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粉防己之液相層析串聯式質譜分析指紋圖譜建立

四、結果與討論

1. 粉防己之液相層析串聯式質譜分析指紋圖譜建立

1-1. 粉防己藥材經切片染色後顯微鏡下觀察(Fig.4 )，與文獻資料

(2~5)

比 對，以及與粉防己之指標成分 tetrandrine 作 TLC 比對結果(Fig.11)相 符，確立其基原為 Stephania tetrandra，以此作為標準藥材(Fig.3 )，

進行液相層析串聯式指紋質譜圖之建檔，以及模擬處方配製。

1-2. 進行液相層析串聯式指紋質譜圖之建檔過程中之 HPLC 分析條件：

分離管柱為 Cosmosil 5C

18

-AR, 4.6 x 150 mm。移動相溶媒系為 methanol：acetonitrile：各含 0.1﹪w/v 之 formic acid 及 ammonium acetate 混合水溶液(17:17:66)，流速：0.5 mL/min（1：1 分流），該分 析條件乃參考文獻

(24)

中「對利用高效液相層析質譜儀檢測粉防己之三 各主要活性成分(tetrandrine, fangchinoline, cyclanoline) 」一文中所評 估之移動相溶媒系以 acetonitrile 及 0.1﹪w/v 之 formic acid 為最佳組 合，以及參考文獻中對aristolochic acid 定性定量

(26~28)

時應用之移動相 溶媒系，以及常用於分析中藥或食品摻加 sildenafil 西藥成分之移動 相溶媒系

(29)

，並予以部份修改，以適合四種防己於 20 分鐘以內溜出 鑑別性之成分之移動相溶媒系，作為後續各藥材之分析，祈使比對過 程之一致性。又因中草藥成分複雜，不明成分尚佔多數，無法一一調 整適合各成分之毛細管電壓(capillary voltage )及錐口電壓(cone

voltage)等質譜儀器參數作分析，權以常設(儀器 default 值)之毛細管 電壓為 3 kV 及線性錐口電壓變化(cone voltage ramp)作為質譜分析條 件。

1-3. 標準藥材離子裂片之選擇(Principle of fragment selection)：以粉防己 為例，標準藥材萃取溶液經正離子電灑法第一段全掃描質譜分析 (ESI+MS1)結果，經扣除基線之干擾裂片，其中正離子全掃描質譜圖

所獲得之TIC 圖有數支明顯之離子峰(Fig.15)，每支離子峰之全質譜

1 .0 0 2 .0 0 3 .0 0 4 .0 0 5 .0 0 6 .0 0 7 .0 0 8 .0 0 9 .0 0 1 0 .0 0 1 1 .0 0 1 2 .0 0 1 3 .0 0 1 4 .0 0 1 5 .0 0 1 6 .0 0 1 7 .0 0 1 8 .0 0T im e

Stephania tetrandra-9502

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z

0 100

%

AA-pFG-MS1-950223-Conc 858 (7.242) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (844:1030-607:809) 1: Scan ES+

9.45e7 623.7

381.7

312.7 333.3 349.6

580.7

Stephania tetrandra-9502

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z

0 100

%

AA-pFG-MS1-950223-Conc 700 (5.910) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (671:773-178:292) 1: Scan ES+

7.61e7

342.6 368.6 546.6 566.7

520.6

578.7 593.7

610.7

611.7

Stephania tetrandra-9502

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

m/z 0

100

%

AA-pFG-MS1-950223-Conc 326 (2.757) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (322:663-75:263) 1: Scan ES+

1.27e7 342.7

314.6

298.6 328.6 343.6

607.7 476.7

367.6 381.7 432.6 462.7 520.6 562.7

625.7

Stephania tetrandra-9502

200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700

m/z 0

100

%

AA-pFG-MS1-950223-Conc 682 (5.758) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (616:682-(693:781+518:599)) 6.86e7 342.7

314.6 343.6 344.6

Stephania tetrandra-9502

250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 m/z 0

100

%

AA-pFG-MS1-950223-Conc 858 (7.242) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (681:905-(510:653+971:1090)) 3.27e7

253.5 333.3351.6

381.7

578.7 566.7 546.6 382.6

400.7 503.7 518.7

623.7

624.7

625.7

626.7

33

圖中選取 m/z 305.4, 312.8, 314.4, 333.1, 342.4, 609.4, 623.5 等離子強 度(abundance)較大者作為親代離子(parent ion)，予以進行正離子電灑 法子代離子質譜分析(ESI+ Daughter ion scan)。

