本實驗中發現由 triepoxide teroxirone, [1,3,5-triazine-2,4,6
（1H,3H,5H）tri-one-1,3,5-tris（oxiranylmethylHa）; Henkel compound]
這個結構修飾而得的 triazinone triepoxide TATT 比臨床用藥
（cisplatin、carboplatin 與 oxaliplatin）對人類正常細胞更具安全性，
毒殺人類大腸直腸癌細胞 HT-29 的能力也較強。進一步發現無論是 triazinone triepoxide TATT 或臨床用藥與天然物薑黃素合併處理 HT-29，對於毒殺癌細胞的能力具有加乘或協同的效用。
研究表示含鉑金屬藥物透過插入 DNA 結構或藉由影響細胞內的 自由基含量，對細胞造成的多種影響，包括：阻斷 DNA 複製、抑制 轉錄、引發細胞週期停止以進行 DNA 修復，因而抑制細胞生長和導 致細胞凋亡(D. Wang & Lippard, 2005a)。鉑金屬藥物對於不同種癌細 胞核內蛋白質NF-B 的影響不盡相同，在人類上皮腫瘤細胞(Shen, et al., 2008)與頭頸部鱗狀細胞癌(Duarte, et al., 2010)，經由鉑金屬臨床藥 物處理後，發現核內的NF-B 的蛋白質表現增加，而頭頸部鱗狀細 胞癌以鉑金屬合併薑黃素去處理時NF-B 表現則下降。但另一方面 也有研究發現以鉑金屬臨床藥物處理人類胚胎腎細胞(Sohn et al., 2010)、人類乳癌細胞(Poplawska, et al., 2009)、人類卵巢癌細胞
2011)後，細胞核內的 NF-B的表現增加，也有研究發現在人類腎臟 腫瘤細胞(J. Li, Vesey, Johnson, & Gobe, 2007)以鉑金屬臨床藥物處理 後，其NF-B 的表現並沒有差異。研究也指出以鉑金屬臨床藥物處 理癌細胞，核內蛋白質 endoG 的表現會增加，包括前列腺癌(X. Wang, et al., 2008)與頭頸部鱗狀細胞(J. S. Kim, et al., 2008)癌等細胞，與鉑金 屬臨床藥物所產生的 ROS 進而誘發 endoG 的產生有關(J. S. Kim, et al., 2008)，最終導致細胞凋亡。本實驗結果發現 triazinone triepoxide TATT 是透過細胞凋亡（Fig. 3）的外在與內在路徑，導致細胞凋亡，包括：
促使（1）caspase 3、7 與 8 的活化（Fig. 9 ~ 13），活化態的 caspase 8 進一步切斷 Bid（Fig. 26 ~ 27）並使 t-Bid 移至粒線體誘發 cytochrome c 釋出（Fig. 20 ~ 21）；（2）促凋亡蛋白 Bax（Fig. 24~ 25）、cytochrome c（Fig. 20 ~ 21）、smac（Fig. 22 ~ 23）、endoG（Fig. 37）、AIF（Fig.
35）的表現增加及（3）抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2（Fig. 28 ~ 29）與 Bcl-w
（Fig. 4-30 ~ 4-31）的表現。
目前研究中常見與含鉑金屬藥物合併使用的天然物包括：十字花 科蔬菜和木瓜果實中的苯甲基異硫氰酸酯（benzyl isothiocyanate）(Y.
