第二章 材料與方法
2.2 實驗方法
2.2.1 柚籽表面黏質物的製備
方法：
取40粒柚籽，秤取乾重。每8粒柚籽 (約1.38 g)放入一50 mL之離心 管，加入10 mL室溫的二次水，於室溫下振盪10分鐘後，取出溶液並 重複萃取至柚籽表層不含黏質物。收集的萃取液混合均勻，以glass microfiber filter (Whatman®No.1820090)抽氣過濾，將濾液經冷凍乾燥 後，計算所得的萃取物粉末萃取回收率，並保存於-20℃。
計算公式：
產率 (%) = (萃取物乾重/柚籽乾重) × 100%
2.2.2 陰離子交換層析法(anion exchange chromatography) 純化
原理：
利用交換介質表面帶正電荷的特性，可吸附樣品內帶負電之物質，
而將不帶電荷及帶正電之物質直接流出，爾後使用與交換介質結合力
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更強的高鹽離子溶液將帶負電物質洗提出，收集流出物進行分析並冷 凍乾燥後可得部份純化多醣。
方法：
1. 層 析 管 柱 ： Econo-Column Chromatography Column #737-5011, BIO-RAD, USA (Max capacity：196 mL)
2. 交換介質：DE (diethylaminoethyl cellulose)-52 陰離子交換樹脂 (Whatman®)
3. 梯度生成器：Gradient Mixer #GM-1, Pharmacia, Sweden
4. 幫浦：Pulse-Free Flow Peristaltic Pump #MINIPULS® 3, Gilson, France
5. 自動收集器：Fraction Collector #FC 203, Gilson, USA 6. 流速：1.96 mL/min
7. 收集單位：7.9 mL/tube
8. NaCl 濃度梯度：280 mL 1 M NaCl (MERCK, 1.06404)與 280 mL 二次水
9. 樣品：25 mL (1.5 mg/mL) 柚籽表面黏質萃取物
10. 步驟：取 95 g 樹脂放入燒杯，加入二次水混合均勻，待樹脂沉降 後除去上清液，重複清洗數次。回溶至 190 mL 混合均勻後緩緩 注入管柱，並以二次水流洗膠體約 30 分鐘，並靜置膠體至隔日。
待膠體完全沉降緊密後，注入樣品，打開蠕動幫浦，以分劃收集 器收集流出物。首先流洗 170 mL 二次水，將不吸附之物質完全 流 出 後 ， 開 始 流 洗 連 續 的 NaCl 濃 度 梯 度 (continuous NaCl gradient)。
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11. 檢測：以酚-硫酸呈色法 (Dubois et al, 1956)檢測所收集的各 fraction 總醣含量；以 Blumenkrantz 與 Asboe-Hansen (1973)的方 法檢測各 fraction 醣醛酸含量。
12. 回收：將含多醣之流出物經過透析並冷凍乾燥後可計算回收率。
計算公式：
回收率 (%) = (純化多醣的乾重/柚籽表面黏質萃取物的乾重) × 100%
2.2.3 多醣體組成分析 2.2.3.1 總醣含量測定
原理：
以酚-硫酸呈色法 (phenol-sulfuric acid)測定樣品總醣含量。硫酸使 醣鏈的醣苷鍵水解，水解產生的單醣脫水並與酚結合而產生橙黃色的 產物，此產物於 490 nm 有最大吸光值，並以商品化的 glucose 製作標 準曲線進行比對 (Dubois et al., 1956)。
試劑：
1. 濃硫酸 (J. T. Baker, 9681-03)
2. 5% (w/v)酚 (MERCK, 100206)溶於二次水 3. 2.5 μg/μL D-glucose (MERCK, 8337)溶於二次水 方法：
取 100 μL 樣品，加入 100 μL 酚溶液混合，於冰上緩慢加入 700 μL 冰浴的濃硫酸後，移於室溫反應 30 分鐘。取 200 μL 混合液以 ELISA reader 測定 490 nm 吸光值，並以 D-glucose 製作標準曲線，將樣品吸 光值代入標準曲線可計算得出樣品的總醣含量。
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2.2.3.2 醣醛酸含量測定
原理：
參考 Blumenkrantz 與 Asboe-Hansen (1973)的方法，將 H2SO4/sodium tetraborate 加入樣品中，樣品中所含的 uronic acid 與 tetraborate 於 100℃作用後，再加入 meta-hydroxydiphenyl 生成一紅色產物，此產物 於 520 nm 的吸光值與 uronic acid 的濃度成正比，並以 D-glucouronic acid 標準品製作標準曲線進行比對。
