細胞凋亡

細胞凋亡是生物體內計畫性細胞死亡的主要形式，在正常發育、

組織動態平衡和免疫中，細胞凋亡扮演了關鍵的角色(Strasser, Cory,

& Adams, 2011)。細胞凋亡最早由John Kerr在1972年提出，主要是細 胞本身接受到一連串死亡訊息的刺激，藉由調控基因的表現，進而分 解DNA與細胞質中之蛋白質所致之計畫性、程序性的死亡過程，因此 也被稱為計劃性的細胞死亡(programmed cell death, PCD)(Kerr,

Wyllie, & Currie, 1972)。當細胞凋亡出錯時會造成病理狀態，其中包 括癌症、自體免疫、感染與退化性疾病等(Strasser, et al., 2011)。因此 細胞凋亡可能出現在健康與疾病的狀態中，像是愛滋病（AIDS, acquired immune deficiency syndrome）、退化性神經疾病

（neurodegenerative disorders）、胰島素依賴型糖尿病

（insulin-dependent diabetes）、C型肝炎感染、心肌梗塞（myocardial infarct）和動脈粥狀硬化（atherosclerosis）等，都是細胞凋亡比例增 加所引起，而自體免疫疾病與癌症則為細胞凋亡比例降低的結果 (Ulukaya, Acilan, & Yilmaz, 2011)。當然也有經由刺激誘導所產生的

細胞凋亡，刺激包括抗癌藥物的作用、生長因子的喪失和輻射影響 等。細胞凋亡發生的分子機制（附錄Fig. 7）已經透過廣泛的研究而 逐步被了解(R. Kim, 2005)。

（ㄧ）、細胞凋亡特徵

細胞凋亡在形態上的特徵是核染色質凝集（chromatin

condensation）、細胞核和細胞質皺縮（shrinkage of the nucleus and cytoplasm），接著細胞破裂（fragmentation of the cell），形成凋亡小體

（apoptotic bodies），其會被鄰近的吞噬細胞（phagocytic cells）吸收，

進而被溶酶體（lysosomes）所消化(Kerr, et al., 1972)。另外，粒線體 膜電位的改變、胞漿鈣離子（Ca²⁺）的濃度增加或核酸內切酶的活化 都會導致DNA片段化，DNA裂解成大約為200 bps的片段，在凝膠電 泳可觀察到梯狀現象（ladder pattern）(Taylor, Cullen, & Martin, 2008)。

因此，細胞凋亡和細胞壞死（necrosis）不同之處在於細胞進入凋亡 時，由於細胞膜是完整的，因此細胞所含的有毒物質無法釋放到細胞 外，導致這些凋亡小體很快會被吞噬細胞（phagocytes）吸收，也不 會影響鄰近的細胞產生凋亡，所以也不會產生發炎反應(Taylor, et al., 2008)。因化療作用所造成的細胞凋亡發現與腫瘤體積減少有關，但 化療作用對於細胞凋亡所導致的阻抗亦造成抗藥性(R. Kim et al., 2003; R. Kim et al., 2002; Pommier, Sordet, Antony, Hayward, & Kohn,

2004)。藉由內外在路徑的活化可以明確肯定化療藥物的抗腫瘤效用 (R. Kim, 2005)。

（二）、細胞凋亡路徑器是纖維組織母細胞相關抗原（fibroblast associated antigen，Fas；也被稱為APO-1或CD95）和腫瘤壞死因子受 體（tumour necrosis factor receptor，TNFR），兩者都屬於腫瘤壞死因 子受體家族成員，並都含有一個細胞質內的死亡結構區域（cytosolic death domain，DD），會與同源的與Fas相關死亡結構區域