Lee et al., 2012)、菊科和木蘭科植物中萃取出的倍外萜內酯類
（sesquiterpene lactones）之一的木香烴內酯（costunolide）(Yang, Kim, Lee, & Choi, 2011)、葡萄、桑葚和花生的外皮萃取出的酚類化合物白
藜蘆醇（resveratrol）(Olas et al., 2006)、植物絲蘭樹皮中萃取出的酚 類化合物（phenolic compounds）(Olas, et al., 2006)與薑黃根部萃取而 來的薑黃素(Howells, Mitra, & Manson, 2007)等。其中被作為食品調味 劑的薑黃素已被廣泛指出具有抗發炎和抗氧化的活性(Casellas et al., 1998)，甚至還能強效抑製突變和癌變的產生(Azuine, Kayal, & Bhide, 1992; Rao, Rivenson, Simi, & Reddy, 1995)。研究發現薑黃素所引起的 生物效應，包括細胞皺縮、染色質濃縮、DNA 氧化損傷(Sreejayan &
Rao, 1994)，甚至對酵素與蛋白質也有影響，包括抑制一氧化氮合酶
（nitric oxide synthase）、酪氨酸激酶接受器（receptor tyrosine
kinase）、蛋白激酶 C（protein kinase C）、Akt、NF-κB、cyclin D1 和 活化 p53(S. Aggarwal et al., 2006; Jiang, Yang-Yen, Lin, & Yen, 1996;
Mukhopadhyay et al., 2002; Pan, Lin-Shiau, & Lin, 2000; Singh &
Aggarwal, 1995)。研究證明薑黃素能抑制多種類型腫瘤細胞增生與存 活。越來越多的研究指出，薑黃素藉由活化細胞死亡的路徑與抑制細 胞生長或增殖的路徑引發細胞死亡(Ravindran, Prasad, & Aggarwal, 2009)，其中包括（1）透過 caspase 路徑或相關蛋白質（如：AIF）的 活化，如：肺癌細胞(Lin et al., 2008)、大腸直腸癌細胞(Su et al., 2006)、
黑色素瘤細胞(Qiu et al., 2005)、淋巴癌細胞(Wu, Chen, & Li, 2005)，
動物實驗(Belakavadi & Salimath, 2005)也發現同樣結果；（2）透過非
caspase 路徑的活化，如：淋巴母細胞淋巴瘤(Piwocka, Jaruga, Skierski, Gradzka, & Sikora, 2001)；（3）凋亡釋放因子（如：Bax 或 smac 等）
的釋出，如：前列腺癌細胞(Shankar, Chen, Sarva, Siddiqui, & Srivastava, 2007)、大腸直腸癌細胞(Rashmi, Kumar, & Karunagaran, 2004, 2005)；
（4）抑制抗凋亡蛋白質（NF-B、STAT3 或 Bcl-2 等），如：霍奇金 氏淋巴瘤(Mackenzie et al., 2008)、骨髓細胞瘤(B. Liu, Bai, Chen, Gao,
& Gu, 2007)、子宮內膜癌細胞(Yu & Shah, 2007)、胰臟癌 (Kunnumakkara et al., 2007)與誘發大腸直腸癌的動物實驗
(Kunnumakkara et al., 2008)也有相似結果；（5）透過粒線體路徑的活 化，如：大腸直腸癌(Su, Lin, et al., 2006)、乳癌(Cheah et al., 2009)、
神經膠母細胞瘤(Karmakar, Banik, Patel, & Ray, 2006)。誘發大腸直腸 癌細胞的動物實驗(Kwon & Magnuson, 2009)也證實相同的結果。
流行病學研究和臨床試驗也已經證明，富含薑黃素的飲食形態能 降低某些類型的人類惡性腫瘤的發展，如：子宮頸上皮內贅瘤（cervical intraepithelial neoplasm）、口腔白斑病（oral leucoplakia）與胰臟癌
（pancreatic cancer），或改善癌前病灶的組織損害，如：近期切除手 術的膀胱癌患者、口腔白斑病患、腸胃組織細胞不正常分化病患、子 宮頸上皮內贅瘤與文氏癌前皮膚病患（Bowen's disease）(Cheng et al., 2001; Dhillon et al., 2008; Ye, Li, Yin, & Zhang, 2012)。本實驗結果（Fig.
