第一節 子宮內膜癌中 Cadherin 的種類 Part A. 材 料 (Materials)
實驗的檢體取自於在本院(中國醫藥學院附設醫院)接受子宮內 膜癌分期手術的病人以及子宮肌瘤接受全子宮切除手術病人的正 常子宮內膜,正常子宮內膜病人三個月內未接受賀爾蒙藥物治療, 且月經週期在早期分泌期(16-23th day)。本實驗只收集的檢體是 adenocarcinoma type with grade-III differentiation 的檢 體，所以從 2002 至 2003 年我們總共收集了五位病人的子宮內膜 癌症的組織檢體。在子宮一取下之後,立刻以刀片取下癌症的組織 或正常子宮內膜以液態氮急速冷凍保存。
Part B. 方 法 (Methods)
(1).RNA 的萃取(RNA extraction) A. 儀器(Machine)
1.Source capture system (Germfree Laboraties) 2.Centrifuge 5810R (Germany)
3.Microcentrifuge(Uover Laboratories,USA) 4.Sectrafuge 16M(National LAbnet,USA) 5.TM firestek B206(Firstek Scientific)
6.Minigel Migration Trough Mupid-2(Cosmo Bio Co LTD,USA)
7.Rocker platform (Bellco Biotechnology,USA) 8.UV box TFX20M (Vukber Lourmat,France)
9.DS34 Polaroid Electrophrosis hood (UK)
B.試劑(Reagents)
1.Trizol Reagent (Life Technologies,Inc.,Gainthersburg,MD) 2.1X TBE Buffer
3.2% Agarose
鐘之後,留下沉澱物。
5.加 1 ml 之 100% alcohol 於沉澱物中,均勻混合。
6.接著以 4。C 離心 13000rpm 5 分鐘,去除上清液,室溫靜置 5 分鐘,避免沉澱物過度乾燥。
7.加入 40μl 58。C 之 sterile ddwater,接著於 58。C 加熱 5 分鐘使沉澱物溶解,將所得的 RNA product run diagnostic gel,確認我們的 RNA。
(2)反轉錄(Reverse transcription) A.儀器(Machine)
1.TM firestek HB-100 (Fiestek Scientific) 2.TM firestek B206 (Firestk scientific)
B.試劑(Reagent)
1.Random primer (Promega,Madison, WI,USA)) 2.Oligo-dT primer(Promegma)
3.M-MLVRTase (Moloney murine leukemia virus) (Promegma) 4.0.1M DDT(Dithiotheatol)
5.dNTP(Protech)
6.RNAsin(Invitrogen) 7.MMLV RT buffer
C.步驟(Procedure)
1.將約 5μl 之 total RNA 加 dd water 至 23μl。
2.接著加入 濃度 0.5μg/μl 之 2μl random primer and 0.5μl oligo-dT primer 至總量 22.5μl,加熱 70。C, 5 分鐘後,置於冰上 2 分鐘,接著短暫離心。
3.加入 8μl MMLV RT buffer, 2μl MMLV RTase,2μl 0.1M DDT,2μl dNTP,0.5μl RNAsin,至總量 40μl 之後, 於 37。C 放 2 小時後,於 94。C, 加熱 5 分鐘後,置於-70。C 冰箱中保存。
(3).degenerate-PCR (Polymerase chain reaction using degenerate primers )
A.儀器 (Machine)
1.PCR system 2400 (Perkin Elmer,USA)
2.Minigel Migration Trough Mupid-2(Cosmo Bio Co LTD,USA)
3.Rocker platform (BEllco Biotechnology,USA) 4.UV box TFX 20M (Vukber Lourmat,France) 5.DS34 Polaroid Electrophoresis hood (UK)
B.試劑(Reagent) 1.10X PCR buffer 2.2.5mMdNTP
3.MgCl2
4.20μM cadherin degenerate forward primer 5.20μM cadherin degenerate reverse primer 6.Taq polymerase
