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第五章、 結果

第四節、 選殖ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)基因

將上述部分定序的ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)序列為模板,再一次的設計含 有切位的引子,重新進行PCR 的增幅,結果如圖十三,可以得到一條 cDNA 約 710 個 的鹼基對的核苷酸。將這個全長並且只有一個讀碼框(ORF)的核苷酸序列選殖進入 pCMV-tag4 的載體(如圖十四)當中表現,利用抗生素進行篩選,並將成功表現 Arf-1 的 質體進行序列分析(委託明欣生物科技公司進行)結果如圖十五。

接下來將定序的結果利用 NCBI blast 進行序列比對,結果如圖十六,發現其全長 以及淡水魚類(Hyatt, 2000),感染地區則遍佈全世界。

在2008 年發表的文獻中提到,當石斑魚虹彩病毒(GIV)感染金目鱸肌肉細胞

在2003 年一篇蛙虹彩病毒(Ranavirus)的研究文獻當中提到,利用 frog virus 3

(FV3)感染 Baby hamster kidney (BHK)細胞株以及 Fathead minnow (FHM)細胞 株, FHM 細胞株進行感染後的 7-8 小時會開始有 DNA 片段化的現象,而感染 8.5 個小 時後會產生染色質固縮現象(Chromatin condensation),藉由病毒在感染細胞前的紫外 光照射,可以解釋這些現象的產生原因為Frog virus 3 (FV3)在感染 FHM 細胞株時,

其外鞘蛋白質接觸宿主細胞表面即會引起宿主細胞凋亡,並不需要病毒的基因表現。

FV3 在細胞株上的感染通常會伴隨著抑制大分子合成的現象產生,並且會有顯著的 細胞病理現象(Cytopathic effect)。病毒會快速的抑制宿主細胞的DNA、RNA 與蛋白質

的合成,並且引發宿主某些轉譯後修飾,如磷酸化。例如:真核生物的起始轉譯因子 Eukaryotic initiation factor 2 (eIF-2α),當其磷酸化出現問題,會影響信息RNA(mRNA)

的轉譯(Chinchar, 1989; Chinchar ,1992)。這些事件都是病毒在感染宿主細胞時會令細 胞死亡的原因,但目前仍不清楚當病毒感染細胞時造成宿主細胞凋亡的主要機制究竟是 如何?

FV3 與石斑魚虹彩病毒同為 Iridoviridae 科的 Ranavirus 屬,這兩個病毒皆為高度溶 解性的病毒(Highly cytolytic virus)(Willis, 1985;Williams, 1996; Chinchar, 2002),亦在 感染宿主細胞株當中,同時發現有短時間造成宿主細胞凋亡的同樣情況出現,其病毒感 染而引發的細胞機制,也可能為同一情況。

另外,並非僅有 Frog virus 3(FV3)與石斑魚虹彩病毒出現病毒感染宿主細胞後出 現細胞凋亡的情況,在先前的研究文獻當中有指出,在體外實驗中,Ranaviruses 的感染 會引發細胞凋亡的情況(Zhang, 2001; Essbauer, 2002)。

從近年來硬骨魚的研究當中也可以發現,引發細胞凋亡的關鍵基因包括了Fas、

FasL、TNF、TNFR、FADD、以及 Caspases 6 與 Caspases8 (Secombes, 2001; Laing , 2001;

Long, 2002)。而有效的找出病毒或是細胞內誘發細胞凋亡的主要蛋白質,以及詳細了解 病毒誘發細胞凋亡的胞內機制,將有助於我們防治石斑魚虹彩病毒日益擴大的疫情。

第二節、研究方法與問題

本篇論文當中,利用蛋白質體學的方式去探討,當金目鱸肌肉細胞被石斑魚虹彩病 毒(GIV)感染時引發的防禦機制-細胞凋亡,首先我利用 pH 3-10 的 IPG strip 與 12%

的SDS page,來觀察感染 GIV 的金目鱸肌肉細胞蛋白質總表現量。結果發現,金目鱸

肌肉細胞蛋白質,大部分集中在pH 4-7 與高分子量的位置,而蛋白質點在二維電泳的 進行比對,比對出蛋白質點的身分為Initiation factor 4a-1b(eIF4A1B)、Proteasome 20S、

ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)、Ribose 5 phosphate isomerase A(RPIA)、

Phosphoglycerate mutase 1(PGAM-1)、Tyrosine Hydroxylase(TH)、RAN binding protein 1。

一、Initiation factor 4a-1b(eIF4A1B)