1-4. 粉防己之負離子電灑法第一段全掃描質譜分析(ES

－

/MS1) 所獲得 TIC 圖之離子強度，較 ESI

＋

/MS1 所獲得 TIC 圖離子強度為低，且未 見 tetrandrine 指標成分之負離子電灑法分析中理論上應能看到之 m/z 621(M-H)

­

，因此於用於製作指紋圖譜，則較缺鑑別性。因此建立粉 防己之指紋圖譜，乃以正離子質譜圖為主。但於ES

­

/MS1 之質譜圖 中有明顯之 m/z 191 負離子裂片，以 m/z 191 為源頭離子進行負離子 子代離子質譜分析(ESI­D191)，經與 NLFD3 LC/MS/MS library database 比對結果為檸檬酸(citric acid) (Fig.16)，經查文獻

(2,4)

證實粉防 己含有豐富之檸檬酸，由此觀之，間接證實液相層析串聯式質譜指紋 圖譜分析法之可行性。

1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00Time

0 100

%

Fangchi-MSMS-Citric-A Sm (SG, 3x27) 1: Daughters of 191ES-

TIC 2.87e9 3.33

2.59 3.79

Fig- 16: The ESI

－

m/z 191 daughter ion scan and the library search result

1 .0 0 2 .0 0 3 .0 0 4 .0 0 5 .0 0 6 .0 0 7 .0 0 8 .0 0 9 .0 0 1 0 .0 0 1 1 .0 0 1 2 .0 0 1 3 .0 0 1 4 .0 0 1 5 .0 0T im e

Stephania tetrandra-9502

100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 m/z 0

100

%

AA-pFG-MS2-950217 82 (8.795) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (80:93-61:73) 4: Daughters of 624ES+

8.30e5

218.8 267.3 310.1 350.2 363.2

623.3 580.2

560.3 545.9 398.2 425.6 441.9 530.4

592.3 593.2

Stephania tetrandra-9502

100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 m/z 0

100

%

AA-pFG-MS2-950217 62 (6.657) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (58:73-36:49) 5: Daughters of 609ES+

4.74e5

213.0 237.1 279.1 309.1 350.9356.3

609.4

35

Stephania tetrandra-9502

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 m/z 0

100

%

AA-pFG-MS2-950217 53 (5.705) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (51:59-29:44) 6: Daughters of 342ES+

1.45e7 192.0

177.0190.0 342.2

Stephania tetrandra-9502

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 m/z

0 100

%

AA-pFG-MS2-950217 52 (5.516) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (48:55-34:41) 1: Daughters of 314ES+

5.16e5

192.0 194.9

251.1 237.2

211.0 253.7

271.1

Stephania tetrandra-9502

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 m/z 0

100

%

AA-pFG-MS2-950217 83 (8.867) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (80:93-67:77) 2: Daughters of 333ES+

3.38e6 312.7

Stephania tetrandra-9502

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 m/z 0

100

%

AA-pFG-MS2-950217 62 (6.621) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (58:71-41:53) 3: Daughters of 305ES+

9.71e5

123.0 158.1

147.0 161.0

177.9

213.0 237.2 250.0 265.0274.3 290.4

314.0

Fig.17 :The daughter ion spectrums of selected fragments in Stephania

tetrandra herb

Stephania tetrandra-9502

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 m/z 0

100

%

AA-pFG-MS2-950217 82 (8.850) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (79:97-56:72) 7: Daughters of 313ES+

2.60e5

133.0 158.9

149.1 173.0

176.1

189.0 312.6

297.1

266.1 311.4

318.0 336.2341.2

1-5. 子代離子質譜圖製作: 製作過程，援用 ES

＋

/MS1 所設定之毛細管電 壓為 3 kV，錐口電壓設定為固定 60V，進行分析各別選定源頭離子 之子代離子質譜掃瞄，適時調整 collision energy，使獲得典型之子代 離子質譜圖(Fig.17 )，並將子代離子質譜圖連同儀器分析之參數建入 質譜圖庫中。