Degenerate primers of classical cadherin are:
Forward: GAATTCACNGCNCCNCCNTAYAYGA Reverse: GAATTCTCNGCNARYTTYTTRAAR
R=either A or G, Y=either C or T, N=either A,C,G or T
C.步驟(Procedure)
1.2-4μl cDNA 加入 dd water 至總量 35μl。
2.接著加入 5μl 的 10X PCR buffer,5μl 的 2.5mM dNTP,2μl 的 MgCl2, 1μl 的 20μM forward primer,1μl 的 20μM reverse primer,1μl 的 Taq polymerase 至總量 50μl。
3.接著進行 PCR,而 PCR 溫度的條件是 95。C hold 5 min, 接 著 95。C 1.5 min、45。C 2 min、72。C 3 min, run 35 cycles 接著是 72。 C 8 min。
4.將 PCR product 植入 PCR-II vector。
(4). Cloning
A.儀器(Machine)
1.Microcentrifuge tube 2.Thermocycler
3.Water bath
4.Orbital Shaking incubator OSI502 B.試劑(Reagent)
1.Luri-Bertani (LB) medium and agar 2.DMF (Dimethylformamide)
3.X-Gal in DMF (40mg/ml 5-bromo-4-chloro-3 indolyd-β-galactoside)
4.Ampicillin stock (50mg/ml)
5.IPTG (100mM isopropyl-β-D-thiogalactoside)
6.Ligation buffer
7.One shot competent cell Kit (TOP 10F’ cells)
8.TA cloning Kit (Invitrogen, San Diego,CA,如 Fig 4)
C.步驟(Procedure).
1.Ligation (clone into PCR IIvector) ↓將 PCR II vector ( 1 vial) 簡短離心
↓將先前 RT-PCR 之 PCR product 加上 1μl 之 10X ligation buffer 和 2μl 的 PCR II vector
↓接著加入 sterile water 和 T4 DNA ligase 1μl 至總量 10μl
↓放置 14。C water bath, overnight
Fig. 5. PCR-II Vector.
2. Transformation
↓將先前已被 PCR product clone 的 PCR II vector 簡短離 心之後,置於冰上
↓加入 2μl TOPO cloning reaction 至 competent cells, 將它們輕輕的混合之後,置於冰上 30 分鐘
↓接著放置於 42。C 水槽 30 秒,之後置於冰上
↓於室溫下加入 250μl SOC medium,在 37。C shaking incubator 以 225 rpm 平行搖晃 1 小時
↓取 50μl 及 200μl 之 solution 分別塗於含有 X-Gal 及 50μg/ml ampicillin 之 LB agar plates 上
↓等乾之後,將 plate 巔倒置於 37。C 的 incubator 18 小時, 之後置於 4。C 冰箱
3. Bacterial growth
↓挑出至少 30 個白色菌落(Figure 6),分別將他們放到 30 管 2c.c.LB medium(內含 50μg/ml ampicillin), 在 400 rpm 搖,overnight 之後做 plasmid DNA 分析
(5).Plasmid DNA extraction and DNA sequence
A.儀器(Machine) Microcentrifuge
B.試劑(Reagent)
1.Gene-spin Miniprep Purification Kit(Beckman CEQ2000.AB1377,LICORIR2, Pharmacia A.L.F.)(Solution I,Solution II,Solution III,Wash Solution)
2.Restriction enzyme 10X buffer H (900mM Tris-HCL,500mM NaCl,100mM MgCl2)
3.EcoRI Enzymes storage buffer (10mM Tris-HCL,400mMNaCl, 0.1mM EDTA,1mM DTT,0.15% Triton X-100,0.5 mg/ml BSA,50%
