Stephania tetrandra-9502
Function 1: Mass analysis
Instrument: QUATTROULTIMA LC/MS/MS Ionization mode: ESI+ MS1 Scan
Capillary Voltage: 3.0 kV Cone Voltage (V): Ramp Collision Energy: 5 eV Cone temperature: 120 ℃ Desolvation temperature: 350 ℃ Function 2: HPLC analysis
Waters Alliance 2695 HPLC Pump
Column: Cosmosil 5-C18, 4.6 x150mm, 5um
Mobil phase: MeOH:AcCN:Buffer solution=(17:17:66)
* Buffer solution= 0.1%NH4AC+ 0.1%HCOOH aqueous solution Flow rate： 0.5 ml/min
Injection volume: 10 uL Acquire Time 0 ~20(mins) Function type: Diode Array Wave length range ( nm ) : 200 to 350
3-3. 子代離子掃描（ESI+Daughter ion scan）
(22)
:取上述3-2 第一段全質譜 掃描，獲得各較大波峰之質譜圖中之主要裂片，或疑似藥材指標成分 之有意義之裂片[M+1]+
予以進行子代離子掃描。開始先以一般子代離 子質譜分析條件分析，即以毛細管電壓：碰撞能量:進樣圓錐口電壓 (cone voltage/ collision energy/capillary voltage)為 60/20/3 進行分析，檢視其獲得之子代離子質譜圖(daughter ion spectrum) （Fig.13B），
親代離子(parent ion 或稱源頭離子 precursor ion)與最大離子裂片斷 (basal peak)之比值須大於 1/10〜1，若未能獲得該比值，則調整碰撞 能量，重行分析，祈使質譜圖獲得穩定明顯之鑑定離子裂片群組，並 予以載入質譜圖庫(LC/MS/MS database)中，俾便於日後之搜尋比對 之用（Fig.17,22,25,29）。
A B
Fig.13: The mechanism of daughter ion scan and obtained daughter ion spectrum
3-4. 編 輯 各 別 藥 材 鑑 定 試 驗 巨 集 指 令 (fangchi herb identity macro-method)：綜合上述分析結果，經過歸納後，每個藥材選定 5~7 個親代離子，每個親代離子之子代離子質譜分析稱之為一個管道 (Channel)
(22)
，將這些多重管道(5~7 channels)之儀器分析參數集合製作Stephania tetrandra-9502
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z 0
100
%
AA-pFG-MS2-950217 82 (8.795) Cn (Top,4, Ht); Sm (Mn, 2x0.75); Sb (1,40.00 ); Cm (80:91-62:75) 9.36e5 381.2
174.1
162.1 137.0
191.1
227.2 267.3310.1 363.2
623.3 580.2
560.3 545.9 398.2 425.6
592.3
593.2
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 Time
0 100
%
AA-pFG-MS2-950217 Sm (SG, 3x1) 4: Daughters of 624ES+
TIC 1.43e8 8.90
25
譜圖(daughter ion spectrum) （Fig.13B），並與標準質譜圖庫作比對。
因中藥成分複雜，為摒除其他成分之干擾，提高分析之感度，另編輯 各藥材選定藥材之親代離子裂片及子代離子裂片所配對成限制性分 析之巨集指令，以進行多重離子裂解監控分析
(22)
（MRM, Multiple Reaction Monitoring），稱之為各別藥材 MRM 鑑定試驗之巨集指令 (MRM screen macro-method) （Fig.14）。例如粉防己中 tetrandrine 以 m/z 623.5 為親代離子裂解獲得 m/z 381.4 之子代離子裂片符合該條件 者才予以記錄，簡記為m/z 623.5>381.4，是為 MRM/TIC 圖。唯該圖 無法與標準質譜圖庫作比對，主要檢視各管道波峰滯留時間與標準藥 材是否相符，以及相符管道數之百分比，做為MRM 比對相似性(MRM Matching quality) 評估量化之表示法。
