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第四章 材料與方法

第二節 石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞之二維電泳

首先將培養在10 公分細胞培養盤的金目鱸肌肉細胞刮下,收集至 15ml 離心管當 中,細胞於室溫以180 x g 離心 5 分鐘,再以 PBS(Dulbecc’s Phosphate-Buffered Saline)

沖洗細胞一次,於室溫180 x g 離心 5 分鐘。去除上清液後加入 500 μl 的 lysis buffer (7 M

urea、2 M thiourea、4%CHAPS、1% DTT、0.2% Biolyte 3-10、10 mM Spermin),震盪 2 分鐘(震盪器 Pantech 5100 Spire Mixer)。於室溫下以18000 x g 高速微量離心機(Kubota corporatuon 3300)離心 10 分鐘,以除去核酸及細胞碎片,取上清液並且加入 1 ml 的 95

%酒精進行蛋白質沉澱12-16 個小時,再以 18000 x g 於 4℃離心去除上清液,再加入 100 μl 的 lysis buffer 進行樣品的回溶。

二、金目鱸肌肉細胞細胞的蛋白質定量

使用Bio-Rad Protein Assay(Bradford, M. 1976),將不同量 BSA(Sigma) 溶於 159μl 去離子水溶液中,配成已知濃度 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 μg / μl 之標準溶液。另取待測 萃取之細胞蛋白質溶液1 μl 溶於 159 μl 去離子水溶液當中,同時加入 40 μl 蛋白質染劑 (Protein binding dye)(Bio-Rad)混合均勻,室溫等待 2 分鐘後,以 OD595 nm 可見光波 長測其吸光值,再以內插法推算病毒蛋白質濃度。

三、一維蛋白質等電點聚焦 (Isoelectric focusing, IEF):

本實驗第一維的IEF 電泳系統採用 protean IEF cell System (Bio-Rad)。首先將所需蛋 白質溶入125 μl 的復水緩衝液中(Rhydration buffer, containing 7 M Urea, 2 M Thiourea, 4

% CHAPS, 1 % DTT, 0.2 % Biolyte 3-10, 0.005 %BPB),於室溫下放置一小時使蛋白 質全部溶解。一維IEF 電泳使用具 pH 梯度的 7 公分 IPG 電泳膠條(Immobilized pH gradient strip),本實驗以 pH 3-10 看總體蛋白質表現,再利用 pH 4-7 的 IPG strip 進一 步分離酸性區的蛋白質。

將樣品放入製載體(Holder)中,置入 IPG 電泳膠條,使原本乾燥的電泳膠條復水

(Rehydration)並將蛋白質吸入膠條的孔洞中,在 Holder 上加一層覆蓋油(Mineral oil)

以減少反應過程中水的蒸發及尿素結晶。最後將Holder 放置在室溫下進行水合反應 12-16 小時。將復水完成後的 IPG strip 放入 Strip holder 上進行第一維 IEF 電泳。聚焦過 程以定溫(20℃)、低電流(50 μA)的狀態進行;所設定的系統步驟為: 300 Vhr(500 V × 2 hr),1000 Vhr(1000 V × 1 hr),4,000 Vhr(4000 V × 2 hr),500 Vhr(500 V × 2.5 hr)

四、二維膠體電泳 (2-dimentional gel electrophoresis)

(一)、蛋白質電泳製作

首先將玻璃片與間隔條組裝於鑄膠器上,置於水平台上。配製12% 的分離膠體

(Separating gel),注意避免產生氣泡,將膠體溶液緩緩注入玻璃片之間,並在玻璃片之 間插入齒模,同樣避免氣泡產生,待膠體凝固之後緩緩拔出齒模,並用去離子水將齒模 之間的殘膠沖淨。將完成的膠體裝置於電極板,並置於電泳槽中,加入1X SDS 電泳緩 衝液(25 mM Tris-HCl pH8.3, 250 mM Glycine, 0.1% SDS)。

(二)、IPG strip 平衡

將第一維的IPG 電泳膠條取出,以平衡緩衝液(Equilibration buffer, 1.5 M Tris-Cl/pH 8.8, 6 M Urea, 30% Glycerol, 2% SDS)調整膠條的環境至 SDS-PAGE 電泳可分析狀態。

過程如下:配製2 ml 平衡緩衝液,平衡緩衝液內含 0.02 g DTT 粉末,將配置好的 混和液加入玻璃管當中,再放入第一維的IPG 電泳膠條,橫放玻璃管,使電泳膠條可 以充分浸在平衡緩衝液中,利用數位迴轉式震盪器(Yih Der TS-500D)震盪 20 分鐘,

