 正子斷層造影
正子斷層造影(PET)為利用放射性核種(radioisotope)標定的核醫藥物，經由注 入人體內血管，使這些藥物分布到標的組織，並由標的組織吸收與代謝，再藉由 該放射性核種衰變過程中最終釋放的 γ 射線，透過正子斷層掃描儀的接收與影像 重建，來偵測核醫藥物的吸收與分布情形(Phelps, 2000)。目前使用於正子斷層造影 的放射性核種屬於人體內常見元素的同位素，比如碳-11 (11C，半衰期為 20 分鐘)、
氮-13 (13N，半衰期為 10 分鐘)、氧-15 (15O，半衰期為 2 分鐘)，及氟-18 (18F，半衰
期為110 分鐘)。這些放射性核種都會進行 β 衰變而放出正子。正子是一種與電子 具有相同質量與電價的粒子，只是電子帶負電，而正子帶正電。正子在自然界中 是不穩定的粒子，當它產生後，很快就會與電子碰撞產生互毀反應(annihilation)，
而放射出兩條呈現180 度走向，能量為 511 keV 的 γ 射線。使用正子斷層造影有下 列優點：它的掃描過程為非侵入性，病人可進行多次掃描，可進行全身性的掃描，
可使用具有不同生化標的核醫藥物來取得分子影像等。正子斷層造影本身即為功 能性影像，現代的儀器多搭配電腦斷層掃描(computed tomography, CT)，使正子斷 層造影的解剖位置更加精確。
1.3.4 神經病變性疼痛病人的功能性腦影像研究
使用大腦影像技術，來偵測神經病變性疼痛病人的腦部有什麼異常的活動，
可以提供了解腦部功能性改變的管道，甚至作為未來診斷與治療的基礎。以fMRI 的研究來說，Peyron et al. (2004)針對多種神經損傷的神經病變性疼痛病人，包括 周邊神經損傷，中樞的脊髓、腦幹、丘腦、紋狀體及大腦皮質損傷的病人進行fMRI 掃描，他們在病人體表的敏感區域以毛刷或冰水刺激，可見初級及次級體感覺皮 質、島狀皮質、初級運動皮質、運動輔助區、後頂葉皮質及前扣帶迴皮質等區域 都有血氧濃度增加的情形。Schweinhardt et al. (2006)也針對多種的神經病變性疼痛 病人來進行fMRI 掃描，當他們以毛刷刺激病人的敏感區時，在前島狀皮質、後島 狀皮質、前扣帶迴皮質、初級及次級體感覺皮質、前額葉皮質、下頂葉皮質、運 動輔助區、丘腦、紋狀體及小腦等區域都可以看見血氧濃度增加，而前島狀皮質 的後側與病人的觸感痛強度有關。Geha et al. (2008)針對疱疹後神經痛的病人進行 掃描，在毛刷刺激敏感區的情況下，在病人腦中的中顳葉、島狀皮質、杏仁核、
殼核、初級體感覺皮質、前扣帶迴皮質、運動輔助區、丘腦、導水管旁灰質及小 腦等區域的血氧濃度有明顯增加。
除了利用fMRI 來偵測神經病變性疼痛在腦部產生的變化，也有一些學者使用 PET 來研究這個問題。Petrovic et al. (1999)對下肢神經損傷的神經病變性疼痛病人 的腦部進行PET 掃描，他們使用15O-butanol 這種放射性追蹤劑來偵測腦中局部血 流量(rCBF)的變化，發現當用毛刷刺激病人的敏感區時，在雙側的初級及次級體感 覺皮質、前扣帶迴皮質、運動皮質及丘腦，以及對側的後頂葉皮質、導水管旁灰 質等區域有 rCBF 增加的現象。Witting et al. (2001)在正常人的前臂注射辣椒素 (capsaicin)而產生疼痛敏感的區域，接著對這些人的腦部進行 PET 掃描，他們使用 的放射性追蹤劑是H215O，也是用來偵測 rCBF 變化的追蹤劑，結果發現用毛刷刺 激前臂敏感區時，對側的體感覺聯合皮質，及雙側的前額葉、島狀皮質等有rCBF 上升的情形，但是在丘腦與初級體感覺皮質並未看到變化。Witting et al. (2006)後 來又利用同樣的實驗方法來掃描肢體神經損傷的神經病變性疼痛病人，在毛刷的 刺激之下，他們發現在對側的前額眼眶皮質及同側的島狀皮質有 rCBF 增加的情 形，而丘腦及初級體感覺皮質仍舊沒有變化。
1.3.5 選擇正子斷層造影的理由
早期要研究疼痛動物模式的腦部功能性變化，自體放射顯影法提供一個解析 度高的影像，但其操作需求複雜，顯影時間長，而更大的問題在於進行自動放射 顯影法實驗時，動物必須犧牲，因此無法在同一隻動物上觀察到給予疼痛刺激前 後，腦部發生了什麼變化。功能性磁振造影在研究病人的疼痛問題提供一個相當 好的工具，但由於病人的疼痛種類、病史、年紀及受傷部位不易控制，使用動物 模式可以解決來源複雜的問題；但動物在進行功能性磁振造影過程中需要麻醉，
