植化素薑黃素藉由引發細胞凋亡促進新穎及傳統鉑金屬大腸直腸癌化療藥物之敏感性

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(1)國立台灣師範大學人類發展與家庭學系營養科學與教育組碩士論文 Department of Human Development and Family Studies National Taiwan Normal University. 植化素薑黃素藉由引發細胞凋亡促進新穎及傳統鉑金屬大腸直腸癌化療藥物之敏感性 Phytochemical curcumin enhances chemosensitivity of human colorectal cancer cells to novel and approved platinum-based anticancer drugs via induction of apoptosis. 研究生：王盈堤 Ying-Ti Wang. 指導教授：蘇純立博士 Advisor：Chun-Li Su, Ph.D.. 中華民國一百零一年六月 June, 2012.

(2) 中文摘要營養支持對於接受癌症治療的病人非常重要。透過營養素與臨床抗癌藥物的交互作用，營養素可能具有輔助或抑制藥物的效用，可能提高或降低癌症病人的治療效率，因此營養素的建議攝取對於藥物治療的效果有重要的角色。人類大腸直腸癌是目前第二大流行與致死率排行第三的癌症。然而在治療方法上除手術外，還有化學治療與放射線治療。化學治療藥物中包含鉑金屬化合物，如：cisplatin、carboplatin 與 oxaliplatin 等。但化學治療藥物容易產生副作用，如：腎毒性、神經毒性、噁心嘔吐等，造成病患身體不適。為解決目前抗癌用藥抗藥性及副作用的困境，實驗想要藉由天然物薑黃素的輔助去降低新穎化合物或臨床藥物的使用劑量，進而解決困境。我們研究團隊從許多新穎合成的化合物中篩選出具有抗癌潛力的 triazinone triepoxide TATT。藉由細胞毒殺試驗（MTT assay）得知 triazinone triepoxide TATT 比 cisplatin、carboplatin 或 oxaliplatin 對於人類大腸直腸癌細胞（HT-29）更具細胞毒殺或是抑制細胞生長的效用，對於人類正常臍靜脈內皮細胞（HUVEC），triazinone triepoxide TATT 則比 cisplatin、 carboplatin 或 oxaliplatin 有較低的毒性且較安全。進一步探討發現 triazinone triepoxide TATT 會引發 HT-29 之細胞凋亡（apoptosis）並對細胞週期造成影響。使用 propidium iodide（PI）或 annexin V 染色， ii.

(3) 以流式細胞儀進行分析發現 HT-29 細胞經 4 M triazinone triepoxide TATT 處理 12 小時後，細胞凋亡比例與 G2/M 期增加，處理 24 小時後，G2/M 期減少而細胞凋亡比例持續增加。在同樣 24 小時 4 M 條件之下，triazinone triepoxide TATT 與 cisplatin、carboplatin 或 oxaliplatin 處理後的細胞相比，triazinone triepoxide TATT 引發較多的細胞凋亡比例。進一步使用細胞凋亡機轉相關的抑制劑，如：caspase 8 抑制劑 Z-IETD-fmk 及粒線體 transition pore 抑制劑 cyclosporine A 處理 HT-29 細胞，以 annexin V 染色進行流式細胞儀分析、西方點墨法、共軛焦顯微鏡與螢光顯微鏡分析，確認 triazinone triepoxide TATT 是透過 caspase 8 及粒線體相關蛋白質的內外路徑影響大腸直腸癌細胞產生細胞凋亡，並透過增加 cyclin B1 的表現與減少 CDC25B 與 CDC25C 的表現使 G2/M 期減少及 sub-G1 期的增加。進一步以薑黃素（30 M）與 triazinone triepoxide TATT（4 M）處理 HT-29 細胞 24 小時後，以 PI 染劑或 annexin V 染色再以流式細胞儀進行分析，並透過 Jin’s method 公式計算出薑黃素與 triazinone triepoxide TATT 或 oxaliplatin 合併處理致使大腸直腸癌細胞產生凋亡具有加乘或協同的效果，但薑黃素與 cisplatin 或 carboplatin 合併後效果為拮抗。本研究結果發現 triazinone triepoxide TATT 具有開發成為新一代的抗癌藥物的潛力，以提供癌症病患治療的不同選擇，期望能改善並提升醫療品質。在進行 iii.

(4) 化療病人的飲食建議上，含薑黃素的食物，如：薑黃或咖哩等的攝取建議，可能會影響抗癌藥物的治療效果，值得再深入探討。其它天然植物與蔬果中之安全並有效的成分，如：苯甲基異硫、氰酸酯、木香烴內酯與酚類化合物白藜蘆醇等，對於藥物治療為輔助或抑制效果應有深入的了解。期望藉由飲食上增加補充或減少攝取天然物中的營養素，促使化療藥物發揮更好的治療效果。關鍵字：Triazinone triepoxide TATT、薑黃素、細胞凋亡、訊息傳遞、鉑金屬化合物、人類大腸直腸癌. iv.

(5) Abstract Nutritional support is very important for the patients undergoing cancer treatment. Through the interaction of nutrients with anti-cancer drugs, the efficacy of the treatment may be enhanced or inhibited. Therefore, dietary recommendation plays an vital role on the effects of the treatment. Human colorectal cancer is the second most popular and the third leading cause of death in cancers. Surgery, chemotherapy and radiation therapy are the common treatments, and platinum-based compounds such as: cisplatin, carboplatin and oxaliplatin are ordinary used. However, these chemotherapeutic drugs are likely to cause side effects and result in illness of the patients. In order to resolve the current plight of the anti-cancer drugs, a number of new synthetic compounds were screened and the anti-cancer potential of triazinone triepoxide TATT was discovered. Further study indicates that triazinone triepoxide TATT displays comparable anti-cancer effect on human colorectal cancer HT-29 cells. Nevertheless, triazinone triepoxide TATT displays relatively less cytotoxicity on normal human umbilical vein endothelial cells than cisplatin, carboplatin or oxaliplatin determined by the cytotoxicity MTT assay, suggesting that triazinone triepoxide TATT has lower toxicity and v.

(6) is more secure than the anti-cancer drugs. In addition, triazinone triepoxide TATT induced apoptosis and regulated cell cycle of HT-29 cells using propidium iodide (PI) or annexin V staining followed by flow cytometry. Of note is that when HT-29 cells were treated at 4 M for 24 hours, triazinone triepoxide TATT exhibited greater effects than these anti-cancer drugs. Administration of caspase 8 inhibitor (Z-IETD-fmk) or mitochondrial transition pore inhibitor (cyclosporine A) followed by flow cytometry analysis, Western blotting, confocal microscopy and fluorescence microscopy confirmed that triazinone triepoxide TATT-induced apoptosis proceeded via caspase and mitochondrial pathways. triazinone triepoxide TATT-induced decrease in G2/M phase accompanied with the increase of cyclin B1. Addition of curcumin (30 M) increased apoptosis of HT-29 cells and produced an additivity or synergistic effect on triazinone triepoxide TATT or oxaliplatin but resulted in an antagonistic effect on cisplatin or carboplatin using PI or annexin V staining followed by flow cytometry analysis and Jin's method to calculate the interaction of two agents. The results of this study indicates the anti-cancer potential of triazinone triepoxide TATT and triazinone triepoxide TATT may provide an alternative choice for treating vi.

(7) cancer to improve the quality of medical care. Regarding to of the dietary recommendation for the patients with chemotherapy, suggestion of curcumin-rich foods, such as: turmeric or curry, etc., may affect the anti-cancer efficacy. Other phytochemicals, such as: benzene, methyl isothiocyanate, cyanate ester, costunolide and phenolic compounds resveratrol, etc., may also assist or inhibit the anti-cancer therapy. Further study is needed to understand the interactions of dietary supplements or the nutrients in natural products on chemotherapy to optimize the therapeutic effect.. Keywords: Triazinone triepoxide TATT, curcumin, apoptosis, signal transduction, platinum-based compound, human colorectal cancer. vii.