2004 年的乳癌研究論文中指出,造成細胞程式性凋亡的基因 4(Programmed cell death 4-Pdcd4)與許多癌症都有相關,藉由西方墨點法的分析以及歸納發現,約有 60 種的癌症都與細胞程式性凋亡的基因4(Programmed cell death 4-Pdcd4)有相關性,此 基因的表現量會有降低情況。研究也發現Pdcd4 藉由抑制 eIF4A 的活性,進 一步的壓 後,eIF4A 有量逐漸上升情況,推測其可能原因是病毒在與宿主細胞結合後誘發 eIF4A 上升,以祈細胞因子可進行病毒包裝需要的蛋白質轉譯,但由於病毒感染此種細胞株無 法在其中複製以及增殖,是推測基因表現只有在感染後上升並未隨著時間點增加的原 因。

二、ADP ribosylation factor 1(Arf-1)

在ADP ribosylation factor 1 與細胞凋亡的相關研究文獻中指出,Arf 蛋白質與 TNFα 家族中的TRAIL-R1/DR4 具有相關性,Arf 蛋白質可能透過與 TRAIL-R1/DR4 的蛋白質 交互作用,進一步的引發細胞凋亡(Simova S, 2008)。

ADP ribosylation factor 1 與病毒的研究亦發現,腸病毒科中的小核糖核酸病毒

(Picornavirus),其 3A 蛋白質會藉由與 guanine nucleotide exchange factor(GEF)的結 合來抑制Arf1 的活性,進一步的抑制細胞中內質網到高基氏體的運輸 (Wessels, 2006),以上文獻並未提及到病毒、細胞凋亡與 ADP ribosylation factor 1 的相關機制,

而在本篇論文,石斑魚虹彩病毒感染金目鱸肌肉細胞所引起的細胞凋亡,確實在蛋白質 層次與基因層次上觀察到蛋白質ADP ribosylation factor 1 的量驟增,推測其可能原因是 病毒所引發的細胞凋亡機制,觸動胞內運輸蛋白質ADP ribosylation factor 1 變化。

三、Ribose 5 phosphate isomerase A(RPIA)

Ribose 5 phosphate isomerase A 在細胞內的功能為五碳糖磷酸代謝路徑(Pentose phosphate pathway)的一員,負責的功能是將 Ribulose 5 phosphate 轉換成 Ribose 5 phosphate。五碳糖代謝路徑與細胞內的 NADPH 含量有關,研究顯示 NADPH 含量會影 響細胞內Glutathione 含量,且 NADPH 含量與 Glutathione 含量都與細胞凋亡有關(Katalin B ,1996),研究也同時顯示,當過度表現五碳糖磷酸代謝路徑的酵素之一 Transaldolase

(Tal),會出現細胞凋亡情況,當抑制 Transaldolase(Tal)的表現量時,亦會有細胞凋 亡受抑制的情況發生(Katalin B ,1996)。

目前仍無與Ribose 5 phosphate isomerase A 相關的文獻報告,說明 Ribose 5 phosphate isomerase A 與細胞凋亡以及病毒感染的關係,但自上述的文獻推測,由於 Transaldolase

(Tal)與 Ribose 5 phosphate isomerase A 同為五碳糖代謝路徑酵素,因此推測 Ribose 5 phosphate isomerase A 在蛋白質與基因上的高量表現而造成細胞凋亡的胞內機制,可能 與Transaldolase(Tal)的代謝路徑雷同。

四、Tyrosine Hydroxylase(TH)

2007 年的研究文獻中指出,Tyrosine Hydroxylase 的過度表現,使初生小鼠神經系 統的多巴胺(Dopamine)表現量上升,因而引發細胞凋亡(Arnaud J ,2007)。目前仍無 Tyrosine Hydroxylase 與病毒相關的文獻,說明 Tyrosine Hydroxylase 可能在病毒引發細

胞凋亡的機制中,扮演何種角色。

Tyrosine Hydroxylase 可能的機制為:被病毒外鞘蛋白質所誘發,因而活化下游與凋 亡相關酵素,引發細胞凋亡現象。

五、Phosphoglycerate mutase 1(PGAM-1)

2004 年研究前列腺癌的文獻中指出,藉由調控 Phosphoglycerate mutase 1,可抑制 細胞生長與細胞凋亡,此篇研究中說明,對前列腺癌細胞株進行加藥後,細胞存活率有 很明顯下降,將處理過的細胞進行二維電泳分析,結果發現Phosphoglycerate mutase 1 的蛋白質表現量有明顯上升現象,而作者使用Realtime-PCR 監控 Phosphoglycerate mutase 1 的基因表現量,也發現確實有升高現象,證實 Phosphoglycerate mutase 1 的過度 表現的確會造成細胞凋亡。