（Fas-associated death domain，FADD）互相作用並結合，使死亡訊 息接受器結合形成誘導死亡訊息的複合體（death inducing signalling complex，DISC）(Ashkenazi & Dixit, 1998; Kischkel et al., 1995)。此 外，FADD還有另一個同源的死亡作用器結構區域（DED，death effector domain），可接合細胞內的pro-caspase 8。當DISC在細胞質端 形成，引發pro-caspase 8會自我活化，切割成活化態的caspase 8

（initiator caspases，稱為引發死亡訊息的caspase），活化的caspase 8 會水解激活下游的caspase 3及7（effector caspases，也稱為執行死亡訊 息的caspase），進而引起細胞凋亡(Bodmer et al., 2000; Scaffidi et al., 1998)。另外caspase 8也能夠切只含BH3結構的蛋白質Bid，被切斷的 Bid（tBid）會移至粒線體並且誘發細胞色素c（cytochrome c）釋出，

引起caspase 9和caspase 3的活化。死亡訊息的複合體DISC可被含有

DED的蛋白質負回饋調控，如：Flice-inhibitory protein（FLIP）含有 兩個DED，透過FLIP會抑制DISC signalling中caspase 8的活化，使下 游的caspase無法被活化，並抑制細胞凋亡(J. Li & Yuan, 2008)。也有 研究指出，FLIP不僅會抑制死亡訊息複合體，也會促進NF-B和Erk 的活化(Kataoka et al., 2000)。

1. 外在路徑（extrinsic apoptotic pathway）

外在路徑又稱死亡接受器訊息路徑（death receptor signaling pathway）。引發細胞凋亡的外在路徑起因於位在細胞膜上接受器

（receptor）與細胞外的配體（ligand）的結合。典型的死亡訊息接受 藉由內外在路徑的活化可以明確肯定化療藥物的抗腫瘤作用(R. Kim, 2005)。

2. 內在路徑（intrinsic apoptotic pathway）

內在路徑又稱為粒線體途徑（mitochondria pathway）。啟動細胞 凋亡的內在路徑通常是因為細胞內外的壓力所引起，包括氧化壓力、

輻射和導致細胞毒性的藥物治療(Ghavami et al., 2008; Ghavami et al., 2004)。與外在路徑不同的是，內在路徑透過粒線體上的Bcl-2家族蛋 白質調控細胞死亡。Bcl-2家族中，促凋亡的蛋白如Bax/Bak，附著在 粒線體膜上，使cytochrome c從粒線體內膜釋放至細胞質中，進而引 發細胞凋亡(R. Kim, 2005; R. Kim, Inoue, & Toge, 2004; Tsunemitsu et

al., 2004)。抗凋亡的蛋白如Bcl-2、BCL-XL，則防止cytochrome c從粒 線體內膜釋放，並抑制Bax和Bak的活化(Tanabe et al., 2003; Tolcher et al., 2004)。而只有BH3結構的蛋白質，如Bid和Bim，藉由誘發這些蛋 白質的同源分子聚合（homo-oligomerisation），增進Bax或Bak的促凋 亡功能。其中促進細胞凋亡的路徑又細分為兩種，分別為caspase dependent pathway和caspase independent pathway。

（1）Caspase dependent pathway

當凋亡訊號產生，會造成粒線體內膜的膜電位下降並將凋亡因子 釋放到細胞質，其中最重要的是cytochrome c，cytochrome c在dATP 或ATP協助之下，會與細胞凋亡活化因子（apoptotic protease activating factor，Apaf-1）結合並進一步和pro-caspase 9形成多蛋白的複合體，

稱之為凋亡體（apoptosome），其包含數個單位的Apaf-1和其它分子 (Ghobrial, Witzig, & Adjei, 2005; Ly, Grubb, & Lawen, 2003)。接著 apoptosome促進caspase 9活化，並啟動下游的caspase活化，如caspase 3、caspase 6和caspase 7等，進而切割poly-ADP-ribose polymerase