(8) 誌謝三年的研究生生活終於要結束了，雖然在研究的領域很辛苦，但在營養領域工作六年的我，格外珍惜這段能夠重拾學生身分的時光！首先非常感謝我的指導教授蘇純立老師很有耐心地教我，讓我從對於研究領域完全陌生到逐漸熟悉，訓練我對於很多事情有追根究柢的精神及獨立思考的能力，甚至是不厭其煩地安慰我、鼓勵我，讓我從實驗不順的低落情緒中繼續振作，所以我才能完成研究，感謝老師。感謝口試委員黃奇英教授、陳焜銘教授、鄭宏祺助理教授在百忙之中抽空審閱論文，並於口試時給予指導與建議，使本文內容更加完善，在此獻上最深的謝忱。接著要感謝呈欣學姊和清勳學姊一步一步仔細地教我實驗，讓我學習到很多實驗的技巧。感謝師大實驗室的夥伴們育亭、宥苡、賴佩、仲潔和若涵，學妹嘉玲和幸芷，在辛苦實驗的過程中互相鼓勵和支持，感謝和我一同來到師大念書的葵蓉，很多時候沒有她的打氣是很難熬過的。在這三年中更要感謝陽明大學的黃奇英老師和成功大學的劉校生老師提供很棒的研究環境與資源，在充滿人情味的成大實驗室，昇輝學長、珊瑩學姊、靖棠學姊和煥晴學長很有耐心地與我討論並給我建議，佩珊、瑄耘、于嬋、家銘、紓晴和思含，有你們的陪伴讓研究生活充滿歡樂。三年的時間裡也會有想要放棄的念頭，但是感謝我的高中好友們，柯、瑄、蒨、阿勳、阿 viii.

(9) 樂和大勳給我的鼓勵和實驗技巧上的幫助，讓我在研究上越挫越勇，也感謝我在台北的親愛室友姿含和佩寰，好險在台北有你們，讓我疲累回到家總是有人可以說說話聊聊天，一起分享研究的苦樂。感謝以前的同事美華姐、珍姐和小芳在一旁為我打氣，感謝 gigu 學長在身邊不時的叮嚀和愛護，作為重要的支柱。我最感恩的是我的家人，我的爺爺、奶奶、爸爸、媽媽和妹妹，無條件的支持我離開職場繼續升學，讓我在沒有經濟壓力的情況下完成學位，雖然他們很心疼如此辛苦研究的我，但總是在一旁很正面的鼓勵我，因此才能完成目標。感謝所有幫助我過我的人。最後，我要感謝上天給我這個很棒的學習過程，讓我在人事物各方面都有所成長與體悟。感謝大家，感恩上天！謹以此論文獻給我敬愛的大家. 王盈堤謹誌於國立臺灣師範大學人發系研究所民國一百零一年六月. ix.

(10) 目錄頁數第一章緒論. ……………………………………………………………………. 1. …………………………………………………………. 1. …………………………………………. 1. …………………………………………………. 4. …………………. 5. 第一節大腸直腸癌. 一、大腸直腸癌的流行與發生二、大腸直腸癌的治療. 三、大腸直腸癌之臨床用藥及其副作用與治療困境. 第二節 Triazinone triepoxide TATT 與臨床抗癌用藥 cisplatin、carboplatin 和 oxaliplatin. ………………………………………………………….... 7. ……………………………………….... 7. …………………………………………………………. 9. 一、 Triazinone triepoxide TATT 二、鉑金屬藥物. ……………………………………………. 12. …………………………………………………………….. 12. 二、 Carboplatin. ………………………………………………………….. 12. 三、 Oxaliplatin. …………………………………………………………... 13. ………………………………………………. 14. ………………………. 16. ……………………………………………………. 17. ……………………………………………………………. 17. 第三節鉑金屬藥物的抗癌機轉一、 Cisplatin. 第四節薑黃素及其抗癌機轉. 第五節合併使用薑黃素與鉑金屬藥物之抗癌機轉第六節計劃性細胞死亡一、細胞自噬. x.

(11) …………………………………………………. 19. 三、細胞壞死. ……………………………………………………………. 21. 四、細胞凋亡. ……………………………………………………………. 22. …………………………………………………. 37. ……………………………………………………………….. 40. …………………………………………………………….. 42. …………………………………………………………. 42. ………………………………………………... 42. …………………………………………………………………. 46. ……………………………………………………………. 51. …………………………………. 51. ……………………………………………………………. 54. …………………………... 55. 四、西方墨點法（western blot analysis）. ……………………………... 56. 五、細胞週期分析（cell cycle analysis）. …………………………….... 60. ……………………. 62. 二、細胞自噬相關路徑. 第七節細胞週期及其調控第二章研究目的第三章材料與方法第一節儀器與材料. 一、儀器（型號與廠商）二、材料. 第二節實驗方法. 一、細胞株之解凍、繼代培養及保存二、藥物配製. 三、細胞存活分析（cell viability analysis）. 六、細胞早期凋亡分析（cell apoptosis analysis）. 七、共軛聚焦顯微鏡（confocal microscope）觀察粒線體電位（△Ψm ）的改變. ……………………………………………………………. 八、收取細胞質蛋白質（cytosolic protein extraction）與粒線體蛋白質 xi. 63.

(12) ………………………………. 64. ……………….. 65. ………………………. 67. ……………………………………………………………. 69. （mitochondrial protein extraction）. 九、收取細胞核內蛋白質（nuclear protein extraction）十、螢光顯微鏡觀察細胞產生凋亡小體的表現十一、統計分析第四章結果. 第一節 Triazinone triepoxide TATT 對於人類大腸直腸癌細胞 HT-29 的毒性高，但對人類正常臍靜脈內皮細胞 HUVEC 毒性較低. …………. 71. 第二節 Triazinone triepoxide TATT引發HT-29細胞產生細胞週期停止及細胞凋亡. ………………………………………………………………. 74. 第三節薑黃素使 triazinone triepoxide TATT 或臨床藥物引發 HT-29 細胞產 ………………………………………. 生細胞膜內層外翻比例增加. 80. 第四節薑黃素促進 triazinone triepoxide TATT 或臨床藥物合併引發 HT-29 細胞之細胞週期停止與細胞凋亡. …………………………………. 82. 第五節薑黃素促進triazinone triepoxide TATT或臨床藥物引發HT-29細胞凋亡具有加乘與協同效用. ……………………………………………. 86. 第六節 Triazinone triepoxide TATT造成細胞凋亡路徑中之caspase 8、caspase 3、caspase 7的活化. …………………………………………………. 88. 第七節透過 caspase 8 抑制劑 Z-IETD-fmk 了解外在路徑對於 triazinone triepoxide TATT 造成 HT-29 細胞凋亡的重要性 xii. ………………….. 96.

(13) 第八節透過抑制劑 cyclosporine A 了解內在路徑對於 triazinone triepoxide TATT 造成 HT-29 細胞凋亡的重要性. …………………………….. 101. 第九節 Triazinone triepoxide TATT 造成 HT-29 細胞粒線體膜電位改變的相 106 關蛋白質. ……………………………………………………………. 第十節 Triazinone triepoxide TATT 造成 HT-29 細胞週期停止的相關蛋白 119 質. ……………………………………………………………………. 第十一節 Triazinone triepoxide TATT 與薑黃素合併處理造成 HT-29 細胞核內 124 蛋白質的變化. ………………………………………………………. 第十二節臨床藥物（casplatin、carboplatin 與 oxaliplatin）與薑黃素合併處理 ………………………………. 129. 第五章討論. …………………………………………………………..………... 132. 第六章結論. …………………………………………………………..………... 141. …………………………………………………………..…... 143. 附錄 ……………………………………………………………………….……….. 176. 造成 HT-29 細胞核內蛋白質的變化. 第七章參考文獻. xiii.

(14) 表次頁數 Table 1 The percentages of cells at different phases of cell cycle in Fig. 3 …………………………………………………………………………. 77. Table 2 The percentages of cells at different phases of cell cycle in Fig.7 and the value of q. ………………………………………………………. 85. Table 3 The q value of HT-29 cells treated with triazinone triepoxide TATT or anticancer drugs plus curcumin in Fig. 4. xiv. ………………………….. 87.

(15) 圖次頁數 Fig. 1 Triazinone triepoxide TATT is one of 103 compounds exhibiting IC50 < 10 M by MTT assay. ……………………………………………….... 8. Fig. 2 Effect of triazinone triepoxide TATT, cisplatin, carboplatin and oxaliplatin on HT-29 cell viability determined by MTT assay. ………. 72. ……. 73. Fig. 3 Effect of triazinone triepoxide TATT, cisplatin, carboplatin and oxaliplatin on HUVEC cell viability determined by MTT assay. Fig. 4 Triazinone triepoxide TATT induced apoptosis of HT-29 cells in a doseand time-related manner. …………………………………………….... 76. Fig. 5 Effect of triazinone triepoxide TATT, cisplatin, carboplatin and oxaliplatin with or without curcumin on HT-29 cell viability determined by MTT assay. ……………………………………………………….... 78. Fig. 6 Triazinone triepoxide TATT exhibits stronger effects on inducing apoptosis of HT-29 at 12 h and 24 h post-treatment than cisplatin, carboplatin, and oxaliplatin. …………………………………………... 79. Fig. 7 The chemosensitivity of triazinone triepoxide TATT in combination with curcumin is similar to those of anti-cancer drugs. …………………….. Fig. 8 Confirmation of triazinone triepoxide TATT- and anti-cancer xv. 81.

