第二章 材料與方法
2.2 實驗方法
2.2.5 特性分析
2.2.5.1 水合能力 (Water hydration capacity)測定
原理：
參考 Quinn 與 Paton (1979) 的方法，將飽和吸水後的樣品重除以樣 品乾重，可得到每克樣品乾重可水合的水毫升數，是為樣品的水合能 力。
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方法：
以標準品小麥蛋白 (gluten from wheat, SIGMA, G5004 )做為對照 組。取 2 mL eppendorf 秤重得 W0，放入樣品後秤重得 W1。逐次加入 少量去離子水於 eppendorf，以 2000 g 離心 5 分鐘，重複以上步驟至 樣品無法吸附更多水份時為飽和吸水狀態，並秤重得 W2。
計算公式：
水合能力= (W2－W1 )/( W1－W0 )
2.2.5.2 黏度(viscosity)測定
原理：
本 實 驗 使 用 指 針 式 黏 度 計 (Dial Reading viscometer #LVT, Brookfield, USA) ， 是 為 同 心 圓 柱 黏 度 計 (concentric cylinder viscometer)，原理為紡錘 (spindle)與槽室 (chamber)各為兩個同心圓 柱，將樣品溶液注入兩個同心圓柱之間，測定使紡錘轉動所需的力可 得一力矩 (torque)，又將紡錘編號與轉速對應廠商技術手冊所附的關 係表可得一常數，將此常數乘以力矩是為樣品黏度，黏度單位為 centipoise (cP)。
方法：
以阿拉伯膠 (Acaica gum, Alfa Aesar, 36499)做為對照組。將樣品以 27℃的二次水回溶為 0.1、0.3、0.6、0.8、1 % (w/v)，注入槽室並以 黏度計測定，可得力矩的讀值。依據廠商技術手冊 (Brookfield)，對 照紡錘與轉速相對之常數，並乘以力矩讀值後為樣品水溶液的 cP 值。
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2.2.5.3 抗氧化性質分析
2.2.5.3.1 清除 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH)自由 基能力測定
原理：
DPPH 自由基是一相對安定的自由基，其乙醇溶液於 517 nm 為最 大吸光值。當 DPPH 自由基被抗氧化劑還原時，吸光值會降低，故可 利用此一特性來測試樣品提供氫質子以清除自由基之能力。因此當吸 光值愈低，則表示樣品對 DPPH 自由基之清除能力愈強，即具有良好 的提供氫質子能力。
反應式：
DPPH‧ (violet) + AH → DPPH-H + A‧
試劑：
1. 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4)
2. 0.25 mM DPPH (SIGMA, D9132)溶於乙醇，需新鮮配置 3. Ascorbic acid (SIGMA, A-0278)溶於二次水
方法：
以標準品抗壞血酸 (ascorbic acid)做為對照組。參考 Yamaguchi 等 人 (1998)之方法，先將樣品以二次水配置不同濃度，取 20 μL 不同濃 度的樣品，加入 80 μL Tris-HCl buffer，再加入現配的 100 μL DPPH 溶液；空白組以 100 μL 乙醇取代 DPPH 溶液；而控制組則以 20 μL 二次水取代樣品。以上皆於暗反應 20 分鐘後，以 ELISA reader 測定 517 nm 吸光值。
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計算公式：
清除率 (scavenging %) =〔1－(樣品於517 nm之吸光值－空白組於517 nm之吸光值) /控制組於517 nm之吸光值－空白組於517 nm之吸光 值〕× 100%
2.2.5.3.2 Superoxide dismutase (SOD)活性測定
原理：
利用 β-mercaptoethanol 與 MnCl2將 O2反應產生 superoxide ( O2- )，
SOD 可將 O2
-轉化成 H2O2，並抑制 O2-將 NADH 氧化成 NAD+，而減 緩 NADH 於 340 nm 吸光值的下降速率 (Paoletti and Mocali, 1990)。
試劑：
1. 50 mM potassium phosphate buffer 【 pH 7.4 ， 含 0.1 mM (ethylendinitrilo) tetraacetic acid disodium salt (EDTA)】
2. 7.5 mM NADH (SIGMA, N8129)
3. 100 mM EDTA【含 50 mM MnCl2 (MERCK, 1.05927)】
4. 10 mM β- mercaptoethanol (MERCK, 8.05740) 5. 40 ng/L SOD (SIGMA, S7571)溶於二次水
6. 2 mg/mL Epigallocatechin gallate (EGCG, SIGMA, E4268)溶於二次 水
方法：
1. 取 25 μL 樣品 (2 mg/mL)加入 200 μL 緩衝液、15 μL 7.5 mM NADH 、 13 μL 100 mM EDTA 及 25 μL 10 mM β- mercaptoethanol，空白組以 25 μL 緩衝液代替。
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2. β-mercaptoethanol 加入後即開始反應，以 ELISA reader 每隔 30 秒測 340 nm 吸光值，至 20 分鐘。
3. 標準曲線:將 SOD 稀釋成 40 ng/μL、20 ng/μL、10 ng/μL、5 ng/μL、
2.5 ng/μL，並依上述步驟反應。
4. 以標準品 EGCG 作為對照組。
計算：
1. 計算從第 8 分鐘到 20 分鐘每分鐘 340 nm 吸光值的變化量。
2. 計算抑制 NADH 吸光值下降百分比 (公式一)，並做成抑制 NADH 吸光值百分比對 SOD (ng)的標準曲線。
3. 以標準曲線計算出相對下降率 50% 及樣品 SOD 的濃度並計算樣 品的 units (公式二)。
4. 1 unit 定義為抑制 50% NADH 吸光值的 SOD (ng)。
公式：
(一) 抑制 NADH 吸光值下降百分比 (%) = (樣品吸光值下降率/空白組 吸光值下降率) × 100%
(二) Units = 樣品 SOD 濃度(ng)/抑制下降百分比 50%的 SOD 濃度(ng)
2.2.5.3.3 螯合亞鐵離子能力測定
原理：
利 用 硫 酸 亞 鐵 胺 (ammonium ferrous sulphate) 溶 於 醋 酸 銨 (ammonium acetate)中解離出Fe2+，並與Ferrozine形成一複合物，此複 合物於562 nm為最大吸光值。藉由此一特性可測定樣品對Fe2+的螯合 能力。因此當樣品於562 nm的吸光值愈低，則表示樣品螯合Fe2+能力
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愈強。
反應式：
Fe2+ + Ferrozine → Ferrozine–Fe2+ complex (violet) 試劑：
1. 2 mM Ammonium iron (II) sulfate hexahydrate (ACROS, 201370250) 溶於5% (w/v) ammonium acetate (MERCK, 1116)，需新鮮配製 2. 5 mM Ferrozine (Alfa Aesar, L10607)溶於二次水，需新鮮配製 3. EDTA (Boehringer Mannheim, 808270)
方法：
以標準品EDTA做為對照組。參考Dinis (1994)等人之方法，先將樣 品以二次水配製不同濃度，取樣品100 μL，加入10 μL ammonium ferrous sulphate，再加入20 μL Ferrozine。控制組加入100 μL二次水及 兩種試劑，空白組則為100 μL樣品加10 μL ammonium acetate及20 μL 二次水。以上皆於暗反應10分鐘後以ELISA reader測定562 nm吸光值。
計算公式：
螯合亞鐵離子的能力百分比 (chelating effects %) =〔1－(樣品於562 nm之吸光值－空白組於562 nm之吸光值/控制組於562 nm之吸光值－
空白組於562 nm之吸光值)〕× 100%