在本篇論文中,同樣利用二維電泳與Real-time PCR 的方式監控基因與蛋白質表現 量,相較於控制組細胞,在感染後表現量有下降情況出現,至於病毒如何誘發

Phosphoglycerate mutase 1 的過度表現,胞內機制目前仍然不清楚。

第四節 未來展望

上述在基因與蛋白質層次表現量都有顯著上升的蛋白質,其引發的胞內機制還不 甚清楚,有些在前人的文獻中略有提及,但大部分仍未被發現,尤其在魚類的病毒感染 實驗當中,上述的五個蛋白質(Initiation factor 4a-1b(eIF4A1B)、ADP-ribosylation factor 1(Arf-1)、Ribose 5 phosphate isomerase A(RPIA)、Phosphoglycerate mutase 1(PGAM-1)、 Tyrosine Hydroxylase(TH))都未被發表與研究,從結果上觀察,目前只清楚當金目鱸

肌肉細胞被病毒誘發,而產生細胞凋亡時,這五個蛋白質的表現量都會有上升現象,但 究竟胞內機制為何?則須更進一歩的進行功能性分析。

可將這些過量表現的基因,放入一個可感染真核細胞的表現載體上,利用含有過量 表現基因的載體對金目鱸肌肉細胞進行轉染,並且觀察當金目鱸肌肉細胞大量表現這些 蛋白質時,細胞會不會有凋亡情況產生。

而確認死亡的細胞究竟是否為凋亡的細胞呢?就必須透過細胞凋亡的相關試驗,例 如:TUNEL、ANNEXIN V、DNA 片段化分析與 Hoechst 33258 來進行更進一步的測試,

甚至更可以利用siRNA 對這些過量表現的基因進行 Silence,觀察一旦這些基因被 Silence 後,細胞的存活情況。

藉由以上更進一步的研究,將有助於我們了解這些蛋白質的表現究竟在細胞中扮演 一個怎樣的角色,甚至是當病毒感染細胞時這些蛋白質是如何被誘發,並且如何參與在 細胞凋亡的這一連串Cascade 上。

這個透過蛋白質體學方式而找到的蛋白質,會在病毒感染細胞產生的細胞凋亡被誘 發,顯示其可能參與細胞凋亡誘發的相關路徑,因此更進一歩的研究這個蛋白質的作 用,將有助於使病毒誘發細胞凋亡的胞內機制被更清楚了解。

0hr 1h

SD S p age IEF

2hr 2.5h 0hr 1h

SD S p age IEF

2hr 2.5h

第七章 圖表

圖一;以pH 3-10 的 IPG strip 與 12%的 SDS page 的二維電泳,分離感染石 斑魚虹彩病毒後的金目鱸肌肉細胞蛋白質之銀染色圖。

1

表一;利用mascot 軟體進行蛋白質身分比對的結果

(A) (B)

圖三;(A)以 1.0%洋菜膠體電泳分析 Initiation factor 4A 1B (eIF4A1B)

PCR 增幅結果;圖三(B)為金目鱸 eIF4A1B 核苷酸定序與斑馬魚 eIF4A1B 核苷酸序列的比對結果。

(C)

三;(C)為 eIF4A1B 金目鱸胺基酸序列與斑馬魚胺基酸序列的比對結果。

(A) (B)

(C)

圖四;(A)以 1.0%洋菜膠體電泳分析 ADP-ribosylation factor 1(Arf-1) PCR 增幅結果;(B)金目鱸 Arf-1 核苷酸定序與斑馬魚核苷酸序列的比對 結果;(C)Arf-1 金目鱸胺基酸序列與斑馬魚胺基酸序列的比對結果。

(A) (B)

圖五;(A)以1.0%洋菜膠體電泳分析Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA)

PCR增幅結果;(B)為RPIA核苷酸定序與斑馬魚核苷 酸序列的比 對結果。

(A) (B)

圖五;(C)為 Ribose 5 phosphate isomerase(RPIA)金目鱸胺基酸序列與斑 馬魚胺基酸序列的比對結果。

(A) (B)

與斑馬魚核苷酸序列的比對結果。

圖六;(A)以 1.0%洋菜膠體電泳分析 Tyrosine Hydroxylase(TH) PCR 增 幅結果,(B)為 TH 核苷酸定序

(C)

圖六;(C)為 TH 金目鱸胺基酸序列與斑馬魚胺基酸序列的比對結果。

(A) (B)

(C)

七;(A)以 1.0%洋菜膠體電泳分析 Phosphoglycerate mutase 1(PGAM1)

的 比對結果;(C)為 PGAM1 金目鱸胺基酸序列與斑馬魚胺基酸序列 的比對結果。

增幅結果;圖七(B)為 PGAM1 核苷酸定序與斑馬魚核苷酸序列

增幅結果;圖七(B)為 PGAM1 核苷酸定序與斑馬魚核苷酸序列

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