試劑：
1. 0.0125 M sodium tetraborate (Nacalai Tesque, 1303-96-4) 溶 於 H2SO4 (J. T. Baker, 9681-03)
2. 0.15% (w/v) meta-hydroxybiphenyl (Fluka, 54895)溶於 0.5% (w/v) NaOH
3. 2.5 μg/μL D-glucouronic acid (SIGMA, G-5269)溶於二次水 方法：
取 200 μL 樣品，於冰上緩慢加入 1.2 mL 冰浴的 H2SO4/sodium tetraborate，混合均勻後以 100℃水浴加熱作用 5 分鐘後，迅速移至冰 浴冷卻。再加入 20 μL meta-hydroxydiphenyl 呈色，而空白組則加入 20 μL 0.5% NaOH 取代 meta-hydroxydiphenyl，混合均勻後以 ELISA reader 測定 520 nm 吸光值並以 D-glucouronic acid 製作對數標準曲 線，將樣品吸光值減去空白組吸光值，並代入標準曲線可得樣品的總 醣含量。
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2.2.3.3 蛋白質含量測定
原理：
使用 Bradford 染色法，依據 Coomassie brilliant blue G-250 在不同 蛋白質濃度下的顏色變化來測定。此種染劑主要與鹼性與芳香性胺基 酸殘基結合，於 595 nm 有最大吸光值，並以 Albumin 標準品製作標 準曲線進行比對 (Bradford, 1976)。
試劑：
1. 1.67 mg/mL Coomassie brilliant blue G-250 (SIGMA, B-1131)溶於 5% perchloric acid (MERCK, 1.00519)
2. 1 mg/mL bovine albumin (SIGMA, A2153)溶於二次水 方法：
取樣品 200 μL，加入 200 μL Coomassie brilliant blue G-250，混合均 勻後取 200 μL 溶液以 ELISA reader 測定 595 nm 吸光值，並以 Albumin 製作對數標準曲線，將樣品吸光值代入標準曲線可計算得出樣品的蛋 白質含量。
2.2.3.4 醣類成份分析 2.2.3.4.1 中性單醣組成
樣品前處理：
將 50 μL 樣品置入水解管內，加入 50 μL trifluoroacetic acid (TFA, Alfa Aesar, L06374)使最終濃度成為 2 M，抽去空氣至真空，並將水 解管密封，於 110℃作用 2 小時。水解後的樣品利用氮氣吹乾 TFA，
吹乾後的樣品以 700 μL 二次水回溶，混合均勻後以 0.2 μm 針筒尼
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龍過濾膜 (Millex-GN®,SLGNR04NL, Millipore)過濾。
原理：
參考廠商技術手冊資料 【Dionex carboPA10 Analytical (2×250 mm) Product NO.057180 】，濾液通過高鹼陰離子交換層析系統 (high pH anion-exchange chromatography, CarboPA10 2×250 mm column, Dionex, USA)，使用 18 mM NaOH 流洗液，利用電化學 (Electrochemical Detection；Pulsed amperometry, Gold electrodes) 方式分析樣品內中性 單醣。
方法：
1. 將導電度為 18 MΩ 的超純水以抽氣過濾器 (GAST) 經 0.2 μm 過濾膜 (Supor®-200, GelmanSciences) 過濾後，裝入塑膠瓶中，
再予超音波震盪 (Ultrasonic cleaner, Delta®) 以去除氣泡。
2. 使 用 除 氣 的 超 純 水 ， 以 50 ％ (w/w) NaOH 溶 液 (Fisher ChemAlert®) 新鮮配製 18 mM NaOH 與 200 mM NaOH 的流洗 液。
3. 裝置工作電極與參考電極。