這限制了功能性磁振造影在疼痛動物模式的應用性。同樣可進行多次掃描的正子 斷層造影，雖然其影像的解析度低於自體放射顯影法，但可比較同一隻動物在不 同處理時的腦部功能性變化；此外正子斷層造影更大的優勢在於，動物可在清醒 狀態下接受疼痛刺激，且腦部影像可反映不同處理下的功能性變化(Chen et al.,
2014)。臨床上經常使用的核醫藥物為葡萄糖類似物 18F-FDG (18F-Fluorodeoxy- glucose)。當 FDG 注射入動物血管內，需要大約 30 至 60 分鐘分布並被組織吸收；
而細胞攝取FDG 後，會經由 hexokinase 將 FDG 轉變為 FDG-6-phosphate，然後以 此種形式的中間產物停留在細胞內。我們可在FDG 分布及被細胞吸收的過程中給 予動物刺激，而因刺激所活化的腦部神經元會吸收較多的FDG (Chih et al., 2001)；
當分布時間結束，動物雖然需要麻醉以進行掃描，但其細胞所攝取的FDG 會停留 在細胞內並不斷衰變產生正子，而透過掃描儀的接收訊號及影像重建即可建立三 維的吸收影像。
1.4 疼痛的細胞分子標記 1.4.1 c-Fos
研究神經系統在疼痛刺激下的功能性變化，除了電生理記錄與影像學的分 析，學者們也希望能找到與疼痛反應直接相關的分子標記(molecular marker)，但目 前並無這樣的疼痛標記(pain marker)存在。生物體內有一些基因，平常並不表現其 特定的蛋白，但在受到外界某些刺激之後，會很快的轉譯出調節蛋白，這些基因 稱 為 迅 速 早 發 型 基 因(immediate early gene, IEG) 。 有 一 種 原 致 癌 基 因(proto- oncogene)稱為 c-fos，也是屬於迅速早發型基因的一種，這個基因在受到適當刺激 下數分鐘內就會產生mRNA，約 30 分鐘後可產生 Fos 蛋白，而在刺激後兩小時達 到蛋白量的高峰。Hunt et al. (1987)發現在脊髓背角的神經元，當接受傷害性刺激 時，會大量表現出c-Fos 蛋白，而在未刺激或接受觸覺刺激時則僅表現出少量 c-Fos 蛋白。Bullitt (1990)進一步證明 c-Fos 蛋白在脊髓背角的分布具有軀體定位的排列 (somatotopic organization)。後續有更多報告指出脊髓背角的 c-Fos 蛋白在發炎性疼 痛、神經病變性疼痛及內臟性疼痛中都有大量表現的情況(Bester et al., 2000;
Catheline et al., 1999; DeLeo et al., 1991; Jin et al., 1999)。但 c-Fos 蛋白只是一種轉錄 因子(transcription factor)，它的分布也不與疼痛路徑有關，比如說雖然脊髓背角的
神經元會在疼痛刺激下產生c-Fos 蛋白，但背根神經節的神經元不管在什麼刺激下 都不會產生c-Fos 蛋白(Hunt et al., 1987)。儘管如此，在對照條件精確地控制之下，
c-Fos 蛋白仍可在脊髓背角用來定量疼痛刺激的強度(Dai et al., 2001)。
1.4.2 pERK
Ji et al. (1999)最早發現當周邊給予傷害性刺激時，會使得脊髓背角細胞表現出 pERK (phosphorylated extracellular signal-regulated kinases)這種細胞內的激酶；若給 予非傷害性刺激或一般的觸覺刺激，則不會引發 pERK 的表現。後來在不同的疼 痛動物模式中，不管是發炎痛、內臟性疼痛或是神經病變性疼痛，都可以在脊髓 背角細胞中看見 pERK 的表現(Galan et al., 2003; Ji et al., 2002; Zhuang et al., 2005)。特別是在慢性壓迫傷害造成的神經病變性疼痛中，若給予解除壓迫的處理，