(16) drugs-induced apoptosis on HT-29 by using PI staining. ……………... 84. Fig. 9 The time-related change of caspase 8 protein expression in triazinone triepoxide TATT-induced HT-29 cells. ……………………………….. 90. Fig. 10 The time-related change of caspase 3 protein expression in triazinone triepoxide TATT-induced HT-29 cells. ……………………………….. 91. Fig. 11 The time-related change of caspase 7 protein expression in triazinone triepoxide TATT-induced HT-29 cells. ……………………………….. 92. Fig. 12 The dose-related change of caspase 8 protein expression in triazinone triepoxide TATT-induced HT-29 cells. ……………………………….. 93. Fig. 13 The dose-related change of caspase 3 protein expression in triazinone triepoxide TATT-induced HT-29 cells. ……………………………….. 94. Fig. 14 The dose-related change of caspase 3 protein expression in triazinone triepoxide TATT-induced HT-29 cells. ……………………………….. 95. Fig. 15 Inhibitory effect of caspase 8 inhibitor Z-IETD-fmk on triazinone triepoxide TATT-induced the levels of cleavage-caspase 3 protein in HT-29 cells by western blot. ………………………………………….. 98. Fig. 16 Effect of triazinone triepoxide TATT and the inhibitory effect of 20 M Z-IETD-fmk on the formation of apoptotic bodies. …………………... Fig. 17 Inhibitory effect of caspase 8 inhibitor Z-IETD-fmk on triazinone xvi. 99.

(17) triepoxide TATT-induced apoptosis in HT-29 cells. ………………….. 100. Fig. 18 Effect of triazinone triepoxide TATT and the inhibitory effect of 10 M CsA on the change of Δψm in HT-29 cells. …………………………... 103. Fig. 19 Inhibitory effect of cyclosporine A (CsA) on triazinone triepoxide TATT-induced the levels of cleavage-caspase 9 protein in HT-29 cells by western blot. ……………………………………………………….. 104. Fig. 20 Inhibitory effect of cyclosporine A (CsA) on triazinone triepoxide TATT-induced apoptosis in HT-29 cells. ……………………………... 105. Fig. 21 Expression of cytosolic cytochrome c protein by western blot analysis ……………………………………………………………………………. 107. Fig. 22 Expression of mitochondrial cytochrome c protein by western blot analysis. ……………………………………………………………….. 108. ……... 109. Fig. 23 Expression of cytosolic Smac protein by western blot analysis. Fig. 24 Expression of mitochondrial Smac protein by western blot analysis Fig. 25 Expression of cytosolic Bax protein by western blot analysis. .... 110. ……….. 111. ….. 112. ………... 113. ….. 114. …….... 115. Fig. 26 Expression of mitochondrial Bax protein by western blot analysis Fig. 27 Expression of cytosolic Bid protein by western blot analysis. Fig. 28 Expression of mitochondrial tBid protein by western blot analysis Fig. 29 Expression of cytosolic Bcl-2 protein by western blot analysis xvii.

(18) Fig. 30 Expression of mitochondrial Bcl-2 protein by western blot analysis Fig. 31 Expression of cytosolic Bcl-w protein by western blot analysis. .... 116. ……... 117. Fig. 32 Expression of mitochondrial Bcl-w protein by western blot analysis. ... 118. ………………………………………………….. 121. Fig. 33 Involvement of Cyclin B1 protein in G2/M arrest of HT-29 cells by western blot analysis. Fig. 34 Expression of CDC25B protein in of HT-29 cells by western blot analysis. ……………………………………………………………….. 122. Fig. 35 Expression of CDC25C protein in of HT-29 cells by western blot analysis. ……………………………………………………………….. 123. Fig. 36 Involvement of nuclear AIF protein in HT-29 cells by western blot analysis. ……………………………………………………………….. 126. Fig. 37 Involvement of nuclear NF-B protein in HT-29 cells by western blot analysis. ……………………………………………………………….. 127. Fig. 38 Involvement of nuclear EndoG protein in HT-29 cells by western blot analysis. ……………………………………………………………….. 128. Fig. 39 Involvement of nuclear NF-B protein in HT-29 cells by western blot analysis in response to anticancer drugs. ……………………………... 130. Fig. 40 Involvement of nuclear EndoG protein in HT-29 cells by western blot analysis in response to anticancer drugs xviii. ……………………………... 131.

(19) xix.

(20) 第一章緒論第一節大腸直腸癌一、大腸直腸癌的流行與發生癌症從 20 世紀開始就是一種可怕的疾病，延伸到 21 世紀其流行率有與日俱增的趨勢，而各種癌症是造成人類死亡的主因之ㄧ，也因為如此，各種癌症的化學預防治療也隨之增加(Manikandan et al., 2012)。人類大腸直腸癌是目前全球第二大流行與致死率排行第三的癌症。在全球的癌症新診斷病例中佔 9.7%，癌症死亡率中則佔 8.4% (Patel & Majumdar, 2009)。以種族來統計，白種人得到大腸直腸癌的機率比黑種人還要高，在性別差異上，男性的發生率比女性來的高。在地區方面，已開發地區，如：北美、西歐、北歐等，大腸直腸癌的發生率較高，而在開發中或未開發地區，如：非洲、印度、東南亞等地區，則發生率較低(Biswal, Sain, Othman, & Baba, 2002; Keating, Pater, Lolohea, & Wickremesekera, 2003; Tokudome et al., 2000)。在台灣自民國 71 年起，癌症即成為台灣 10 大死因之首。從民國 97 年的癌症年度報告中可以知道台灣共有 41,123 人死於惡性瘤，佔所有死亡人數的 27.30%，每 10 萬人口粗死亡率為 179.24，每 10 萬人口年齡標準化死亡率為 139.6。同年，初次診斷為癌症的人數共有 79,818 人，每 10 萬人口粗發生率為 346.39，每 10 萬人口年齡標準化. 1.

(21) 發生率為 276.46(國健局,2009)。因為台灣近年來老化人口增加，加上飲食習慣的改變，包括：油脂的攝取量增加、食物中纖維質的攝取減少，這種西化的飲食習慣不但使得心臟血管疾病增加，同樣也造成大腸直腸癌患者的人數持續增加。與國外的研究結果類似，大腸直腸癌較容易發生在年紀較大者，從癌症年度報告中可以得知，台灣大腸直腸癌的罹患率從 40~44 歲開始隨年紀增加而增加，到 70~74 歲這個年齡層達到高峰期（附錄 Table 1），並且男性比例較女性高，近年增加趨勢更明顯（附錄 Fig. 1）。除了年齡與性別之外，研究指出罹患大腸直腸癌的危險因素還包括：具有大腸直腸癌的家族病史(Hassan, Laghi, Zullo, Iafrate, & Morini, 2008)，在一般的大腸直腸癌病例中，大約有 15~20%有大腸直腸癌家族病史(Newcomb, Taylor, & Trentham-Dietz, 1999; Potter, 1999)，而其父母、兄弟姐妹、或子女被診斷出為大腸癌的機率也是那些沒有大腸癌家族病史的兩倍(Johns & Houlston, 2001; Newcomb, Savu, Phipps, Coghill, & Yasui, 2012)。與大腸癌相關的危險因子除了年齡超過 50 歲、有家族病史以外，還包含：KRAS 與 p53 突變、飲食因子（飲食中包含大量的動物性飽合脂肪或是過少量的纖維和鈣）、缺乏運動、肥胖、抽菸和過度飲酒。研究也指出，飲酒、較高的身體質量指數（body mass index，. 2.