（PARP），導致細胞凋亡(Gupta, 2003)。

（2）Caspase independent mitochondria pathway

當凋亡訊號產生，造成粒線體外膜的通透性改變，使得由粒線體 內膜的ATP合成酶、電子轉運鏈（electron transport chain）、腺嘌呤核

苷酸轉運者（adenine nucleotide translocator，ANT）及位於粒線體外 膜的電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel）所組 成粒線體通透性轉運孔洞（mitochondria permeability transition pore，

MPTP）打開，粒線體會將與凋亡相關蛋白質釋放至細胞質，如 cytochrome c、第二粒線體caspase的活化者（Smac/DIABLO）(Du, Fang, Li, Li, & Wang, 2000)、HtrA2/Omi(W. Li et al., 2002)、endonuclease G、

誘發凋亡因子（apoptosis-inducing factor，AIF）(Lorenzo, Susin, Penninger, & Kroemer, 1999)等。Smac/DIABLO和HtrA2/Omi使得抑制 凋亡蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）(van Loo et al., 2002) 的作用失效，進而間接使caspase活化，而endonuclease G與AIF則是藉 由進入細胞核使DNA產生損傷與凝縮，造成細胞凋亡的發生(Debatin, 2004)。

（三）、與細胞凋亡相關蛋白質 1. Caspases

人體中caspases在分類上因功能、原結構區域大小（size of their pro-domain）或裂解特異性而有所不同。第一群的caspase與發炎反應 有關，包含了細胞激素的成熟，如caspase 1、4和5。這些蛋白酶主要 與對抗病原體的先天免疫系統有關。第二群的caspase才是與細胞凋亡 調控有關，這些caspase又可以分成兩種：起始（initiator）的caspases

（caspase 2、8、9和10）與作用（effector）caspases（caspase 3、6和7）。

作用的caspases在細胞內以二聚體的形式並藉由起始酵素來引發活 性，進而產生蛋白水解過程(Olsson & Zhivotovsky, 2011)。

（1）Caspase 8

Caspase 8對於細胞凋亡外在路徑是相當必須的，而caspase 8由 TNF-家族成員所活化(Ghavami, Eshraghi, et al., 2009)。Pro-caspase 8 能夠經由與Fas相關死亡結構區域的調適蛋白FADD結合。Pro-caspase 8在死亡誘發訊號複合體DISC的複合體中，以二聚或三聚體的分子形 式存在，交互裂解並活化。活化的caspase 8會使下游的caspase 3、7 和Bid裂解而活化，進而引起細胞凋亡(Carrington et al., 2006;

Stennicke et al., 1998; Yan & Shi, 2005)。另外活化的caspase 8也能活化 NF-B和調節淋巴細胞的增生。調控caspase 8活性程度的關鍵蛋白是

c-FLIP_L，它是一個和caspase 8相似但缺乏caspase的活性的分子

(Micheau et al., 2002; Tschopp, Irmler, & Thome, 1998)。當c-FLIPL缺乏 時，二聚或三聚體分子形式的pro-caspase 8會使pro-caspase 8的活性更 大，作用更加完全。在高濃度c-FLIPL存在時，pro-caspase 8的增加被 抑制，因此c-FLIPL的裂解能夠確保caspase 8的基本活性，使得NF-B 被活化(Chang et al., 2002; Irmler et al., 1997)。

（2）Caspase 10

Caspase 10和caspase 8一樣具有兩個DED的結構區域，這個結構 區域能夠吸引相同的死亡誘發訊號複合體DISC並受到死亡訊息接受 器的活化。它同樣能夠使Bid裂解並啟動與粒線體相關的細胞凋亡路 徑，所以有文獻猜測caspase 10與caspase 8有部分功能是重疊的 (Degterev, Boyce, & Yuan, 2003; Kischkel et al., 2001; Milhas et al., 2005)。