4. 使用液相層析系統 (liquid chromatography, Dionex, USA)，打開 除氣閥，將流洗液的氣體流量表調至 5 psi，利用氦氣 100 psi 藉由 GS50 Gradient pump (DIONEX, USA) 將流洗液管路排氣 (PRIME) 約 5 分鐘至無氣泡為止。待排氣完將除氣閥鎖緊。
5. 開啟 Autosampling 系統 (SPECTRA SYSTEM AS3500, Thermo, Finnigan) 與 Detector 系 統 (ED50 electrochemical Detector, Dionex, USA)。
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6. 啟動 chromatography management system (CMS, Chromeleon®, Dionex, USA) 軟體，設定流洗液的流速為 0.25 mLmin-1，開啟 GS50 Gradient pump (DIONEX, USA) 待壓力至 2400 psi 左右設 定 cell on，使用 18 mM NaOH 流洗 Analytical column CarboPA10 2×250 mm column 至 base line 呈水平的平衡狀態。
7. 利用 Autosampling 系統 (SPECTRA SYSTEM AS3500, Thermo, Finnigan)注射針頭自動抽取超純水樣品 25 μL，使用 18 mM NaOH 流 洗 液 注 入 分 析 管 (CarboPA10 2×250 mm column, Dionex, USA)，得知有無雜質 peak，設定分析流洗條件如下：
流洗液：
‧E1: 200 mM NaOH；E2: 18 mM NaOH Gradient Conditions
TIME(min) ％E1 ％E2 Comments 0.00 100 0 Regenerate 20.00 100 0
20.10 0 100 Re-equilibrate 50.00 0 100
50.10 0 100 Inject 75.00 0 100
8. 依上述步驟 7 相同方式，先後分析中性單醣的標準品與萃取樣 品的中性單醣。
9. 分析完畢後，使用 200 mM NaOH 清洗管柱約 1 小時，再以 Storage Solution 18 mM NaOH 流洗管柱約 10 分鐘。管柱如長
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久不使用時必須使用實心塞塞住，避免管柱乾掉。
10. 定性中性單醣主要依據中性單醣標準 品所出現的滯留時間 (Retention Time) 比對樣品的中性單醣滯留時間。
11. 定量中性單醣的計算公式：
․ 中性單醣標準品係 25 μL 中含有 0.25 μg，chromatography management system (CMS, Chromeleon®, Dionex, USA) 軟體可 積分出 peak 的面積。
․ 樣品依照中性單醣標準品面積推算出樣品內中性單醣的含量 (χ μg)。
2.2.3.4.2 醣醛酸組成
樣品前處理：
將 1 mg 樣品溶於 250 μL 12 M H2SO4 (J. T. Baker, 9681-03)，以 37℃處理一小時；再加入二次水稀釋至 1M H2SO4 水溶液，置於 100℃水浴三小時，並且每隔 20 分鐘劇烈混合一次。靜置回溫，加 入相近當量的 Ba(OH)2 (Alfa Aesar, 14341)中和，劇烈混合 30 分鐘，
11000 g 離心 5 分 鐘， 取出 上清液 且加入 適量 BaCO3 (Wako, 024-00245)，劇烈混合 30 分鐘，最後離心 10 分鐘。利用廣用試紙 測試上清液是否已達中性，偏酸則重複中和步驟。水解後的樣品利 用氮氣吹乾 TFA，吹乾後的樣品以 700 μL 二次水回溶，混合均勻 後以 0.2 μm 針筒尼龍過濾膜 (Millex-GN®,SLGNR04NL, Millipore) 過濾。
原理：
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參考廠商技術手冊資料 (Dionex IonPac® AS11 Manual 5.7 Gradient Separation of krebs Cycle Acids)，以超純水萃取的濾液通過離子液 相層析系統 (ion liquid chromatography, IonPac® AS11 2×250 mm column, Dionex, USA)，使用 5–100 mM NaOH 梯度流洗液分離醣醛 酸，最後用導電度 (Conductivity) 分析樣品內不同醣醛酸的含量。
方法：