(22) BMI）（> or =24.0 kg/m2）以及有家族病史的族群對於大腸癌來說是獨立危險因素(Y. S. Wei et al., 2009)。可能引起大腸癌的原因還包括慢性發炎與細菌或病毒感染所造成的長期腸道發炎併發症，如：克隆氏結腸炎（Crohn’s colitis）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis）(Delaunoit, Limburg, Goldberg, Lymp, & Loftus, 2006; Grady & Carethers, 2008)都容易導致大腸直腸癌的發生(M'Koma, Moses, & Adunyah, 2011)，而結腸和直腸組織發炎的時間越長，病人的風險也越大(Erdman & Poutahidis, 2010a, 2010b; Houghton et al., 2010; Schmidt, Bielecki, Felber, & Stallmach, 2010)。研究指出幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）也許是經由病原體的致病因素導致大腸癌(Burnett-Hartman, Newcomb, & Potter, 2008)；另一種類的 S. bovis（a nonenterococcal group D Streptococcus 鏈球菌的亞型）被發現和有 S. bovis 菌血症的大腸直腸癌患者有明顯相關性 (Corredoira et al., 2005; Ruoff, Miller, Garner, Ferraro, & Calderwood, 1989)；JCV（John Cunningham virus），一種多瘤病毒，其致癌屬性為導致染色體不穩定，並常見於結腸癌 (Burnett-Hartman, et al., 2008) (Niv, Goel, & Boland, 2005)；HPV （Human papillomavirus）是雙股 DNA 病毒，並非每種類型的 HPV 病毒都與癌症相關，目前有 16 型，18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、68、73 和 82 型，被列為“高風險”的致癌感染類型。而 HPV 則可能是藉由 HPV 使得 p53 失去活性導致大腸癌的發生 3.

(23) (Braakhuis et al., 2004; Burnett-Hartman, et al., 2008)。近年研究也發現與大腸直腸癌各期相關的分子機制，同樣也是引發大腸直腸癌發生的關鍵，包含腫瘤壞死因子 tumour necrosis factor （TNF-）、APC 突變、KRAS 變異、上皮細胞生長因子接受器 epidermal growth factor receptors（EGFR）、SMAD4 變異和 p53 突變等等，都會造成大腸直腸發生慢性發炎、腺瘤進而轉移侵襲的分子（附錄 Fig. 2）(Pan, Lai, Wu, & Ho, 2011b)。. 二、大腸直腸癌的治療目前大腸直腸癌的治療以手術切除方式為主，而手術方式的選擇則依腫瘤位置與侵犯程度而定，臨床分期多採用 TNM 系統，T 是腫瘤深度、N 是淋巴轉移數目、M 是遠處轉移。通常是利用超音波瞭解腫瘤深度與淋巴轉移數目的情況(Garcia-Aguilar et al., 2002; Schaffzin & Wong, 2004)。手術可分為兩大類：局部性切除與根治性切除，其中包含低位前切除術（Low Anterior Resection）、腹部會陰合併切除術（Abdominoperineal Resection）、骨盆腔臟器合併摘除術（Pelvic Exenterization）、迴腸或結腸造口術（Ileostomy or Colostomy）與近年更成熟的腹腔鏡手術（Laparosocopy Surgery）等(Christian et al., 2005; "A comparison of laparoscopically assisted and open colectomy for colon cancer," 2004; Guillou et al., 2005; Lacy et al., 2002)。因腫瘤可能會復 4.

(24) 發，使得手術切除一直無法達到最有效及徹底的治療，所以在治療時會以化學藥物輔佐當作治療方法(Sagar, Sales, Taanman, Dijk, & Winslet, 2010b)。但是，化學藥物常會造成病人的身體傷害。化學藥物使用與放射線治療產生的副作用易造成病人身體的不適，並且許多的化學藥物常缺乏選擇性。為解決治療效果及病人不適的狀況，研究高效能、低毒性的抗癌藥物已成為研究的首要議題。目前大腸直腸癌在臨床管理上的生物標記是以錯配修復蛋白（mismatch repair protein）檢測和 KRAS 和 BRAF 突變分析，這類分析可做為之後臨床應用驗證的生物標誌物(Kelley, Wang, & Venook, 2011)。. 三、大腸直腸癌之臨床用藥及其副作用與治療困境在治療方法上除了手術選擇以外，還有化學治療與放射線治療。特別是在治療大腸直腸癌晚期或轉移性疾病，化學治療與放射線治療發揮了重要的作用。放射線治療無論在手術前後都被證實可以減少術後的局部再發生的機率(P. Das et al., 2006; Kapiteijn et al., 2001; Quirke, Durdey, Dixon, & Williams, 1986)。搭配不同的化學製劑，例如鉑金類藥物 oxaliplatin 或 5-fluorouracil（5-FU）單獨或合併使用 levamisole 或 leucovorin（LV）已經被應用於人體與細胞試驗上，藉. 5.

(25) 由這些化學製劑的應用進而改善大腸癌的治療結果。研究結果顯示 5-FU 與 levamisole 的化學治療可以降低第三期大腸癌手術切除後 41%的再發率與 33%的死亡率(Moertel et al., 1990)。研究指出 oxaliplatin 與 5-FU 及 LV 合併治療第二期或第三期的大腸直腸癌患者能夠改善其存活率(Andre et al., 2009)。而 capecitabine 加上 oxaliplatin 比 5-FU 和 folinic 對於大腸直腸癌第三期的病患來說是較佳的輔助治療方式(Haller et al., 2011)。雖然治療方式能夠對於腫瘤有所控制，但是癌細胞轉移和復發的問題仍然存在(Sagar, Sales, Taanman, Dijk, & Winslet, 2010a)。. 6.

(26) 第二節 Triazinone triepoxide TATT 與臨床抗癌用藥 cisplatin、carboplatin和oxaliplatin 一、Triazinone triepoxide TATT Triazinone triepoxide TATT，分子量為297.26 g/mol，化學結構式 C15H15N3O6。Triazinone triepoxide TATT是由 triepoxide teroxirone， [1,3,5-triazine-2,4,6（1H,3H,5H）tri-one-1,3,5-tris（oxiranylmethylHa）; Henkel compound]這個結構修飾而得的化合物。1984年被合成作為抗腫瘤藥物試驗之用(Fowler, Grous, Price, & Matthews, 1984)，因此我們將triazinone triepoxide TATT以MTT assay進行篩選，發現triazinone triepoxide TATT是對於人類大腸直腸癌細胞（HT-29）可能具有毒殺或是抑制癌細胞生長作用的化合物之一（Fig. 1）。. 7.

(27) 103 compounds (From NTNU). MTT assay 6 days. 10 compounds (IC50 < 10 M). Fig. 1 Triazinone triepoxide TATT is one of 103 compounds exhibiting IC50 < 10 M by MTT assay.. 8.

(28) 二、鉑金屬藥物鉑金屬藥物包含 cisplatin、carboplatin、oxaliplatin 等多種衍生物（附錄 Fig. 3）。Cisplatin、carboplatin、oxaliplatin 等鉑金屬抗癌藥物通常用於治療肺癌、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、頭/頸部的癌症及泌尿生殖系統癌症(McWhinney, Goldberg, & McLeod, 2009)。Cisplatin 在 1978 年被 FDA 核准使用於治療卵巢癌和睾丸癌(Higby, Wallace, Albert, & Holland, 1974)。Carboplatin 則在 1989 年 3 月被 FDA 核准使用於治療卵巢癌。在 2002 年，第三代鉑金屬藥物 oxaliplatin 被 FDA 核准使用於治療轉移性的結直腸癌(FDA. Oncology Tools, 2007)。許多研究都專注在 cisplatin 和與其相似的鉑金屬化合物的分子作用機制。鉑金屬化合物引發細胞死亡的早期步驟可以分成四個階段：第一個階段為細胞主動和被動的吸收；第二個階段為鉑類複合體的活化；第三個階段則與核酸結合形成不同的 Pt-DNA 加合物；到了第四階段會導致 DNA 損傷(Todd & Lippard, 2009) (D. Wang & Lippard, 2005b)。這些以鉑金屬為基礎的的藥物療效往往因為產生嚴重毒性成為治療上很大的風險。常見毒性包括神經毒性，神經毒性可導致急性和慢性衰弱。另外，大腸癌的患者會停止使用 oxaliplatin 治療常是因為治療所引起的周圍神經病變比腫瘤的進展更可能損害病人的利益。臨床試驗指出鉑金屬藥物神經毒性的嚴重程度，通常是 cisplatin > oxaliplatin. 9.