35 ~ 37）發現，薑黃素使 HT-29 中核內蛋白質 NF-B 表現下降，而 endoG 與 AIF 表現則上升。單獨使用 triazinone triepoxide TATT 處理 HT-29 時，反而使 NF-B 表現上升，雖然 endoG 與 AIF 表現仍然上 升。當薑黃素與 triazinone triepoxide TATT 合併處理 HT-29 時，發現 NF-B 表現又再度下降，endoG 與 AIF 表現仍然是上升。從實驗結果 猜測幾種影響，（1）triazinone triepoxide TATT 可能透過 AIF 或 endoG 引發 HT-29 產生細胞凋亡，與薑黃素合併後導致 NF-B 表現下降，
促使 HT-29 細胞產生凋亡。另外也猜測（2）因薑黃素使用濃度約為 triazinone triepoxide TATT 的七倍，可能造成薑黃素對於 HT-29 的影 響高過於 triazinone triepoxide TATT，又薑黃素與 triazinone triepoxide TATT 對於細胞內蛋白質而言，同屬於容易被攻擊的化合物，所以較 高濃度的薑黃素產生的影響也較明顯，因此在兩者合併處理 HT-29 的情況下，可能出現互有拮抗或具保護的角色；（3）薑黃素與 triazinone triepoxide TATT 對 HT-29 的影響可能透過其他的蛋白質近而促進細胞 凋亡的產生。
研究指出以含鉑金屬藥物處理多種癌細胞會影響 NF-B 與
endoG 的表現，常見結果為 NF-B 受到抑制(Duarte, et al., 2010; Shen, et al., 2008)和 endoG 表現增加(J. S. Kim, et al., 2008; X. Wang, et al., 2008)。當薑黃素與含鉑金屬藥物合併處理時，使 NF-B 更進一步受
到抑制(Poplawska, et al., 2009)。當然也有經藥物處理結果為 NF-B 表現增加(du Plessis-Stoman, et al., 2011)，但是同樣合併薑黃素後，
NF-B 也受到抑制(Duarte, et al., 2010)。本實驗結果發現，以含鉑金 屬藥物處理 HT-29 後，細胞核內蛋白質 NF-B 與 endoG 表現增加。
與單獨使用鉑金屬藥物相比，當鉑金屬藥物與薑黃素合併處理 HT-29 後，NF-B 與 endoG 表現均下降。因此推測，HT-29 受到鉑金屬藥物 處理導致細胞凋亡部分原因可能為誘發 AIF 與 endoG 的釋放，當合 併薑黃素後，引起細胞凋亡的原因可能再加上 NF-B 受到抑制。
過去研究中含鉑金屬藥物的濃度使用大多介於 10~20 M，雖然 對於許多腫瘤細胞的毒殺效果很好，但同樣也會傷害正常細胞而產生 毒性與副作用，包括：神經毒性、腎功能損傷、噁心、嘔吐、貧血與 食慾不振等(Calvert, et al., 1982; Meriggi & Zaniboni, 2010)。本實驗所 使用的劑量為 4 M，比先前的研究劑量低。從細胞毒殺試驗結果（Fig.