使動物恢復正常的痛覺時，也可見到pERK 的表現回復到正常的情況(Tseng et al., 2007)。以往認為 c-Fos 蛋白的表現可作為痛覺神經活化的一種指標(Hunt et al., 1987)，但誘發 pERK 的表現比誘發 c-Fos 蛋白的表現還要迅速，並可作為中樞敏 感化現象的生化指標(Gao and Ji, 2009)。近年來更發現 pERK 不僅在脊髓背角神經 可作為中樞敏感化的指標外，在背根神經節也可以作為周邊敏感化的指標(Dai et al., 2002)；而在大腦的某些核區如前扣帶迴皮質(anterior cingulate cortex, ACC)、島 狀皮質(insular cortex, IC)、杏仁體中央核(central nucleus of amygdala, CeA)等，其 pERK 的表現也與不同種類的疼痛有關(Alvarez et al., 2009; Carrasquillo and Gereau, 2007; Wei and Zhuo, 2008)。
1.5 研究目的
神經病變性疼痛的臨床症狀有自發性疼痛、觸感痛及痛覺過敏等現象，其中 觸感痛造成病人生活極大的困擾，因為原本不會痛的輕觸覺刺激現在卻造成疼 痛；而觸感痛使腦部產生了什麼變化，目前還沒有清楚的結論。我們假設觸感痛
會造成腦部神經的活動量產生變化，而使用FDG 配合正子斷層造影，可以由葡萄 糖代謝率的改變來推測腦部的功能性變化；我們另使用臨床上治療神經病變性疼 痛的藥物 GBP，比較止痛後的腦部發生了什麼樣的功能性變化。除了影像學的方 法外，我們也使用免疫組織化學的方法，來偵測輕觸覺刺激下腦中部分核區的神 經活化分子標誌的變化，以及GBP 止痛後對這些核區的影響。本論文的實驗可分 為三個部分，第一部分為建立神經病變性疼痛的動物模式，並記錄疼痛的症狀以 及找出合適的GBP 止痛劑量。第二部分為對清醒神經損傷大鼠的腳掌給予輕觸覺 刺激，比較觸感痛反應下大鼠腦中的功能性變化，以及給予GBP 後，比較止痛後 的腦部產生了什麼樣的功能性變化。第三部分為使用免疫組織化學來偵測輕觸覺 刺激下神經損傷大鼠腦中的pERK 及 c-Fos 變化，以及給予 GBP 止痛後，腦中的 pERK 及 c-Fos 產生什麼改變，是否與正子斷層造影的影像有相關性，以確定腦部 哪個核區與觸感痛有關。
第二章、神經損傷大鼠的疼痛行為指標與gabapentin 的藥效測試
2.1 前言
神經病變性疼痛的症狀有自發性及誘發性疼痛，誘發性疼痛又可區分為對原 本不會產生疼痛的輕微刺激所導致的疼痛(如觸感痛)，以及對原本就會疼痛的刺激 呈現更強烈的痛覺(稱為痛覺過敏)。以大鼠作為神經病變性疼痛動物模式，可藉由 測定大鼠對於傷害性刺激的行為反應來推測大鼠具有痛覺(Sandkuhler, 2009)。但大 鼠無法像人類一樣可透過言語表達是否有自發性疼痛，因此尋找合適的自發性疼 痛行為指標是重要卻困難的工作。有關周邊神經損傷大鼠的自發性疼痛行為指 標，早期常見的有疼痛處的保護行為(guarding behavior) (Mao et al., 1992)，或異常 的抬腳行為(lifting behavior) (Choi et al., 1994)，但這些行為是否能代表自發性疼痛 行為還有不少爭論。King et al. (2009)採用操作制約學習(operant conditioning)中的 負增強(negative reinforcement)方法，利用可自由選擇的場所，提供神經病變性疼痛 大鼠逃離持續性的自發性疼痛的嫌惡刺激(aversive stimulus)，是目前認為能代表自 發性疼痛行為的指標(He et al., 2012; King et al., 2009; Qu et al., 2011)。本研究即採 用這種位置偏好制約實驗(conditioned place preference, CPP)來測定神經損傷大鼠 的自發性疼痛行為。
Gabapentin (GBP) 為 目 前 臨 床 上 治 療 神 經 病 變 性 疼 痛 病 人 的 第 一 線 藥 物 (Finnerup et al., 2005)。使用 GBP 作為神經病變性疼痛大鼠的止痛藥已有不少報告 發表，但各篇報告的使用劑量及止痛效果存在差異(Abdi et al., 1998; Back et al., 2004; Erichsen and Blackburn-Munro, 2002; Field et al., 1999b; Hama and Borsook, 2005; Kayser and Christensen, 2000)。為了建立本研究所使用的最佳劑量及作用時 效，我們測試了GBP 不同劑量的止痛效果；此外為了解 GBP 的不同劑量是否會造 成大鼠的運動失調(ataxia)的現象，我們也測試了大鼠在注射 GBP 後的平衡運動功