Fig.14: The mechanism of MRM scan and obtained MRM/TIC chromatography
1 .0 0 2 .0 0 3 .0 0 4 .0 0 5 .0 0 6 .0 0 7 .0 0 8 .0 0 9 .0 0 1 0 .0 0 1 1 .0 0 1 2 .0 0 1 3 .0 0 1 4 .0 0 T im e
0 1 0 0
%
A A -p F G 1 -E S + M R M S m (S G , 3 x 1 0 ) 1 : M R M o f 7 C h a n n e ls E S +
6 2 3 .5 > 3 8 1 .4 1 .9 4 e 6 7 .8 9
6 .8 4
3-5.編輯易混淆防己藥材之 MRM 預篩檢試驗(MRM pre-screen macro- method)：為同時快速掃描易混淆防己各藥材，選定各藥材之指標 成分或1~2 個親代離子作為篩檢之標的，集合成 7 管道進行多重 離子裂解監控，例如粉防己選定tetrandrine 及 fangchinoline (m/z 623.5 及 m/z 609.5)，廣防己選定 m/z 625.3，木防己選定 m/z 652.4 及m/z 577.4，漢防己選定 sinomenine
(
m/z 330.4)及 m/z 522.4 之離 子裂片。彙集上述各管道之儀器分析參數集合製作成MRM 預篩 檢試驗巨集指令(Tab.8 )，存入電腦中，當欲進行中藥製劑中是否 含防己藥材或淆防品時，先以MRM pre-screen macro- method 分 析方式篩檢，檢視MRM 之 TIC 圖，若出現明顯之波峰，疑似檢 出何種防己，再另以上述3-4 之特定藥材之 fangchi herb identity macro-method 及 MRM screen macro-method 重行分析(Tab.3〜6 )，比對子代離子質譜圖或呈現藥材相似性百分比。
4. 指紋質譜圖庫適用性探討
4-1.含防己藥材之模擬處方配製：選自古籍《金匱要略》所載--防己黃 耆湯，其組成比例為防己 1.0 黃耆 1.0 白朮 0.75 甘草 0.5 生 姜 0.5 大棗 0.5 ，主治風濕，關節炎，多汗症，肥胖症，腎炎，
陰囊水腫，下肢浮腫，月經不順等功效，也用於減肥之用途。配製 上述處方時，分別以粉防己(Stephania tetrandra S. Moore) ，漢防己 (Sinomenium acutumn Rehd. et Wi l s .)，木防己(Cocculus trilobus D C .)，廣防己(Aristolochia fangchi Wu)取代方中之防己，加入其餘五 味藥材，研成粉末以備用。
4-2.模擬處方溶液配製：稱取 4.25 g(相當於防己 1 g)之上述粉末，如同 上述3-1 所載方法萃取、過濾定容成 10 mL 供作檢品溶液。
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檢品溶液。用以瞭解其餘五味藥材或儀器系統是否造成干擾。
4-4. 搜集市售防己藥材或含防己之中藥製劑予以分析，統計藥材之誤 用率。
4-4-1.藥材檢品溶液配製：取藥材粉末 1.0 g ，如同 3-1 之配製法以 10 mL 之 70%甲醇萃取，過濾，收集濾液，再以 70%甲醇定容成 10mL，即為檢品溶液。
4-4-2.中藥製劑檢品溶液配製：取相當於防己標示量 1g 之中藥製劑粉 末或剪碎之小片，先以少許之純水濕潤，再如同3-1 之配製法以 兩次10 mL 之 70%甲醇萃取兩次，過濾，收集濾液，減壓濃縮 成約3 mL，再以 5 mL 甲醇溶解，濾除沉澱物，再以 70%甲醇定 容成10mL 即為檢品溶液。
4-4-3. 依上述 3-5 所載篩檢儀器分析巨集指令，先以 MRM 預篩檢試驗 (MRM pre-screen macro-method)分析方式篩檢，檢視 MRM 之 TIC 圖，若出現明顯之波峰，疑似檢出何種防己，再另以上述3-4 之 特定藥材之Fangchi herb identity macro-method 及 MRM screen macro-method 重行分析，比對子代離子質譜圖或呈現藥材相似性 百分比。
Tab. 2 : The compositions of TCM preparation in market and its fangchi species labeled