第一節 典型鈣黏蛋白的種類
我們將含有 cadherin product 的 PCR-II vector clone 到 E. coli 中,如果有轉植成功的話會形成白色的菌 落(Fig. 6.)。接著我? 挑出了 30 個 colonies,而各種
classical cadherin colonies 的數目如 Table 3,以萃取 D N A , 在 我 們 萃 取 出 p l a s m i d D N A 後 , 接 著 以 Eco RI restriction enzyme 將 plasmid 切斷, 之後將 所得產物跑電泳,結果我們在 gel 上發現二種 band ,一段的
base pair 約 3.9 Kb,這段是 plasmid 的 DNA,另一段約 180 base pairs ,這段是 cadherin 的 DNA (Fig. 7.),接著再定 序,結果發現在子宮內膜癌中有六種典型 cadherin,分別 是:E-cad、 N-cad、 P-cad、 Cad-6、Cad-9 以及 Cad-11
（如 Fig.8.- Fig. 13. ）。
Fig. 6. Agar plate for transformed bacterial selection.如 果有被含 cadherin product 所 clone 的 PCR-II vector 轉植成功的細胞是白色的菌落,反之則無形成菌落,但是 若是被不含有 cadherin product 所 colone 的 PCR-II vector 所轉植成功的話,則會形成藍色的菌落。
Table2. Analysis of cadherin cDNA clones generated from Grade-3 endometrial adenocarcinoma lesion
Cadherin subtype No of clone Clones analyzed/patient(%) Patient 1
E-cad 2 7 P-cad 7 23 N-cad 3 10 Cad-6 5 17 Cad-9 1 3 Cad-11 12 40 Patient 2
E-cad 3 10 P-cad 8 27 N-cad 3 10 Cad-6 6 20 Cad-9 1 3 Cad-11 9 30
Fig. 7. Plasmid DNA 約 3.9 Kb,而我們的 degenerate PCR product 約 180 bp 經過定序分析後, 發現有六種典型
cadherin。
ß plasmid DNA 3.9 Kb
ß 180-bp Degenerate PCR products for sequencing
Fig. 8. An example of E-cadherin sequence
Fig. 9. An example of N-cadherin sequence
Fig. 10. An example of P-cadherin sequence
Fig. 11. An example of cadherin-6 sequence
Fig. 12. An example of cadherin-9 sequence
Fig. 13. An example of cadherin-11 sequence
第二節 不同典型鈣黏蛋白在子宮內膜癌與正常子宮內膜中 的不同表現
我們知道六種同時存在於正常子宮內膜與子宮內膜腺
癌組織中的 calssical cadherin 的種類之後, 因為我們要 比較 mRNA的量, 所以要求出每一個典型鈣黏蛋白及catenin 適當的 cycle 數,結果如 Fig. 14. - Fig. 23。 而我們所用 的 primers 如 Table 3。六種典型 cadherin 經過電腦的比較 之後,可發現 P-cad 在子宮內膜癌組織中的表現比正常子宮 內膜組織強,而 E-cad 在子宮內膜癌組織中的表現比正常子 宮內膜組織弱 ,但是 cad-6、 cad-9、cad-11 則無不同。
α-,β-,γ-catenin 在子宮內膜癌組織中的表現和正常子 宮內膜組織中相同(如 Fig. 24.-Fig. 26.)。
Fig. 14. GAPDH 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。圖
Fig. 15. E-cad 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。圖
Fig. 16. N-cad 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。圖
Fig. 17. P-cad 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。圖
Fig. 18. Cad-6 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。圖
Fig. 19. Cad-9 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。圖
Fig. 20. Cad-11 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。
Fig. 21. Alpha-catenin 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。圖(A)是 Alpha-catenin 在正常子宮內膜的 RT-cycle 數,圖 (B)是在子宮內膜癌組織的 RT-cycle 數。由圖中的線性增加發現,
Fig. 22. Beta-catenin 的半定量 (semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數 。 圖 (A) 是 Beta-catenin 在 正 常 子 宮 內 膜 的 RT-cycle 數,圖(B)是在子宮內膜癌組織的 RT-cycle 數。由 圖中的線性增加發現,當 cycle 數為 26 時,為理想的定量
Fig. 23. Gamma-catenin 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數 。 圖 (A) 是 Gamma-catenin 在 正 常 子 宮 內 膜 的 RT-cycle 數,圖(B)是在子宮內膜癌組織的 RT-cycle 數。由 圖中的線性增加發現,當 cycle 數為 26 時,為理想的定量