能。本章的研究乃為建立神經病變性疼痛的大鼠模式，其不同的疼痛行為指標與 GBP 的藥效測試，以作為後續研究的基本資料。
2.2 材料與方法 2.2.1 實驗動物
本研究使用的實驗動物均為雄性Sprague-Dawley (SD)品系大鼠。SD 大鼠購買 自樂斯科(BioLASCO)生物科技股份有限公司。每隻大鼠自運抵實驗室後，即飼養 在台灣大學生命科學館的動物房內，並至少經過一週的適應之後才開始進行實 驗。每 2 至 3 隻大鼠飼養在同個鼠籠內，並充分提供食物及飲水。動物房的光暗 週期各為12 小時，恆溫控制在 23 ± 2°C。所有實驗動物操作均遵照台灣大學實驗 動物管理與使用規範。
2.2.2 動物模式建立
本研究使用的神經病變性疼痛動物模式為大鼠的坐骨神經分支選擇性傷害(簡 稱SNI)模式(Decosterd and Woolf, 2000)。進行 SNI 手術前，以腹腔注射 65 mg/kg pentobarbital 誘導麻醉後，將大鼠的左後腳剃毛，固定在鼠板上。以 70%酒精及優 碘先後消毒後，切開皮膚與肌肉，暴露出坐骨神經及其分支。以玻璃鉤仔細分出 脛神經及腓總神經，在遠心端處以6-0 絲線結紮並切斷，保留腓腸神經完整。手術 後依序縫合肌肉與皮膚，以優碘消毒後，將大鼠放在熱燈下維持體溫，等待其甦 醒。將手術後大鼠送回動物房後，連續三天每日檢查傷口復原情況。我們另作假 手術(Sham)的老鼠作為對照組，假手術的作法與 SNI 大致相同，惟在暴露坐骨神 經後即縫合，並未傷害坐骨神經及其分支。
2.2.3 觸感痛行為測定
為了確定SNI 大鼠是否具有觸感痛，我們使用購買自 North Coast Medical 公
司的 von Frey hairs 來測定大鼠的觸覺閾值。八週齡的雄性 SD 大鼠(體重約 300 克)，隨機分配為 SNI 組(n = 6)及 Sham 組(n = 6)。我們選用 8 支不同克數的 von Frey 尼龍製細毛棒，分別為0.4、0.6、1、2、4、6、8、15 克。行為測試前，大鼠先移 至透明壓克力籠中，其底部為不鏽鋼製網格地板，可供細毛棒穿過並刺激大鼠的 後腳掌外側部位，即腓腸神經支配的區域。為避免大鼠在測試籠中躁動，至少需 在開始測試前15 分鐘放入大鼠，使其適應環境並保持清醒靜止的狀態。行為測試 開始時，先以2 克的細毛棒接觸後腳掌，再使細毛棒彎曲以傳遞足夠的刺激強度，
並保持彎曲狀態6 至 8 秒，若大鼠快速地縮起後腳掌，間隔約 5 秒後則以 1 克的 細毛棒刺激；若大鼠對2 克的細毛棒刺激沒有反應，間隔約 5 秒後繼續以 4 克的 細毛棒刺激；此即為up-down 方式(Dixon, 1980)。當找出大鼠後腳掌對細毛棒刺激 的縮腳克數時，在此克數刺激上下再反覆測試4 次，可得到閾值刺激的反應模式，
查Chaplan et al. (1994a)的附表後將此模式的值帶入下述公式計算：
50% g threshold = (10[Xf + κδ]) / 10000
Xf 為最後一次測試所使用的 von Frey hair 克數(換算為 log 表示)；
κ 為閾值刺激模式的查表值；
δ 為所選用 von Frey hairs 克數差的平均值(換算為 log 表示)，在此為 0.225。
每隻大鼠的左右後腳掌各作三次測定，取其平均值作為 50%縮腳閾值的所需 強度(克數)。為評估神經損傷疼痛的發展過程，不同處理組的大鼠皆在手術前 1 日，
手術後第3、5、7、14 日等測定機械性觸感痛程度。
2.2.4 熱痛覺過敏行為測定
為了確定SNI 大鼠是否具有痛覺過敏的現象，我們使用輻射熱(radiant heat)刺
激來測定大鼠的熱痛覺過敏行為(Hargreaves et al., 1988)。Plantar Analgesia Meter (Model 390)購買自 IITC 公司，為一可調整輻射熱刺激強度的儀器，可提供 0.5 平 方公分的橢圓形光斑產生穩定的熱刺激。八週齡的雄性SD 大鼠(體重約 300 克)，
隨機分配為SNI 組(n = 6)及 Sham 組(n = 6)。在行為測試前，將大鼠放入透明壓克 力籠中，其底部為恆溫控制的樹脂玻璃板，其溫度可控制在 30°C，與大鼠的腳掌 溫度相同(Dirig et al., 1997)。為避免大鼠在籠內躁動，至少需在開始測試前 20 分 鐘放入大鼠，使其適應環境並保持清醒靜止的狀態。行為測試開始時，令輻射熱 的 光 斑 刺 激 大 鼠 的 後 腳 掌 外 側( 腓 腸 神 經 支 配 部 位 ) ， 記 錄 其 縮 腳 的 時 間 差 (latency)，若此時間差超過 20 秒大鼠仍未縮腳，則儀器會自動切斷輻射熱刺激，