(29) >> carboplatin (Zhu, Raber, & Eriksson, 2005)。（ㄧ）、Cisplatin 臨床抗癌用藥 cisplatin（cis-diaminedichloroplatinum，CDDP）是一以鉑金屬為中心的化合物，可插入 DNA 結構而阻斷 DNA 的複製及轉錄，並可透過影響細胞內的自由基（ROS）含量而抑制癌細胞生長，進而使腫瘤細胞凋亡，達到抗癌功效。臨床實驗結果顯示，cisplatin 具有抑制多種惡性腫瘤生長的功能，它可單獨使用或配合其它抗癌藥物如 vinblastine、bleomycin 等一起使用。Cisplatin 之腎毒性是眾所周知且可以事前預測的，研究報告發現接受 cisplatin 治療的病人約 76%會產生低血鎂的現象，且此現象可持續至治療後數月或數年之久。最常見的副作用為噁心、嘔吐，此副作用顯著且較嚴重，用藥後 1~4 小時就開始有噁心與嘔吐現象，可持續 48~72 小時，治療後各種程度的噁心、厭食會持續到一星期之久。其次為食物不振、白血球減少、貧血、耳毒性、末梢神經病變及高尿酸血症等。（二）、Carboplatin Carboplatin 是 cisplatin 經由結構修飾後之第二代含鉑金屬的抗癌藥物，在臨床治療上，病人會隨著藥物治療時間與劑量的增加，逐漸產生 thrombocytopoenia、leucopoenia、貧血和嘔吐現象。藥理研究表明，從尿中排出大多數的鉑的量，可能與其藥物中鉑在體內保留程度. 10.

(30) 有關，可能與腎功能損害及骨髓抑制的風險增加相關(Calvert et al., 1982)。Carboplatin 的快速腎清除率可能與比 cisplatin 有較小腎毒性有關 (H. Sharma et al., 1983) 。（三）、Oxaliplatin Oxaliplatin是cisplatin經由結構修飾後之第三代含鉑金屬抗癌藥物。對於大腸直腸癌的治療來說，oxaliplatin對於治療結果有明顯的改善，並且對於大腸直腸癌第二期或第三期進行手術後或轉移性疾病來說，都是一個重要的選擇(Oxaliplatin: a review of approved Uses, 2012)。但是週邊神經毒性的累積是oxaliplatin的主要副作用 (Meriggi & Zaniboni, 2010)。. 11.

(31) 第三節鉑金屬藥物的抗癌機轉一、Cisplatin Cisplatin是多種有效的抗癌藥物之ㄧ，也是第一代鉑類化合物，其細胞毒殺作用機制包括激活水合作用，其中兩個氯原子的離去基被水或是氫氧配位基取代，並且水分子會被蛋白質及核酸中的氮及硫原子所置換，而置換的位置是比較傾向在DNA腺嘌呤和鳥嘌呤的N-7位置上(Y. Jung & Lippard, 2007)。Cisplatin會黏附在DNA上，並和雙股間氫鍵結合導致DNA的彎曲（附錄Fig. 4），cisplatin也會抑制與DNA 複製和轉錄相關的關鍵酵素(D. Wang & Lippard, 2005a)。此外，與 DNA損傷及辨識、細胞週期的停滯與計畫性細胞死亡（細胞凋亡）相關的多種訊息傳遞路徑也都會被活化(Brabec & Kasparkova, 2005)。. 二、Carboplatin Carboplatin是第二代鉑類化合物，它與細胞內DNA所形成的加合物型式與cisplatin相同，但是產生的結構外觀是不同的(Blommaert et al., 1995)。Carboplatin主要形成的加合物是順式的[Pt(NH3)2(dG)2]，佔了36%。它也可能產生1,3-d(GpNpG)而形成股外交叉鍵結。另外小部分會產生1,2-d(GpG)，佔了30%。1,2-d(ApG)佔了16%，剩下更少的為股間交叉鍵結佔了3–4%及單一功能性的加合物(Lepre, 12.

(32) Strothkamp, & Lippard, 1987; Todd & Lippard, 2009)。. 三、Oxaliplatin Oxaliplatin 是第三代鉑金屬化合物，含有草酸結構的水解配體。它跟 cisplatin 一樣，對於 DNA 來說是烷化劑，所以 oxaliplatin 能引起三種形式的交叉鍵結，包括 DNA 雙股間、雙股外和 DNA 與蛋白質間的鍵結(Alcindor & Beauger, 2011)。而結構中的鉑酸鹽主要與相鄰的兩個鳥嘌呤或兩個相鄰的鳥嘌呤和腺嘌呤間形成鍵結（附錄 Fig. 5） (Cvitkovic, 1998; Todd & Lippard, 2009)，使得 DNA 產生錯誤配對，引起 DNA 損傷，導致 DNA 停止合成，抑制 RNA 的合成，誘發的免疫反應的刺激物，造成癌細胞發生凋亡 (Alcindor & Beauger, 2011)。. 13.

(33) 第四節薑黃素及其抗癌機轉薑黃素（curcumin；附錄Fig. 6）是一種植物化學成分，被稱為 diferuloylmethane（C21H20O6），此活性成分來自於薑黃根莖，主要包括薑黃素（curcumin）、去甲氧基薑黃素（demethoxy curcumin）、去二甲氧基薑黃素（bidemethoxy curcumin）這三種有效成份，其中以薑黃素的生理活性最強。薑黃是短莖多年生植物，它的莖大概可以長到約100厘米的高度，葉片呈彎曲狀，根莖為橢圓形、卵形或圓柱形（附錄Fig. 6）。薑黃自然生長在熱帶國家，印度很常見，特別是東南亞地區，常作為著色和許多南亞美食調味料添加劑(Chauhan, 2002)。追溯到5000年前，在“阿育吠陀醫學”這個印度古老的祖傳秘方的治療系統中，薑黃已被用來作為「中草藥中的阿斯匹靈」和「中草藥中的可體松」，藉以減輕炎症感染和自身免疫性疾病等相關的身體不適 (R. A. Sharma, Gescher, & Steward, 2005) 。在過去，薑黃素已被廣泛應用於多種疾病的治療，包括炎症性疾病、胃腸功能紊亂與癌症(B. B. Aggarwal, Sundaram, Malani, & Ichikawa, 2007)。研究指出薑黃素具有抗氧化、抗毒素、抗發炎、癌症化學預防及做為化療藥物的潛力(Campbell & Collett, 2005; Oyama et al., 1998; Pal et al., 2005; Pal et al., 2001; R. A. Sharma, et al., 2005(Campbell & Collett, 2005; Oyama et al., 1998; Pal et al., 2005. 14.

(34) (Campbell & Collett, 2005; Oyama et al., 1998; Pal et al., 2005; Pal et al., 2001; R. A. Sharma, et al., 2005; Sugimoto et al., 2002)。而且薑黃素有較強的多目標化學預防作用與化學治療活性(Goel, Kunnumakkara, & Aggarwal, 2008)。動物研究發現，薑黃素可預防囓齒動物在小腸、結腸和口腔黏膜腫瘤的發生(Collett, Robson, Mathers, & Campbell, 2001; N. Li et al., 2002; Mahmoud et al., 2000)。在體外的細胞試驗中，給予薑黃素能夠有效抑制癌細胞增生以及造成細胞凋亡，包括前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和大腸直腸癌(B. B. Aggarwal et al., 2007; Chen, Xu, & Johnson, 2006; Watson et al., 2010)。薑黃素在許多大腸直腸癌研究中發現，可透過許多不同的分子機制去抑制癌細胞增生，包括薑黃素抑制COX-2和MMP-2的表現調控，抑制p-65進而抑制大腸直腸癌細胞侵襲(Su, Chen, Lin, Wu, & Chung, 2006a)。也有研究指出薑黃素可經由抑制內皮生長因子接受器的表現和調節Akt/mTOR的訊息傳遞路徑來抑制大腸直腸癌細胞的生長(Chen, et al., 2006; Johnson et al., 2009b)，還有研究發現在兒童與成人的腸道發炎併發症中，薑黃素可以抑制p-38的活化、IL-1的生成與P-3的表現(Epstein, Docena, MacDonald, & Sanderson, 2010)。. 15.

(35) 第五節合併使用薑黃素與鉑金屬藥物之抗癌機轉研究發現有些存在於植物中的植化素（phytochemicals），像是薑黃素，可以明顯抑制Aurora-A的表現(H. S. Liu, Ke, Cheng, Huang, & Su, 2011)，並且有研究指出抑制Aurora-A能夠增強由cisplatin所誘發的細胞凋亡(Briassouli, Chan, Savage, Reis-Filho, & Linardopoulos, 2007)。研究中也發現將薑黃素合併5-FU和oxaliplatin（FOLFOX）處理大腸直腸癌細胞HCT-116和HT-29，可明顯抑制癌細胞生長，並且在單純只有薑黃素或薑黃素合併5-FU或FOLFOX處理下也比未處理的控制組的抑制效果好。薑黃素合併5-FU和oxaliplatin抑制癌細胞生長效果其部分原因來自於降低會促進癌細胞增生、抑制細胞凋亡與抑制誘發轉移的EGFR以及胰島素類生長因子接受器insulin like-growth factor (IGF)-1-receptor（IGF-1R）(A. Das, Chak, & Cooper, 2006; Neugut, Lautenbach, Abi-Rached, & Forde, 1996; Patel et al., 2008; Shitoh et al., 2002)。. 16.