4-4）發現，同樣 4 M 的 triazinone triepoxide TATT 對於 HT-29 的抑 制率與用於治療大腸直腸癌治療的 oxaliplatin 相似（p > 0.05），比 cisplatin 低（p > 0.05），比 carboplatin 高（p < 0.05）。結果也發現薑 黃素與 triazinone triepoxide TATT 或臨床藥物合併處理後明顯提升對 細胞的抑制率（p < 0.05），薑黃素合併 triazinone triepoxide TATT 與 合併 cisplatin 的抑制率最高，其次為與 carboplatin 和 oxaliplatin 合併，
均沒有顯著差異（p > 0.05）。從實驗結果（Fig. 4-2）發現，triazinone triepoxide TATT 對正常細胞 HUVEC 的安全性與 carboplatin 沒有顯著 差異（p > 0.05），但都勝過 cisplatin 與 carboplatin。因此 triazinone triepoxide TATT 是一個在毒殺大腸直腸癌細胞上比臨床藥物有效，在 正常細胞上比臨床用藥安全的化合物。
研究指出，含鉑金屬藥物透過插入DNA引起損傷，影響細胞DNA 複製、修復轉錄，進而使細胞週期停止，在多數細胞造成S與G2/M期 的停止(D. Wang & Lippard, 2005a)，有部分原因與依賴Chk1/2的 CDC25 磷酸酶受到抑制有關。CDC25有三種異構物，包含：
CDC25A、CDC25B和CDC25C，它們能將Cdk2和CDC2去磷酸化 (Ferguson, White, Donovan, & Piwnica-Worms, 2005)。少部分則為G1 期停止，常是因為透過抑制G1期關鍵點上游的酵素，使得G1期的 Cdk4/cyclin D與Cdk2/cyclin E 的複合體受到抑制(Eastman, 2004;
Samuel, Weber, & Funk, 2002)。研究指出含鉑金屬化合物在多數細胞 引起的細胞週期G2/M期停止，可能透過CDC25磷酸酶受到抑制 (Ferguson, et al., 2005)使得cyclin B1/CDC2複合體活性下降造成G2/M 期的停止(Bucher & Britten, 2008)。本實驗結果（Fig. 7，Table 2）發 現triazinone triepoxide TATT（4 M）處理24小時對HT-29引起細胞週 期G2/M期比例減少，並且與G2/M相關蛋白CDC25B和CDC25C的表
現下降（Fig. 32 ~ 34），cyclin B1表現增加。因此CDC25B和CDC25C 的表現下降並沒有讓細胞週期停在G2/M期，所以猜測可能透過別條 路徑影響cyclin B1的表現增加，造成G2/M期減少，或是透過triazinone triepoxide TATT的12小時處理下，促使細胞週期停在G2/M期，當處理 時間延長至24小時，可能使細胞修復不及進而G2/M期減少與sub-G1 期的增加。另外從結果（Table 2及Table 3）發現，從細胞毒殺試驗與 細胞週期各期比例，利用公式計算出的q值，triazinone triepoxide TATT 與oxaliplatin對於HT-29的存活與sub-G1的比例上均為加乘效果，
cisplatin與carboplatin則為拮抗。研究指出，當DNA受損時，G2期停 止有利於細胞進行修復(Stark & Taylor, 2006)，許多抗癌藥物藉由這 種方式做為降低癌細胞有絲分裂而控制癌細胞增生。從結果（Table 1 及Table 2）中發現2 M的triazinone triepoxide TATT導致HT-29的細胞 週期S期減少、G2/M期增加，但是4 M的triazinone triepoxide TATT 卻引起HT-29的細胞週期S期則增加、G2/M期減少，因此猜測不同濃 度的triazinone triepoxide TATT可能影響不同期的細胞週期，薑黃素的 作用則增加細胞凋亡的發生。
研究指出不同濃度的薑黃素也會影響細胞週期，同樣大腸直腸癌 細胞HT-29受到5~100 M薑黃素處理，G0/G1期在小於20 M沒有變 化，直到30 M才開始減少；S期從5 M開始就有增加的情況；G2/M
期在小於20 M時是下降的，20~30 M是增加的，越高濃度則沒有變 化(Dempe, Pfeiffer, Grimm, & Metzler, 2008; Giladi et al., 2010;
Howells, et al., 2007; Van Erk et al., 2004)。本實驗結果（Fig. 4-7，Table 4-3）發現，以30 M薑黃素處理HT-29後，Sub-G1期增加，G0/G1期 與S期減少，G2/M期則沒有差異，與研究的結果相似。因此由以上的 結果可以推測，薑黃素的合併治療有助於提高triazinone triepoxide TATT所引起HT-29的細胞凋亡，可能因為（1）triazinone triepoxide TATT透過增加cyclin B1與減少CDC25B和CDC25C的表現，使細胞週 期G2/M期減少及sub-G1期增加，加上（2）triazinone triepoxide TATT 引發細胞凋亡內外路徑的相關蛋白質表現，包括caspase、Bcl-2家族 蛋白質、AIF與endoG等，再加上（3）薑黃素抑制核內蛋白質NF-B 的表現，因而引發更大量的細胞凋亡產生。