20 分鐘後移入另一個玻璃管,玻璃管內含 2 ml 平衡緩衝液以及 0.04 g 的 IAA,利用數 位迴轉式震盪器(Yih Der TS-500D)震盪 20 分鐘,取出 IPG 電泳膠條橫放入先前已鑄

好蛋白質電泳膠內,注意下緣的界面不可以有氣泡,最後以agarose 溶液(0.5%

agarose/SDS electrophoresis buffer)將 IPG 電泳膠條位置上方的空隙封住。第二維的蛋白 質電泳使用Bio-Rad 的電泳系統,電流值設定 50 mA,30 分鐘後調整為 135 mA,電泳 時間1.5 小時。電泳結束後小心將蛋白質電泳膠片取出,加入 Coomassie Brilliant Blue staining solution(0.025%(w/v)Coomassie brilliant blue R-250, 40%(v/v)Methanol, 7%

(v/v)glacial acetic acid)染劑搖晃染色 60 分鐘,接下來將染色劑倒出,加入退染液(50

%(v/v)Methanol, 10%(v/v)Glacial acetic acid)搖晃進行退染,直到各蛋白質帶均能 清楚顯示,即可倒去退染液並加入清水使其回復原本大小。

五、胰蛋白酵素降解反應(Trypsin digestion)

(一)、切取膠點

將欲分析的蛋白質點切成小片段,並且放入 1.5 ml微量離心管(Microcentrifuge tube)中。微量離心管須先用去離子水以及甲醇清洗。接下來加入含有 50% CAN(acetone nitritie)的 200 μl 25 mM NH4HCO3 並且震盪 10 分鐘,去除上清液。重複以上步驟一到 兩次。樣品放入Speed Vac當中抽氣 30 分鐘,即可將樣品風乾。

(二)、還原與鹼化

樣品加入40 μl的含有 10 mM DTT的 25 mM NH4HCO3中,放入56℃的培養箱中 1 小時,進行還原。接下來將上清液去除,在室溫下將樣品放冷。加入同樣體積含有55 mM Iodoacetamide的 25 mM NH4HCO3,同樣放入56℃的培養箱中 1 小時,進行鹼化,去除 上清液,並在室溫下將樣品放冷。接下來加入100 μl的 25 mM NH4HCO3 震盪10 分鐘,

移除上清液。最後加入100 μl的 25 mM 含 50% ACN的NH4HCO3,震盪5 分鐘,移除上

清液。完成後將樣品放入Speed Vac中抽氣乾燥。

(三)、胰蛋白酵素降解反應(trypsin digestion)

將25 μl的胰蛋白酵素,(酵素的濃度是 12.5 ng / μl溶在 25 mM NH4HCO3 當中)進 入乾燥的膠點中,等待15 分鐘,直到膠體完全吸入酵素溶夜,移除剩餘液體並將其丟 棄。加入少量體積的25 mM NH4HCO3令整個膠體浸入Trypsin當中,並且將樣品放入 37℃

培養箱中反應12 到 16 個小時。反應結束後,加入 30 ul的 5% Formic acid in 50 % ACN 在室溫下靜置60 分鐘。將上清液取出並且放入 1.5 ml乾淨的微量離心管當中。剩下的 膠體再加入15 μl 5% Formic acid靜置在室溫下 10 分鐘,隨後加入 15 μl的 100% ACN靜 置60 分鐘。將兩個上清液取出混合在一起,並且利用Speed Vac抽氣乾燥。最後將乾燥 的膠體加入10-20 μl 0.1% Formic acid。樣品即可以LC-MS/MS進行蛋白質身分鑑定。

六、液相層析串接式質譜儀鑑定蛋白質

使用質譜儀為液相層析串接式質譜儀(LC-MS/MS, Finnigan LTQ DUO,

ThermoQuest),軟體為Mascot。液相層析儀管柱尺寸為內部粒子 5 μm,孔洞大小 300 Å,

長度15 cm,流速設定為 0.1 ml / min,使用沖湜液 A 液為 0.1% Formic acid,B 液為 100

% Acetonitrile,梯度設定為 A 液先流洗 10 分鐘再由 99%到 20%,B 液由第 10 分鐘開 始,由1%到 80%,全程共 200 分鐘,Sample loop 設定為 20 μl。質譜儀參數設定掃描範 圍為200-2000 m/z,離子源 250℃,噴口電壓 4,500 伏特。進行比對的資料庫選用的是 Zebrafish 資料庫。

第三節 石斑魚虹彩病毒誘發金目鱸肌肉細胞內蛋白質增減之分析

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