以避免組織傷害；每次刺激的間隔時間至少5 分鐘，以避免腳掌組織的傷害(Dirig et al., 1997)。每隻大鼠的左右後腳掌各作五次測定，取其平均值作為熱刺激縮腳的 閾值時間。為評估神經損傷疼痛的發展過程，此熱痛覺過敏的測定日程如同觸感 痛測定的日程。為避免熱痛覺過敏的結果影響觸感痛實驗，每次測定日程皆先完 成觸感痛實驗，再進行熱痛覺過敏實驗。
2.2.5 自發性疼痛行為測定
為評估SNI 大鼠是否有自發性疼痛現象，我們使用位置偏好制約(CPP)實驗來 記錄大鼠的行為。CPP 實驗改良自 Sufka (1994)及 King et al. (2009)。CPP 行為箱為 一長方形的壓克力箱，長70 公分，寬 22 公分，高 30 公分，有兩個隔板，共分為 三個區域。中間為灰色牆面的中性區(neutral room)，長 10 公分，並有兩扇拉門通 往左右的選擇區。兩側的選擇區除了大小相同外(長均為 30 公分)，其牆面(黑白直 條紋或橫紋)與地板(光滑或有均勻分布的孔洞)可將此二區域作一明顯的區別。八 週齡的雄性SD 大鼠(體重約 300 克)，隨機分配為 SNI 組(n = 6)及 Sham 組(n = 3)，
大鼠在手術後7 天進行 CPP 實驗。CPP 實驗包括連續三天的環境適應期，第四天 的藥物與環境配對及第五天的位置偏好選擇。CPP 實驗皆在白天期間進行(上午 9
點至下午4 點)。在前三天的環境適應期，每隻大鼠每天進入 CPP 行為箱中自由探 索 30 分鐘，並無使用拉門阻擋。在第三天的自由探索中，前 15 分鐘記錄大鼠在 不同區域的停留時間，作為制約前紀錄。若在此制約前紀錄中受測鼠有明顯的偏 好某個區域(停留超過 80%時間，即 12 分鐘)，此受測鼠將排除不作後續實驗。在 第四天的藥物與環境配對中，上午時受測鼠以腹腔注射生理食鹽水(vehicle，體積 為1 ml/kg)後，隨機放入某個選擇區中 30 分鐘，並將拉門關閉。4 小時後，受測鼠 以腹腔注射GBP (100 mg/kg)後，隨即放入另一個選擇區中 30 分鐘，並將拉門關 閉。第五天，即注射GBP 20 小時後，讓受測鼠在 CPP 行為箱中自由活動，並記 錄15 分鐘大鼠在不同選擇區中的停留時間。
2.2.6 GBP 藥效測試
為測試GBP 的止痛效果，我們選用不同的劑量，並配合觸感痛行為測試，來 確定 GBP 的止痛藥效。試藥級(純度 98%以上)的 GBP 購買自 TCI 公司(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd; Japan)，使用前溶於無菌生理食鹽水中。我們以生理食 鹽水、10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg 及 100 mg/kg 五種劑量測試 SNI 大鼠的縮腳 閾值變化，每個劑量用4 隻雄性 SNI 大鼠(體重約 300 ~ 400 克)為測試對象。測試 的時程共3 小時，分別在打藥前及打藥後 30、60、90、120、150 及 180 分鐘分別 測試大鼠的縮腳閾值，每隻大鼠在每個時間點共測 3 次，每次測量間隔時間為 3 分鐘(Park et al., 2010)。
2.2.7 運動平衡感測試
為確認我們所使用的劑量是否會使大鼠有運動失調的現象，我們也測量了大 鼠在滾筒式跑步機上的平衡感與動作協調性(Hamm et al., 1994)。滾筒式跑步機 (single lane rotarod, MK-630B)購買自日本的 Muromachi Kikai 公司。我們一樣採用 生理食鹽水、10 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg 及 100 mg/kg 五種劑量來測試大鼠在
滾筒式跑步機上的停留時間，每個劑量用4 隻雄性 SNI 大鼠(體重約 300 ~ 400 克)。