(36) 第六節計劃性細胞死亡計劃性細胞死亡（programmed cell death）會發生在器官的發育過程中，並且在細胞動態平衡中佔相當重要的部分(Jaattela, 2004)。細胞死亡分為三種類型，分別被稱為：細胞凋亡（第一型）（apoptosis）、細胞自噬（第二型）（autophagy）、細胞壞死（第三型）（necrosis） (Lockshin & Zakeri, 2004)。ㄧ、細胞自噬細胞自噬（或稱自食）在1963年被Christian de Duve提出，是受損細胞內的組成份藉由溶酶體產生降解的過程 (De Duve, 1963; De Duve & Wattiaux, 1966)。就生理而言，它的作用是保持細胞胞器的生物合成、蛋白質的合成以及兩者消長之間的平衡 (J. Lee, Giordano, & Zhang, 2012)。細胞自噬就是ㄧ般熟知的第二型計劃性細胞死亡，在細胞質中會出現很大的細胞自噬空泡。細胞自噬也可發生在胚胎形成的過程中，但不同於第一型計劃性細胞死亡(Schweichel & Merker, 1973)。細胞自噬是一個在營養素缺乏情況下，為維持正常細胞活動與生存而存在的大量蛋白質降解系統(Mizushima, Yamamoto, Matsui, Yoshimori, & Ohsumi, 2004)。發生細胞自噬死亡的第一步會產生雙層膜空泡（即為自噬體），其衍生自內質網的ㄧ部分(Dunn, 1990)或來自細胞質脂質池(Fengsrud et al., 1995)。細胞自噬體會與溶酶體進行融 17.

(37) 合，隨即受到溶酶體水解蛋白酶作用而降解。儘管最近很多關於細胞自噬的基本分子機制被研究，但是許多細節仍然不清楚。但就目前而言，細胞自噬的種類可分成三類：巨細胞自噬（macroautophagy）、微細胞自噬（microautophagy）以及需要輔助物質的細胞自噬（chaperone-mediated autophagy）。這三類細胞自噬模式的差別，在於和溶酶體融合的方式和生理功能(Klionsky, 2007)。巨細胞自噬主要調控代謝機制，藉由少數的細胞自噬相關基因（autophagy-related genes，Atgs）對細胞質內物質的碎片形成雙層膜空泡，和溶酶體融合的過程進行高度調控(Mizushima, Levine, Cuervo, & Klionsky, 2008)。細胞自噬相關基因在酵母中最早被發現，在細胞自噬體的形成與調控扮演了關鍵角色。令人感到訝異的是，這些基因多數與人類疾病有關聯，特別是癌症(J. Huang & Klionsky, 2007)。在癌細胞中，細胞自噬是一種生理機制，藉由回收大分子再利用的方式作為暫時得以生存的手段(Moreau, Luo, & Rubinsztein, 2010)。相反的，如果細胞的壓力引起連續性或過度性細胞自噬，則引發細胞死亡(Liang & Jung, 2010)。目前有幾種細胞自噬對於細胞存活或死亡較為相關的重要途徑，包含了mammalian target of rapamycin（mTOR）相關路徑、與Beclin 1之相互作用及p53的訊息傳遞路徑。這些訊息傳遞路徑，可能是細胞自噬與癌症之間複雜的相互作用(S. Y. Wang, Yu, Zhang, & Liu, 2011)。. 18.

(38) 二、細胞自噬相關路徑 (一)、mTOR相關路徑 mTOR，一種絲胺酸/酥胺酸激酶，是哺乳類類動物中雷帕黴素（rapamycin）的標的，在癌細胞中主要提供細胞自噬的負調控。在哺乳類動物中，mTOR的形式有兩種，其中只有mammalian target of rapamycin complex 1（mTORC1）對於rapamycin是敏感的，因此在細胞自噬上mTORC1較為被注意(Loewith et al., 2002)。有三個與 mTORC1相關的訊息傳遞路徑，包括（1）第一型phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）-Akt、（2）Ras-proto-oncogene serine/threonineprotein kinase（Raf-1）-Mitogen-activated protein kinase kinase（MEK1/2） extracellular signal-regulated kinases（ERK1/2）、（3）liver kinase B1 （LKB1）-AMP-activated protein kinase（AMPK）。第一型 PI3K-Akt-mTOR與生長因子及細胞膜上的接受器結合後，可誘導 PI3K，活化下游的Akt(Gingras, Raught, & Sonenberg, 2001; Schmelzle & Hall, 2000)；Ras是一種致癌基因，可活化第一型PI3K路徑(Furuta, Hidaka, Ogata, Yokota, & Kamata, 2004)與Raf-1這兩條路徑能夠透過活化mTORC1而抑制細胞走向細胞自噬；第三條路徑liver kinase B1 （LKB1）-AMP-activated protein kinase（AMPK）則為抑制mTORC1(C. H. Jung, Ro, Cao, Otto, & Kim, 2010)。. 19.

(39) (二)、Beclin 1相關路徑 Beclin 1在哺乳動物中同源於Atg6，能在細胞自噬一開始的時候藉由與第三型PI3K結合，增強細胞自噬。Beclin 1是透過介質的辨識方法抑制腫瘤增生(Kang, Zeh, Lotze, & Tang, 2011)。UV radiation resistance-associated gene（UVRAG）是一種蛋白質，主要是正面調控 Beclin 1的介質，能與Beclin 1相互作用並明顯增強第三型PI3K的活性，藉此促進細胞自噬。透過Beclin 1/PI3KIII的複合體，UVRAG的表現能夠促使細胞自噬進而抑制腫瘤增生(Furuya, Yu, Byfield, Pattingre, & Levine, 2005)。此外，也有幾個負面調控Beclin 1的介質，包括一些抗凋亡蛋白Bcl-2家族，如Bcl-2和Bcl-XL都含有四個Bcl-2同源的結構區域（BH）。Bcl-2透過與具有一個BH3的結構區域的Beclin 1的相互作用來抑制細胞自噬(He & Levine, 2010; J. Huang & Klionsky, 2007)。所以Bcl-2藉此抑制Beclin 1與第三型PI3K的相互作用，進而降低第三型PI3K的活性，使得細胞自噬受到抑制(Pattingre et al., 2005)。 Beclin 1增強細胞自噬與抑制腫瘤增生可能透過正面或負面介質對於 Beclin 1複合體的影響而有所不同，因此在癌症治療中扮演重大的角色(S. Y. Wang, et al., 2011)。 (三)、p53相關路徑 p53是抑癌基因，調控細胞自噬。有趣的是p53在細胞自噬中可能. 20.

(40) 造成細胞存活或死亡(Ryan, 2011)。在細胞核中，p53促進細胞自噬主要藉由促進多種細胞自噬介質的密碼子基因表現，這些細胞自噬的介質包括了AMPK、DAPK-1、damage-regulated autophagy modulator （DRAM）、pro-apoptotic Bcl-2 proteins，如Bad、Bax、BNIP3和 PUMA、Sestrin1/2與TSC2(Morselli et al., 2009)。DRAM是一種抑癌基因，在DNA損傷情況下它會受到p53控制而引發細胞自噬。另外其它 p53的標的Sestrin1/2的表現通常也會誘發DNA的損傷與氧化壓力。這些都是mTORC1的負面調控子，而這些功能的執行都要透過AMPK和 TSC2的活化(Crighton et al., 2006)。不同於細胞核中的p53，細胞質中的p53藉由活化mTORC1而抑制細胞自噬，並且不受核內轉錄因子角色所控制。此外，增強細胞自噬可能有利於p53缺失的癌細胞在營養缺乏與缺氧的條件下存活，因此也許對於癌細胞來說細胞自噬扮演著一個保護細胞的角色(Tasdemir et al., 2008)。因此，在細胞自噬中p53 訊息路徑因為p53在細胞的位置不同，而產生了不明確的行為。. 三、細胞壞死細胞壞死通常是屬於不受控制的細胞死亡，主要的特徵是ATP的流失、細胞膜因滲透壓改變而腫脹、導致細胞通透性改變而膨脹或破裂，最後使細胞內的分解酵素和細胞激素等胞器內物質釋放到細胞. 21.