Table 3. Primers used for PCR in these studies
Gene Primer Sequence Size
Cadherin-degenerate 5’ 5’-GAATTCACNGCNCCNCCNTAYGA-3’* ∼180 bp 3’ 5’-GAATTCTCNGCNARYTTYTTRAA-3’*
E-Cadherin 5’ 5’-TCCATTTCTTGGTCTACGCC-3’ 361 bp 3’ 5’-CACCTTCAGCCAACCTGTTT-3’
P-cadherin 5’ 5’-GACCAACGAGGCCCCTTTTGTGCTG-3’ 357 bp 3’ 5’-GTGGTGGGAGGGCTTCCATTGTCCA-3’
N-cadherin 5’ 5’-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3’ 373 bp 3’ 5’-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3’
Cadherin-6 5’ 5’-TTCTTGCTGCTCTTTTGGGT-3’ 275 bp 3’ 5’-CCTGCTCCATCTCCTGAAAG-3’
Cadherin-9 5’ 5’-CAAAACCTGGGCAGTTGATT-3’ 416 bp 3’ 5’-CCTCTTCAATGCAGCAAACA-3’
Cadherin-11 5’ 5’-ACCAGATGTCTGTGTCAGA -3’ 742 bp 3’ 5’-GTCATCCTTGTCATCTGCA-3’
α-catenin 5’ 5’-CAGAGGGAGCATGACTTCGG-3’ 290 bp 3’ 5’-CTACAGCAGCCACCAACTCT-3’
β-catenin 5’ 5’-AAGGTCTgGAGGAGCAGCTTC-3’ 668 bp 3’ 5’-TGGACCATAACTGCAGCCTT-3’
γ-catenin 5’ 5’-ATGGAGGTGATGAACCTGATGG-3’ 284 bp 3’ 5’-CCTGACACACCAGGGCACAT-3’
Fig. 24. E-,P-and N-cadherin 在子宮內膜癌與正常子宮內膜中 的比較。圖中 a 表示 negative control, b 為正常子宮 內膜,而 c 是子宮內膜癌組織。DNA marker 在 gel 的最 左邊。ethidium bromide-stained 的 gel 上都有顯示 我們用 specific 的 primers(E-cad, P-cad , N-cad) 所 amplified 的 PCR 產物。而 E-cad,P-cad 和 N-cad 分 別位在 361, 357,373 base pairs 的位置,而 GAPDH 則 位 於 359 base pairs 的地方。 而每一個 cadherin subtype 的 absorbance value ,都會以相對應的 GAPDH 標準化,算出他們的比值。結果發現 P-cad mRNA levels 在子宮內膜癌組織中表現增強 ,E-cad 則減弱 ,但 是 N-cad 兩種組織中的表現無差別。
Fig. 24. E-,P-, and N-cadherin 在子宮內膜癌與正常子宮內膜
Figure 25. Cadherin-6,-9,and11 在子宮內膜癌與正常子宮內膜中 的比較。圖中 a 表示 negative control, b 為正常子宮 內膜,而 c 是子宮內膜癌組織。DNA marker 在 gel 的最 左邊。ethidium bromide-stained 的 gel 上都有顯示 我們用 specific 的 primers(Cad-6, Cad-9 , Cad-11) 所 amplified 的 PCR 產物。而 Cad-6,Cad-9 和 Cad-11 分 別位在 275, 416,和 742 base pairs 的位置,而 GAPDH 則位於 359 base pairs 的地方。而每一個 cadherin subtype 的 absorbance value , 皆以相對應的 GAPDH 標 準化,算出他們的比值。結果發現 cad-6,cad-9,cad-11 在正常子宮內膜組織中和在子宮內膜癌組織中的表現 無顯著差異。
Fig. 25. Cadherin-6,-9,and 11 在子宮內膜癌與正常子宮內膜 中的比較。
M Cadherin-6 Cadherin-9 Cadherin-11
a b c a b c a b c
a b c a b c a b c
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Cadherin-6 Cadherin-9 Cadherin-11
Ratio of cadherin/GAPDH
Cadherins
GAPDH
Fig. 26. a-catenin,ß-catenin 及 ?-catenin 在子宮內膜癌與正常子宮 內膜的比較。圖中 a 表示 negative control, b 為正常
子宮內膜,而 c 是子宮內膜癌組織。DNA marker 在 gel 的最左邊。ethidium bromide-stained 的 gel 上都有顯 示我們用 specific 的 primers(a-catenin,ß-catenin 及
?-catenin)所 amplified 的 PCR 產物。而 a-catenin,ß-catenin 及 ?-catenin 分別位在 290, 668,和 284 base pairs 的位 置,而 GAPDH 則位於 359 base pairs 的地方。而每一個 catenin 的 absorbance value ,皆以相對應的 GAPDH 標 準化,算出他們的比值。結果發現 a-catenin,ß-catenin 及
?-catenin 在正常子宮內膜組織中和在子宮內膜癌組織中 的表現無顯著差異。
Fig. 26. a-catenin,ß-catenin 及 ?-catenin 在子宮內膜癌與正常子宮 內膜的比較。
M α-catenin β-catenin γ-catenin
a b c a b c a b c
a b c a b c a b c
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Alpha-catenin Beta-catenin Gamma-catenin
Relative ratio of cadherin/GAPDH
Catenins
GAPDH