（3）Caspase 2

Caepase 2是第二個被發現的caspase蛋白質，它包含了一個 caspase組成的結構區域（caspase recruitment domains，CARD）以及 組成多種蛋白質的複合體PIDDosome2。藉由CARD與具有接受死亡 訊息的結構區域與RIP相關ICH-1/ECD3同源性蛋白質（RIP associated ICH-1/ECD3 homologous protein with a death domain，RAIDD）的結構 區域做結合(Read, Baliga, Ekert, Vaux, & Kumar, 2002)。Caspase 2的獨 特點是除了可以在細胞質內被發現，也能夠在細胞核與高爾基氏體內 被發現(Baliga et al., 2003; Mancini et al., 2000; O'Reilly et al., 2002)。而 caspase 2就是藉由切斷並活化Bid而成為粒線體的上游，這個角色對 於DNA損傷所引發之細胞凋亡是相當重要的(Bonzon, Bouchier-Hayes, Pagliari, Green, & Newmeyer, 2006; Guo, Srinivasula, Druilhe,

Fernandes-Alnemri, & Alnemri, 2002; Robertson et al., 2004)。

（4）Caspase 9

Caspase 9在凋亡小體的形成扮演了起始的角色，在過去12年已被 廣泛研究。一旦當粒線體路徑被活化，細胞色素c會從粒線體中被釋 放，並吸引細胞凋亡活化因子Apaf-1(Rodriguez & Lazebnik, 1999; Zou, Henzel, Liu, Lutschg, & Wang, 1997)。在dATP或ATP的存在下，細胞 色素c和Apaf-1會聚集形成凋亡體（apoptosome）。而pro-caspase 9隨 後就會透過本身的caspase-activation recruitment domain（CARD）結 構區域與Apaf1做結合，藉由這樣的交互作用使另一個pro-caspase 9 也被活化(P. Li et al., 1997; Qin et al., 1999)。然後這個接上斷裂caspase 9且被活化的凋亡體則進一步去活化下游的caspase 3。

（5）Caspase 3與Caspase 7

細胞凋亡的過程是ㄧ連串caspases的活化。內在路徑的上游啟動 者為caspase 9，而外在路徑則為caspase 8。但是無論是內在或是外在 路徑，最後都會引起caspase 3的活化。ㄧ旦caspase 3裂解成活化態時，

會使得蛋白酶激活去氧核糖核酸的抑制子（inhibitor of the

caspase-activated deoxyribonuclease）受到裂解，也因此成為細胞凋亡 的主要原因(Ghobrial, et al., 2005; Wong, 2011)。Caspase 7是caspase 3 的下游，也是屬於執行細胞凋亡的核心蛋白質之一，而且caspase 7與 caspase 3都會受到細胞凋亡抑制子（inhibitors of apoptosis，IAPs）的

家族成員，如：survivin和XIAP等所抑制(Deveraux & Reed, 1999)。

2. 非Caspase蛋白

（1）Bcl-2家族

Bcl-2家族蛋白可依他們促凋亡和抗凋亡的作用及其所擁有的 Bcl-2同源結構區域分為三群(Schinzel, Kaufmann, & Borner, 2004;

Youle & Strasser, 2008)。抗凋亡Bcl-2類蛋白質，如: Bcl-2、Bcl-XL、

Bcl-w、Mcl-1和A1/Bfl-1，促凋亡Bcl-2類蛋白質，如: Bax、Bak和 Bok/Mtd均具有四個BH的結構區域(Kvansakul et al., 2008)。另外還有 一類則只有BH3結構的促凋亡蛋白質，如: Bid、Bim/Bod、Bad、Bmf、

Bik/Nbk、Blk、Noxa、Puma/Bbc3、及Hrk/DP5。正因為他們僅有BH3 這個簡短的結構區域而作為他們的命名區別。BH3蛋白參與並傳遞死

Bik/Nbk、Blk、Noxa、Puma/Bbc3、及Hrk/DP5。正因為他們僅有BH3 這個簡短的結構區域而作為他們的命名區別。BH3蛋白參與並傳遞死