(41) 外，產生蛋白質沉澱進而引起周圍組織發炎反應(Lockshin & Zakeri, 2004)。. 四、細胞凋亡細胞凋亡是生物體內計畫性細胞死亡的主要形式，在正常發育、組織動態平衡和免疫中，細胞凋亡扮演了關鍵的角色(Strasser, Cory, & Adams, 2011)。細胞凋亡最早由John Kerr在1972年提出，主要是細胞本身接受到一連串死亡訊息的刺激，藉由調控基因的表現，進而分解DNA與細胞質中之蛋白質所致之計畫性、程序性的死亡過程，因此也被稱為計劃性的細胞死亡(programmed cell death, PCD)(Kerr, Wyllie, & Currie, 1972)。當細胞凋亡出錯時會造成病理狀態，其中包括癌症、自體免疫、感染與退化性疾病等(Strasser, et al., 2011)。因此細胞凋亡可能出現在健康與疾病的狀態中，像是愛滋病（AIDS, acquired immune deficiency syndrome）、退化性神經疾病（neurodegenerative disorders）、胰島素依賴型糖尿病（insulin-dependent diabetes）、C型肝炎感染、心肌梗塞（myocardial infarct）和動脈粥狀硬化（atherosclerosis）等，都是細胞凋亡比例增加所引起，而自體免疫疾病與癌症則為細胞凋亡比例降低的結果 (Ulukaya, Acilan, & Yilmaz, 2011)。當然也有經由刺激誘導所產生的. 22.

(42) 細胞凋亡，刺激包括抗癌藥物的作用、生長因子的喪失和輻射影響等。細胞凋亡發生的分子機制（附錄Fig. 7）已經透過廣泛的研究而逐步被了解(R. Kim, 2005)。（ㄧ）、細胞凋亡特徵細胞凋亡在形態上的特徵是核染色質凝集（chromatin condensation）、細胞核和細胞質皺縮（shrinkage of the nucleus and cytoplasm），接著細胞破裂（fragmentation of the cell），形成凋亡小體（apoptotic bodies），其會被鄰近的吞噬細胞（phagocytic cells）吸收，進而被溶酶體（lysosomes）所消化(Kerr, et al., 1972)。另外，粒線體膜電位的改變、胞漿鈣離子（Ca2+）的濃度增加或核酸內切酶的活化都會導致DNA片段化，DNA裂解成大約為200 bps的片段，在凝膠電泳可觀察到梯狀現象（ladder pattern）(Taylor, Cullen, & Martin, 2008)。因此，細胞凋亡和細胞壞死（necrosis）不同之處在於細胞進入凋亡時，由於細胞膜是完整的，因此細胞所含的有毒物質無法釋放到細胞外，導致這些凋亡小體很快會被吞噬細胞（phagocytes）吸收，也不會影響鄰近的細胞產生凋亡，所以也不會產生發炎反應(Taylor, et al., 2008)。因化療作用所造成的細胞凋亡發現與腫瘤體積減少有關，但化療作用對於細胞凋亡所導致的阻抗亦造成抗藥性(R. Kim et al., 2003; R. Kim et al., 2002; Pommier, Sordet, Antony, Hayward, & Kohn,. 23.

(43) 2004)。藉由內外在路徑的活化可以明確肯定化療藥物的抗腫瘤效用 (R. Kim, 2005)。（二）、細胞凋亡路徑器是纖維組織母細胞相關抗原（fibroblast associated antigen，Fas；也被稱為APO-1或CD95）和腫瘤壞死因子受體（tumour necrosis factor receptor，TNFR），兩者都屬於腫瘤壞死因子受體家族成員，並都含有一個細胞質內的死亡結構區域（cytosolic death domain，DD），會與同源的與Fas相關死亡結構區域（Fas-associated death domain，FADD）互相作用並結合，使死亡訊息接受器結合形成誘導死亡訊息的複合體（death inducing signalling complex，DISC）(Ashkenazi & Dixit, 1998; Kischkel et al., 1995)。此外，FADD還有另一個同源的死亡作用器結構區域（DED，death effector domain），可接合細胞內的pro-caspase 8。當DISC在細胞質端形成，引發pro-caspase 8會自我活化，切割成活化態的caspase 8 （initiator caspases，稱為引發死亡訊息的caspase），活化的caspase 8 會水解激活下游的caspase 3及7（effector caspases，也稱為執行死亡訊息的caspase），進而引起細胞凋亡(Bodmer et al., 2000; Scaffidi et al., 1998)。另外caspase 8也能夠切只含BH3結構的蛋白質Bid，被切斷的 Bid（tBid）會移至粒線體並且誘發細胞色素c（cytochrome c）釋出，引起caspase 9和caspase 3的活化。死亡訊息的複合體DISC可被含有. 24.

(44) DED的蛋白質負回饋調控，如：Flice-inhibitory protein（FLIP）含有兩個DED，透過FLIP會抑制DISC signalling中caspase 8的活化，使下游的caspase無法被活化，並抑制細胞凋亡(J. Li & Yuan, 2008)。也有研究指出，FLIP不僅會抑制死亡訊息複合體，也會促進NF-B和Erk 的活化(Kataoka et al., 2000)。 1. 外在路徑（extrinsic apoptotic pathway）外在路徑又稱死亡接受器訊息路徑（death receptor signaling pathway）。引發細胞凋亡的外在路徑起因於位在細胞膜上接受器（receptor）與細胞外的配體（ligand）的結合。典型的死亡訊息接受藉由內外在路徑的活化可以明確肯定化療藥物的抗腫瘤作用(R. Kim, 2005)。 2. 內在路徑（intrinsic apoptotic pathway）內在路徑又稱為粒線體途徑（mitochondria pathway）。啟動細胞凋亡的內在路徑通常是因為細胞內外的壓力所引起，包括氧化壓力、輻射和導致細胞毒性的藥物治療(Ghavami et al., 2008; Ghavami et al., 2004)。與外在路徑不同的是，內在路徑透過粒線體上的Bcl-2家族蛋白質調控細胞死亡。Bcl-2家族中，促凋亡的蛋白如Bax/Bak，附著在粒線體膜上，使cytochrome c從粒線體內膜釋放至細胞質中，進而引發細胞凋亡(R. Kim, 2005; R. Kim, Inoue, & Toge, 2004; Tsunemitsu et. 25.

(45) al., 2004)。抗凋亡的蛋白如Bcl-2、BCL-XL，則防止cytochrome c從粒線體內膜釋放，並抑制Bax和Bak的活化(Tanabe et al., 2003; Tolcher et al., 2004)。而只有BH3結構的蛋白質，如Bid和Bim，藉由誘發這些蛋白質的同源分子聚合（homo-oligomerisation），增進Bax或Bak的促凋亡功能。其中促進細胞凋亡的路徑又細分為兩種，分別為caspase dependent pathway和caspase independent pathway。（1）Caspase dependent pathway 當凋亡訊號產生，會造成粒線體內膜的膜電位下降並將凋亡因子釋放到細胞質，其中最重要的是cytochrome c，cytochrome c在dATP 或ATP協助之下，會與細胞凋亡活化因子（apoptotic protease activating factor，Apaf-1）結合並進一步和pro-caspase 9形成多蛋白的複合體，稱之為凋亡體（apoptosome），其包含數個單位的Apaf-1和其它分子 (Ghobrial, Witzig, & Adjei, 2005; Ly, Grubb, & Lawen, 2003)。接著 apoptosome促進caspase 9活化，並啟動下游的caspase活化，如caspase 3、caspase 6和caspase 7等，進而切割poly-ADP-ribose polymerase （PARP），導致細胞凋亡(Gupta, 2003)。（2）Caspase independent mitochondria pathway 當凋亡訊號產生，造成粒線體外膜的通透性改變，使得由粒線體內膜的ATP合成酶、電子轉運鏈（electron transport chain）、腺嘌呤核. 26.