測試的時間點如同GBP 藥效測試，在給藥前及給藥後每隔 30 分鐘測試，一直到 3 小時後。滾筒式跑步機的測試條件為定速15 rpm 的轉速，看大鼠能否在滾筒上維 持 150 秒鐘而不掉落。若大鼠在 150 秒內掉落則記錄掉落時間；若大鼠持續跑步 到150 秒而不掉落，就停止測試並將大鼠放回籠子中。每個時間點每隻大鼠共測 3 次，每次測試間隔時間為3 分鐘(Park et al., 2010)。
2.2.8 統計分析
本研究的統計分析，均使用SigmaStat 3.1 的軟體進行計算。在觸感痛測定的 結果分析，SNI 組及 Sham 組的同側(手術側)及對側腳掌的縮腳閾值分別以重複取 樣單因子等級變異數分析(one-way repeated measures of ANOVA on ranks)進行統計 分析，若結果顯示有差異時再進行事後(post hoc)檢定，事後檢定採用 Tukey 方式 檢定，並設p < 0.05 為顯著差異。單側腳掌的閾值變化皆對手術前的基準值作比 較。在熱痛覺過敏測定的結果分析，SNI 組及 Sham 組的同側(手術側)及對側腳掌 的縮腳時間差分別以單因子重複取樣變異數分析(one-way repeated measures of ANOVA)進行統計分析，若結果顯示有差異時再進行事後檢定，事後檢定採用 Tukey 方式檢定，並設 p < 0.05 為顯著差異。在自發性疼痛的結果分析，SNI 組及 Sham 組的不同環境配對結果以 paired t-test 檢定，並設 p < 0.05 為顯著差異。在 GBP 藥效試驗的結果分析，同一劑量的不同時間縮腳閾值變化，採用與觸感痛測 定的相同分析方法，而事後檢定為不同時間點對施打藥物前的基準值作比較，並 設p < 0.05 為顯著差異。在運動平衡感的結果分析，以單因子重覆取樣變異數分析 (one-way repeated measures of ANOVA)進行檢定，若有差異時再進行事後檢定，採 用Tukey 方式，以 p < 0.05 設為顯著差異。統計分析之後的結果，若無特別註明，
皆以平均值(mean) ± 標準差(standard deviation, SD)呈現。
2.3 結果
2.3.1 觸感痛行為
周邊神經病變性疼痛通常肇因於周邊神經受到傷害所產生的疼痛，SNI 模式乃 利用手術結紮並切除坐骨神經的兩個分支，因此在 SNI 手術之後，大鼠的確表現 出神經病變性疼痛的症狀。我們使用von Frey hairs 測試大鼠的縮腳閾值變化。如 圖 2-1，在 SNI 組中，手術側的後腳掌縮腳閾值，從手術前的 14.2 克，在手術後 第三天就降到2.7 克，並在手術後兩週內維持在 3 克以下；與手術前的閾值比較，
這個降低的縮腳閾值具有顯著差異(p < 0.01)。而在 SNI 組的手術對側腳掌，及 Sham 組的兩側腳掌縮腳閾值，在手術前後並沒有明顯變化，也沒有統計上的差異。可 知SNI 手術引發了穩定且明顯的觸感痛行為。
2.3.2 熱痛覺過敏行為
神經損傷大鼠除了觸感痛行為外，也會表現出痛覺過敏的行為。我們以輻射 熱刺激來測試大鼠的縮腳反應。在調整適當的輻射熱強度下，讓正常大鼠的縮腳 閾值時間約為10 ~ 12 秒。如圖 2-2，在 SNI 組中，手術側的縮腳閾值時間，從手 術前的11.7 秒，在手術後第三天就降到 7.5 秒，並在手術後兩週內維持在 7.5 秒以 下；與手術前的縮腳閾值時間比較，這個降低的閾值時間差(4 ~ 5 秒)具有顯著差 異(p < 0.05)。而在 SNI 組的手術對側腳掌，及 Sham 組的兩側腳掌縮腳閾值時間，
在手術前後並沒有統計上的差異。可知SNI 手術引發了穩定且明顯的熱痛覺過敏。
2.3.3 自發性疼痛行為
SNI 組及 Sham 組大鼠在藥物(GBP)與環境配對 20 小時後，讓大鼠自由選擇是 否有環境偏好性行為。結果如圖 2-3 所示，SNI 組大鼠對 GBP 配對房間(選擇區) 的停留時間(283 ± 77 s)比生理食鹽水配對房間的停留時間(100 ± 24 s)還長，並有統 計上的顯著性(p < 0.05)；而 Sham 組大鼠對 GBP 配對房間的停留時間(188 ± 38 s)
與生理食鹽水配對房間的停留時間(151 ± 39 s)相比並沒有明顯的差異。由 SNI 組 大鼠偏好GBP 配對房間的行為顯示 SNI 組大鼠具有自發性疼痛現象。
2.3.4 GBP 止痛效果