1. 將導電度為 18 MΩ 的超純水以抽氣過濾器 (GAST) 經 0.2 μm 過濾膜 (Supor®-200, GelmanSciences) 過濾後，裝入塑膠瓶中，
再予超音波震盪 (Ultrasonic cleaner, Delta®) 以去除氣泡。
2. 使 用 除 氣 的 超 純 水 ， 以 50 ％ (w/w) NaOH 溶 液 (Fisher ChemAlert®) 新鮮配製 5 mM NaOH 與 100 mM NaOH 的流洗 液。此外需準備 100﹪Methanol (J. T. Baker) 有機溶劑流洗液。
3. 裝置 IonPac® ATC-3 9×24 mm column，可吸附陰離子而降低背 景值。
4. 使用離 子液相 層析 系統 (ion liquid chromatography, Dionex, USA)，打開除氣閥，將流洗液的氣體流量表調至 5 psi，利用 100 psi 氦氣藉由 GS50 Gradient pump (DIONEX, USA) 將流洗 液管路排氣 (PRIME) 約 5 分鐘至無氣泡為止。待排氣完將除 氣閥鎖緊。
5. 將 調 量 表 調 至 10 psi ， 提 供 氦 氣 使 超 純 水 經 過 anion self-regenerating suppressor 2-mm (ASRS, Dionex, USA) 再生通 道，可以降低 Detector noise，故在此是使用 SRS Suppressor: Auto Suppression External Water Mode。
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6. 開啟 Autosampling 系統 (SPECTRA SYSTEM AS3500, Thermo, Finnigan) 與 Detector 系 統 (ED50 electrochemical Detector, Dionex, USA)。
7. 啟動 chromatography management system (CMS, Chromeleon®, Dionex, USA) 軟 體 ， 設 定 流 洗 液 的 流 速 為 0.5 mL/min ， temperature-compensation 1.7％/℃，開啟 GS50 Gradient pump (DIONEX, USA)，待壓力至 2300 psi 左右設定流洗平衡電流 ECD suppressor current 4 mA，流洗 Analytical column IonPac® AS11 2×250 mm column 至 base line 呈水平的平衡狀態。流洗液 的平衡條件如下：
8. 利用 Autosampling 系統(SPECTRA SYSTEM AS3500, Thermo, Finnigan)，注射針頭自動抽取超純水樣品 10 μl，使用 5–100 mM
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Time(min) %E1 %E2 %E3 %E4 Comments Equilibration 0 32 50 0 18 2.5 mM
NaOH/18%CH3OH for 7 min 7 32 50 0 18
Analysis 0 32 5 0 18 2.5 mM NaOH/18
﹪CH3OH, inject 0.1 32 50 0 18 Inject Valve to
Load Position 1.1 32 50 0 18 2.5 mM NaOH/18
﹪CH3OH 14 37 0 45 18 to 45 mM NaOH/18﹪
CH3OH in 13 min ECD suppressor current：100 mA
Background Conductivity：
1.5 mM NaOH ≦ 1μS 45 mM NaOH/18﹪CH3OH ≦ 3 Μs 9. 依上述相同方式，先以醣醛酸的標準品定出相對位置後，在分
析萃取樣品中的醣醛酸。
10. 分析完畢後，以 Storage Solution 12 mM NaOH 流洗管柱約 10 分鐘。管柱若長久不使用時必須使用實心塞塞住，避免管柱乾 掉。
11. 定 性 醣 醛 酸 主 要 依 據 醣 醛 酸 標 準 品 所 出 現 的 滯 留 時 間
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(Retention Time) 比對樣品的醣醛酸滯留時間。
12. 定量醣醛酸的計算公式：
․ 有 機 酸 標 準 品 係 10 μL 中 含 有 0.1 μg ， chromatography management system (CMS, Chromeleon®, Dionex, USA) 軟體可 積分出 peak 的面積。