1-6.檢視其獲得之子代離子質譜圖，源頭離子與獲得之最大離子裂片斷 (based peak)之比值一般均能介於 1~ 1/10 之間，唯獨所選定之 m/z 333 則甚易裂解成 m/z 312.7(圖譜記載為 m/z 313)之單一裂片，且其離子 峰滯留時間(RT)與 m/z 312.7 之子代離子質譜離子峰相同，約 8.9 分 鐘(Fig.18)，因此兩者應屬類緣成分，m/z 333 為 m/z 313 之不安定之 前趨物。另就 ES+D623.5, ES+D312.8, ES+D333.1 三者之 RT 相同，

應同源於 m/z 623.5 離子裂片，且 ES+D312.8 應為帶兩個電核(z＝2) 之離子裂片，此推論正與文獻

(24)

所言為[M+2H]

+2

裂片之結論不謀而 合，ES+D 333.1 則為 m/z 623.5 之降解離子裂片﹔同理 ES+D609.4 與 ES+D305.4 為同源離子裂片，後者應為 fangchi- noline 之[M+2H]

+2

之 裂片(z＝2)。

另就m/z 314 與 m/z 342 而言，兩者離子峰滯留時間(RT)相同，

約 5.6 分鐘，但兩者裂解之代離子質譜圖並無相關性，因此難推定兩 者具有類緣關係。由文獻記載粉防己

(4,13,)

含 cyclanoline (C

20

H

24

NO

4

, M.W. 342)，因屬於四級銨，本身即帶一個電核，因此 m/z 342 即可 能是 cyclanoline [M]

+

之分子離子裂片。

粉防己之指標成分為tetrandrine(C

38

H

42

N

2

O

6

, MW. 622) 及 fang- chinoline (C

37

H

40

N

2

O

6

, MW. 608) ，在 ESI+/MS 1 中有明顯之 m/z 623 及m/z 609 [M+H]

+

離子裂片，經與tetrandrine 對照標準品(Fig.19)比對

37

phenolic-OH group 經 methylation 而得 tetrandrine 之證據。經查本分 析過程所獲得fangchinoline 之子代離子質譜圖，與文獻

(24)

用 fang- chinoline 標準品所建立之子代離子質譜圖則相似。因此雖未取得 fangchinoline 對照標準品仍可確認 m/z 609 即為 fangchinoline，更間 接證實取得藥材之正確性，以及用 LC/MS/MS 分析法鑑定粉防己藥 材獲得初步之可行性。

1-7.編輯粉防己鑑定試驗巨集指令(Herb identity macro-method)：綜合上述 分析結果，每個選定源頭離子之子代離子質譜掃瞄稱之為一個管道 (channel)，簡記為 ES+Dxxx，粉防己設定 7 個管道，將此 7 個管道之 儀器分析參數集合製作成儀器分析指令，存入電腦中以執行分析 (Tab.3)，一次同時掃瞄 7 個管道，檢液中若存在有選定之 m/z 源頭離 子，且適合儀器分析參數者，將有離子峰出現，經扣除基線處理，將 獲得該選定源頭離子之子代離子質譜圖(daughter ion spectrum)，並與 標準質譜圖庫作比對，並顯示比對相似度（matching quality），以仟 分比表示(‰)(Fig.17)。

1-8.編輯粉防己 MRM 掃瞄巨集指令:因中藥成分複雜，為摒除其他成分 之干擾，提高分析之感度，另編輯粉防己藥材之親代離子裂片與子代 離子裂片之配對分析之巨集指令，以進行多重離子裂解監控分析

（MRM, Multiple Reaction Monitoring），稱之為 MRM 掃瞄巨集指令 (MRM screen macro-method)。以 tetrandrine 之 ES+D623.5 為例，分析 該管道時，儀器僅允許m/z 為 623.5 之源頭離子進入，經碰撞裂解獲 得 m/z 381.4 之子代離子裂片者才予以記錄，簡記為 m/z 623.5>381.4 (Fig.18)，是為 MRM/TIC 圖，因此粉防己之 MRM screen macro-method 也有 7 個管道，由 Fig.18 顯示幾乎是單一波峰，確實有效排除其他 干擾物質，頗具專一性。唯該圖無法與標準質譜圖庫作比對，主要檢 視各管道波峰滯留時間與標準藥材是否相符，以及相符管道數之百分

比，做為 MRM 比對相似性(MRM Matching quality) 評估量化之表示 法

。

本分析法亦可比對紫外線吸收光圖譜，tetrandrine 與 fangchino- line 於 240 及 280nm 均有最大吸收(Fig.20)。

Tab.3 The Stephania identity macro-method and MRM screen macro-method

CH Precursor

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