以腹腔注射不同劑量的GBP 在 SNI 大鼠體內，可見 GBP 的止痛效果有劑量 依賴性(dose-dependent)的結果，如圖 2-4 所示。在注射生理實驗水、10 mg/kg 及 30 mg/kg 的劑量下，GBP 並沒有止痛的效果。而注射了 60 mg/kg 的 GBP，在注射 後60 分鐘，其對 von Frey hairs 的縮腳閾值從注射前的 4.1 克上升到 9.2 克，具有 顯著的差異(p < 0.05)，並能維持到注射後 90 分鐘還有顯著的止痛效果。而注射 100 mg/kg GBP 的大鼠，其明顯的止痛效果也自注射後 60 分鐘開始，並一直維持到注 射後120 分鐘還是具有顯著的止痛效果。因此我們在後續的實驗將採用 100 mg/kg 的劑量來作為有效的止痛劑量。
2.3.5 運動平衡感
為了解GBP 是否有明顯的副作用，如有運動失調的行為，我們也注射不同劑 量的GBP，來看大鼠在滾筒式跑步機上的維持時間。如圖 2-5，由實驗結果顯示，
不同劑量的GBP 並不會明顯影響大鼠在滾筒式跑步機上的維持時間，因此我們選 用的100 mg/kg 並不會對老鼠造成運動功能失調的副作用。
2.4 討論
周邊神經損傷會引發神經病變性疼痛。我們以大鼠的坐骨神經部分損傷為模 式，在切斷脛神經及腓總神經三天後，神經損傷大鼠即表現出神經病變性疼痛的 症狀，包括自發性疼痛、觸感痛及熱痛覺過敏等現象，且這些症狀至少可以穩定 地持續兩週。給予神經損傷大鼠適當劑量的GBP 止痛後，自發性疼痛及觸感痛的 現象能暫時性緩解。由這些疼痛行為指標顯示，SNI 手術成功地引發大鼠神經病變
性疼痛。
觸感痛是神經病變性疼痛的主要症狀之一。觸感痛指的是原先不會引發疼痛 的觸覺刺激，在周邊神經損傷之後，相同的刺激卻開始引發疼痛。由於疼痛在周 邊神經系統，是由初級痛覺神經(Aδ 及 C 纖維細胞)將傷害性訊息編碼(encode)而傳 遞，因此觸感痛是因高閾值(high threshold)的初級痛覺神經改變了細胞特性變為低 閾值，而開始將觸覺訊息編碼而傳遞？或是由負責觸覺訊息的低閾值的Aβ 細胞，
在中樞神經系統興奮了第二級的痛覺神經？目前的研究顯示觸感痛主要是由 Aβ
細胞傳遞的觸覺訊息，在周邊神經損傷造成中樞敏感化後，興奮了脊髓背角的痛 覺神經(Campbell et al., 1988; Devor, 2009; Gracely et al., 1992; Liu et al., 2000;
Ossipov et al., 1999; Shir and Seltzer, 1990)。Aβ 細胞如何將觸覺訊息興奮痛覺神 經，目前的解釋包括Aβ 細胞的中樞突起會萌生新的分支分布在脊髓背角表淺層的 第二級痛覺神經，以及Aβ 細胞的表型轉換等現象(Devor, 2009; Lekan et al., 1996;
Noguchi et al., 1995; Weissner et al., 2006; Woolf et al., 1992; Woolf et al., 1995)；但因 觸感痛反應可在神經損傷後24 小時即明顯出現(Liu et al., 2000)，且有報告指出表 型轉換的Aβ 細胞並不會造成觸感痛(Hughes et al., 2007)，而破壞 Aβ 軸突上行的路 徑(dorsal column tract)也能有效減輕觸感痛(Back et al., 2003; Sun et al., 2001)，因此 有關Aβ 細胞造成觸感痛的機制仍有待研究。由於觸感痛的發展快速，可穩定維持 長時間，以及測試方便等原因，在本論文後續的實驗皆以測試觸感痛行為來確認 大鼠是否具有神經病變性疼痛。
痛覺過敏也是神經病變性疼痛的主要症狀之一。我們以輻射熱刺激來測試神 經損傷大鼠的痛覺過敏行為，結果神經損傷大鼠對固定強度的輻射熱刺激的反應 時間變短，顯示大鼠有熱痛覺過敏現象。與Aβ 細胞負責傳遞觸感痛訊息不同，熱 痛覺過敏行為是由C 纖維細胞負責傳遞(Field et al., 1999a; Ossipov et al., 1999; Shir
and Seltzer, 1990)。在新生鼠皮下注射辣椒素(capsaicin)，或在成年大鼠皮下注射神 經毒素resiniferatoxin (RTX，辣椒素受器 TRPV1 致效劑)，都能造成 C 纖維退化，