․ 醣醛酸萃取樣品依照醣醛酸標準品面積推算出樣品內醣醛酸 的含量 (χ μg)。
2.2.3.5 甲基化程度(
degree of methylation)
原理：
利用 NaOH 對多醣體上的甲基進行移除反應 (elimination)生成甲 醇 (methanol)，再以過錳酸鉀將甲醇轉變為甲醛 (formaldehyde)。多 餘的過錳酸鉀則以亞砷酸鈉還原，甲醛經過 acetylacetone 與 ammonia 的作用生成黃色產物 3,5-diacetyl-1,4-dihydro-2,6-methylpyridine，此產 物於 412 nm 有最大吸光值，並以 methanol 標準品製作標準曲線比對 之。
試劑：
1. 1.5 N NaOH (MERCK, 106498) 2. 5.5 N H2SO4 (J. T. Baker, 9681-03)
3. 2% 過錳酸鉀 (potassium permanganate, MERCK, Art. 5082) 4. 0.5 M 亞砷酸鈉 (sodium arsenite, J. T. Baker, Art. 6287)
5. 0.02 M acetylacetone 【含 2.0 M ammonium acetate (MERCK, 1116)、0.05 M acetic acid (J. T. Baker, 9508-03)】(Fluka, 00900)
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6. Methanol (J. T. Baker, 3041-68) 方法：
1. 參考 Wood 等人 (1971)的方法，取 0.5 mL 樣品加入 0.25 mL NaOH，空白組則以 0.25 mL 二次水取代 NaOH，皆於室溫下反應 30 分鐘。
2. 加入 0.25 mL H2SO4，置於冰浴中冷卻。
3. 緩慢加入 0.2 mL potassium permanganate，輕晃後冰浴 15 分鐘。
4. 加入 0.2 mL sodium arsenite 及 0.6 mL 二次水，混合均勻後置於室 溫下 1 小時。
5. 加入 2 mL acetylacetone，混合均勻後置於 60℃溫水浴中 15 分鐘。
6. 冷卻後取 0.25 mL 讀取 412 nm 吸光値。
7. 以 methanol 製作對數標準曲線，將樣品吸光值代入標準曲線可計 算得出樣品的甲基含量。
8. 以樣品的甲基含量對醣醛酸含量的百分比可得知樣品的甲基化 程度。
2.2.4 分子量分析
原理：
利用分子篩層析法 (gel filtration chromotagraphy)檢測樣品的分子 量。介質單體表面含有很多的孔洞，分子量愈小愈容易進入這些孔洞 中，延遲樣品流動的速度，就愈慢流出；相對地，大分子量的分子則 不容易進入孔洞中，則可較快流出管柱。計算標準品的溶離程度 (kav)，並與分子量對數製作檢量線；再將樣品的 kav 內插至檢量線，
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可得知樣品的分子量。
方法：
1. 層 析 管 柱 ： Chromatography column #XK 16/100, Amersham Biosciences, Sweden (Max capacity：190 mL)
2. 分離介質：Sephacryl® S-400 膠體 (Amersham Biosciences)
3. 幫浦：Pulse-Free Flow Peristaltic Pump #MINIPULS® 3, Gilson, France
4. 自動收集器：Fraction Collector #FC 203, Gilson, USA 5. 緩衝溶液：0.2 M NaCl (MERCK, 1.06404)
6. 膠體保存液：20%酒精溶液 7. 流速：1.8 mL/min
8. 收集單位：2.7 mL/tube
9. 標 準 品 ： Blue dextran T2000 (17-0360-01) 、 Dextran T500 (17-0320-01) 、 Dextran T70 (17-0280-1) 及 Dextran T40 (17-0270-01)，分子量分別為 2000、500、70 及 40 kDa，皆購自 Amersham Biosciences。
10. 樣品：1 mL (2 mg/mL) 部份純化的柚籽多醣
11. 步驟：取 170 mL 膠體放入燒杯，先以二次水洗去保存液，再以
11. 步驟：取 170 mL 膠體放入燒杯，先以二次水洗去保存液，再以