glycerol)
C.步驟(Procedure)
Plasmid DNA extraction
↓取 1ml 的 bacterial media,以 13000rpm 離心 30-60 秒之後, 取 pellet
↓接著加入 200μl Solution I,Vortex 5 -6 次使細胞溶解
↓之後加入 200μl Solution II,Vortex 5-6 次 ↓加入 200μl Solution III,vortex 5-6 次
↓13000 rpm 離心 5 分鐘
↓將 spin column 放入 collection tube,接著將上清液小心 放入 spin column
↓離心 30 秒之後,將 spin column 移出 collection tube
↓將過濾液丟棄,加入 500μl 的 washing solution
↓離心 60 秒之後, 丟棄過濾液,再度離心 3 分鐘,去除殘餘的 ethanol
↓將 spin column 放入新的 1.5ml eppendorff 中,加入 65。C 的 50μl H2O
↓離心 1 分鐘,以分離出 DNA
(如果重覆最後兩個步驟就可多得 10-15%的 DNA)
DNA 定序 (sequencing)
↓取 5μl 的 plasmid DNA,加 0.5μl 的 EcoRI restriction enzyme 和 1μl 的 buffer
solution,10μl H2O,60μl 100%的 isopropanol,之後 vertex briefly
↓室溫下靜置 25 分鐘,
↓用最大速度離心 30 分鐘之後,去除上清液
↓以 75% isopropanol 250μl rinse, vertex briefly ↓離心 5 分鐘,接著同樣去除上清液
↓air dry,stock at -20C。,接著將 samples loading 到 gel
↓接著以 automated DNA sequencer 來分析 DNA sequence ↓再利用 BLAST computer program 與 Genebank/EMBL 的資料 庫與我們得到的 DNA sequence 做比對,以確認我們得到的典
型 cadherin 有那一些種類
第二節 比較六種典型 cadherin 及 α-,β-,γ-catenin 在子宮內膜癌與正常子宮內膜織中 mRNA 濃度的表 現差異
Part A 材料
在第一部分的實驗中，我們已知在子宮內膜腺癌組織中有 哪一些典型 cadherin 存在。以相同的檢體，接著我們要比較 這些典型 cadherin 在正常子宮內膜及子宮內膜腺癌的 mRNA level 的表現差異。
Part B 方法
(1)RNA 的萃取與定量
儀器和試劑與第一節 partB 相同 。 步驟(Procedure)
↓取 2μl RNA,加入 3μldd water 及 5μl RNA denature buffer 之後
↓在 58。C 下加熱 15 分鐘
↓接著放置在冰上 2 分鐘
↓短暫離心之後,加入 2μl 的 RNA loading buffer
↓跑膠
↓將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘
↓接著取出膠,在 UV box 照相,評估 RNA 的相對含量。
(2) RT
儀器、試劑和步驟與第一節 partB 相同。
(3) PCR
儀器、試劑和步驟與第一節 partB 相同,其中要特別注意的是, 因為我們要比較 mRNA 的量, 所以要求出每一個典型鈣黏蛋白 及 catenin 適當的 cycle 數。
步驟(Procedure)
↓首先以 PCR 的方式得到的 GAPDH(house keeping gene), run 不同的 cycle 數,會得到一線性直線,取其中間值為
我們要的 cycle 數, GAPDH 是 22(Fig.14.)
↓用同樣的方法算出各種典型 cadherin 適當的 cycle(Fig.
15.- Fig. 20.)
↓ 接 著 以 六 種 典 型 鈣 黏 蛋 白 的 primer(Table3) 製 造 cadherin product
↓將所得的 cadherin product 以電泳分析及評估 DNA 的量
↓加入 2μl DNA loading buffer
↓跑膠
↓將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘
↓接著取出膠,在 UV box 照相,評估 DNA 的相對含量
↓定量是藉由 Hewlett Packer Digital scanner 將 cadherin product 相 片 掃 描 至 電 腦 之 後 , 以 UN-SCAN-IT Gel Version 5.1 system (Silk Scientific,Orm, Utah)來 分析,求得 Cadherin/GAPDH mRNA 的比值。