且對傷害性熱刺激變得不敏感。由於 C 纖維退化使大鼠對熱痛刺激不敏感，卻仍 保有觸感痛反應，可知Aβ 細胞負責觸感痛反應(Field et al., 1999a; Ossipov et al., 1999; Shir and Seltzer, 1990)。Decosterd and Woolf (2000)建立了 SNI 模式，但他們 在測試熱痛覺過敏反應時，卻宣稱SNI 模式沒有熱痛覺過敏。我們在測試 SNI 模 式時，結果有明顯的痛熱覺過敏反應，這之間的差異可能在於測試方法的不同。
雖然Decosterd and Woolf 及我們都使用輻射熱刺激的方法，但 Decosterd and Woolf 可能沒有調整輻射熱刺激的強度，因此大鼠的縮腳閾值時間都在 5 秒以內，這樣 短的反應時間在SNI 組及 Sham 組之間容易造成沒有統計上的差異；若將輻射熱強 度調整到如Hargreaves et al. (1988)測試的正常大鼠反應時間(約 10 ~ 12 秒)，較能 夠清楚顯示熱痛覺過敏現象。
自發性疼痛是神經病變性疼痛病人的主訴症狀之一，但神經病變性疼痛的實 驗動物模式卻無法表達自發性疼痛，只能由研究者依據一些異常的行為來推測動 物具有自發性疼痛。CPP 實驗採用操作制約學習的方式，可以清楚表示動物具有 自發性疼痛。我們使用CPP 實驗來偵測 SNI 大鼠是否有自發性疼痛行為，由 SNI 大鼠偏好選擇與止痛藥GBP 配對的房間，顯示神經損傷大鼠應具有自發性疼痛。
藉由CPP 實驗，除了可顯示神經損傷大鼠具有自發性疼痛(King et al., 2009)，還能 夠顯示自發性疼痛來自於表現TRPV1 的痛覺神經，而不是來自於 Aβ 細胞的異常 活動(King et al., 2011)。破壞 ACC 的神經元可以去除自發性疼痛，顯示自發性疼痛 與內側痛覺路徑有關(Qu et al., 2011)。在本研究中，我們的實驗設計與其它研究者 的作法有部分不同。在King et al. (2009)的實驗中，止痛藥物 clonidine (腎上腺素 α2 受器致效劑)是以脊髓腔給藥的方式作用，我們則以腹腔注射 GBP 作為止痛方式。
由我們的GBP 藥效測試，在腹腔內注射 GBP 30 分鐘後觸覺閾值的變化尚未有顯
著差異，儘管我們只讓大鼠在注射GBP 後與環境配對 30 分鐘，但結果仍顯示 SNI 大鼠明顯的偏好GBP 配對的房間(p = 0.047)，表示 GBP 可用來抑制自發性疼痛，
這個結果與Suzuki and Dickenson (2006)相符；若以脊髓腔給藥的方式注射 GBP，
選擇偏好的行為應可更明顯。
我們測試不同劑量的 GBP 對觸感痛的止痛作用，結果顯示 60 mg/kg 及 100 mg/kg 可有效地抑制觸感痛反應，這個結果與其它報告的結果相符(Erichsen and Blackburn-Munro, 2002; Field et al., 1999b; Hama and Borsook, 2005)。由於 60 mg/kg 的 GBP 雖然在注射 1 小時後可顯著抑制觸感痛，但它的藥效只維持 30 分鐘(圖 2-4)，這段時間不足以提供正子造影前的 FDG 分布期間的止痛作用，因此我們選 擇100 mg/kg 為後續研究的劑量。但需注意的是，100 mg/kg 的 GBP 可能只適用於 周邊神經損傷的成年大鼠，不同的實驗動物模式及不同週齡的大鼠可能會有不同 的效果；最近我們嘗試給予6 ~ 7 週齡的雄性 SD 大鼠(體重約 220 克)注射 100 mg/kg GBP，結果 GBP 的止痛作用在注射 30 分鐘後即有顯著效果，且維持 3 小時以上的 作用時間，因此在實驗前應作確效(validation)試驗。臨床上接受 GBP 治療神經病 變性疼痛的病人較常抱怨的副作用是頭暈及步態不穩(Gilron, 2007; Nicholson, 2000)，我們也測試了 SNI 大鼠在注射不同劑量的 GBP 後，其在滾筒式跑步機上的 運動功能，結果顯示即使是100 mg/kg 的劑量也不會明顯的影響大鼠的運動功能，
因此我們使用100 mg/kg 的劑量是合理的有效止痛劑量。
本章的工作在於建立神經病變性疼痛的大鼠模式，我們的結果顯示 SNI 大鼠 具有自發性疼痛、觸感痛及熱痛覺過敏，而止痛藥GBP 可有效緩解這三種症狀。
由於觸感痛是臨床病人常抱怨的症狀，且目前對觸感痛在腦中引起的功能性變化 還不清楚，因此在後續的研究中我們將聚焦在觸感痛對神經損傷大鼠腦部的影響。