(46) 苷酸轉運者（adenine nucleotide translocator，ANT）及位於粒線體外膜的電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel）所組成粒線體通透性轉運孔洞（mitochondria permeability transition pore， MPTP）打開，粒線體會將與凋亡相關蛋白質釋放至細胞質，如 cytochrome c、第二粒線體caspase的活化者（Smac/DIABLO）(Du, Fang, Li, Li, & Wang, 2000)、HtrA2/Omi(W. Li et al., 2002)、endonuclease G、誘發凋亡因子（apoptosis-inducing factor，AIF）(Lorenzo, Susin, Penninger, & Kroemer, 1999)等。Smac/DIABLO和HtrA2/Omi使得抑制凋亡蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）(van Loo et al., 2002) 的作用失效，進而間接使caspase活化，而endonuclease G與AIF則是藉由進入細胞核使DNA產生損傷與凝縮，造成細胞凋亡的發生(Debatin, 2004)。（三）、與細胞凋亡相關蛋白質 1. Caspases 人體中caspases在分類上因功能、原結構區域大小（size of their pro-domain）或裂解特異性而有所不同。第一群的caspase與發炎反應有關，包含了細胞激素的成熟，如caspase 1、4和5。這些蛋白酶主要與對抗病原體的先天免疫系統有關。第二群的caspase才是與細胞凋亡調控有關，這些caspase又可以分成兩種：起始（initiator）的caspases. 27.

(47) （caspase 2、8、9和10）與作用（effector）caspases（caspase 3、6和7）。作用的caspases在細胞內以二聚體的形式並藉由起始酵素來引發活性，進而產生蛋白水解過程(Olsson & Zhivotovsky, 2011)。（1）Caspase 8 Caspase 8對於細胞凋亡外在路徑是相當必須的，而caspase 8由 TNF-家族成員所活化(Ghavami, Eshraghi, et al., 2009)。Pro-caspase 8 能夠經由與Fas相關死亡結構區域的調適蛋白FADD結合。Pro-caspase 8在死亡誘發訊號複合體DISC的複合體中，以二聚或三聚體的分子形式存在，交互裂解並活化。活化的caspase 8會使下游的caspase 3、7 和Bid裂解而活化，進而引起細胞凋亡(Carrington et al., 2006; Stennicke et al., 1998; Yan & Shi, 2005)。另外活化的caspase 8也能活化 NF-B和調節淋巴細胞的增生。調控caspase 8活性程度的關鍵蛋白是 c-FLIPL，它是一個和caspase 8相似但缺乏caspase的活性的分子 (Micheau et al., 2002; Tschopp, Irmler, & Thome, 1998)。當c-FLIPL缺乏時，二聚或三聚體分子形式的pro-caspase 8會使pro-caspase 8的活性更大，作用更加完全。在高濃度c-FLIPL存在時，pro-caspase 8的增加被抑制，因此c-FLIPL的裂解能夠確保caspase 8的基本活性，使得NF-B 被活化(Chang et al., 2002; Irmler et al., 1997)。（2）Caspase 10. 28.

(48) Caspase 10和caspase 8一樣具有兩個DED的結構區域，這個結構區域能夠吸引相同的死亡誘發訊號複合體DISC並受到死亡訊息接受器的活化。它同樣能夠使Bid裂解並啟動與粒線體相關的細胞凋亡路徑，所以有文獻猜測caspase 10與caspase 8有部分功能是重疊的 (Degterev, Boyce, & Yuan, 2003; Kischkel et al., 2001; Milhas et al., 2005)。（3）Caspase 2 Caepase 2是第二個被發現的caspase蛋白質，它包含了一個 caspase組成的結構區域（caspase recruitment domains，CARD）以及組成多種蛋白質的複合體PIDDosome2。藉由CARD與具有接受死亡訊息的結構區域與RIP相關ICH-1/ECD3同源性蛋白質（RIP associated ICH-1/ECD3 homologous protein with a death domain，RAIDD）的結構區域做結合(Read, Baliga, Ekert, Vaux, & Kumar, 2002)。Caspase 2的獨特點是除了可以在細胞質內被發現，也能夠在細胞核與高爾基氏體內被發現(Baliga et al., 2003; Mancini et al., 2000; O'Reilly et al., 2002)。而 caspase 2就是藉由切斷並活化Bid而成為粒線體的上游，這個角色對於DNA損傷所引發之細胞凋亡是相當重要的(Bonzon, Bouchier-Hayes, Pagliari, Green, & Newmeyer, 2006; Guo, Srinivasula, Druilhe, Fernandes-Alnemri, & Alnemri, 2002; Robertson et al., 2004)。. 29.

(49) （4）Caspase 9 Caspase 9在凋亡小體的形成扮演了起始的角色，在過去12年已被廣泛研究。一旦當粒線體路徑被活化，細胞色素c會從粒線體中被釋放，並吸引細胞凋亡活化因子Apaf-1(Rodriguez & Lazebnik, 1999; Zou, Henzel, Liu, Lutschg, & Wang, 1997)。在dATP或ATP的存在下，細胞色素c和Apaf-1會聚集形成凋亡體（apoptosome）。而pro-caspase 9隨後就會透過本身的caspase-activation recruitment domain（CARD）結構區域與Apaf1做結合，藉由這樣的交互作用使另一個pro-caspase 9 也被活化(P. Li et al., 1997; Qin et al., 1999)。然後這個接上斷裂caspase 9且被活化的凋亡體則進一步去活化下游的caspase 3。（5）Caspase 3與Caspase 7 細胞凋亡的過程是ㄧ連串caspases的活化。內在路徑的上游啟動者為caspase 9，而外在路徑則為caspase 8。但是無論是內在或是外在路徑，最後都會引起caspase 3的活化。ㄧ旦caspase 3裂解成活化態時，會使得蛋白酶激活去氧核糖核酸的抑制子（inhibitor of the caspase-activated deoxyribonuclease）受到裂解，也因此成為細胞凋亡的主要原因(Ghobrial, et al., 2005; Wong, 2011)。Caspase 7是caspase 3 的下游，也是屬於執行細胞凋亡的核心蛋白質之一，而且caspase 7與 caspase 3都會受到細胞凋亡抑制子（inhibitors of apoptosis，IAPs）的. 30.

(50) 家族成員，如：survivin和XIAP等所抑制(Deveraux & Reed, 1999)。 2. 非Caspase蛋白（1）Bcl-2家族 Bcl-2家族蛋白可依他們促凋亡和抗凋亡的作用及其所擁有的 Bcl-2同源結構區域分為三群(Schinzel, Kaufmann, & Borner, 2004; Youle & Strasser, 2008)。抗凋亡Bcl-2類蛋白質，如: Bcl-2、Bcl-XL、 Bcl-w、Mcl-1和A1/Bfl-1，促凋亡Bcl-2類蛋白質，如: Bax、Bak和 Bok/Mtd均具有四個BH的結構區域(Kvansakul et al., 2008)。另外還有一類則只有BH3結構的促凋亡蛋白質，如: Bid、Bim/Bod、Bad、Bmf、 Bik/Nbk、Blk、Noxa、Puma/Bbc3、及Hrk/DP5。正因為他們僅有BH3 這個簡短的結構區域而作為他們的命名區別。BH3蛋白參與並傳遞死亡訊息至其它的Bcl-2家族成員，進而產生作用(Martinou & Youle, 2011)。透過BH3結構區域，這些蛋白質除了與抗凋亡蛋白質交互作用，抑制它們的功能外，也可能會直接和多重結構區域蛋白質交互作用去刺激他們的活性，如:Bax或Bak(Giam, Huang, & Bouillet, 2008)。 a. Bcl-2 Bcl-2為這個家族中重要的成員，Bcl-2大多在細胞質中，分子量為26 kDa。Bcl-2蛋白質能同時抑制細胞凋亡與細胞增生(Burlacu, 2003)。在凋亡細胞中，這個分子量為26 kDa的產物會被切成22kDa. 31.

(51) 的片段，而這個片段則是抑制Bcl-2的抗凋亡作用的關鍵部分。最近，另外一個分子量約為19 kDa大小的Bcl-2被發現同時存在於細胞質和細胞核中。然而在快速增生的細胞中，這個19 kDa大小的Bcl-2在核內含量很高，因此猜測在細胞增生作用中，這個片段的Bcl-2可能具有功用(Hoetelmans, Van de Velde, & Van Dierendonck, 2003)。 b. Bcl-w Bcl-w是Bcl-2家族中抗凋亡蛋白成員之一，與人類某些癌症具有相關性，如:胃癌與結直腸腺癌(Hockenbery, 2010)。Bcl-w位於核套內的胞漿膜、粒線體或內質網(O'Reilly et al., 2001)。Bcl-w的潛在作用是保護成年細胞因損壞或壓力所產生的凋亡。在腸道中，即使Bcl-w表現是有缺失的，但是並不會因為這樣而影響正常發展。研究發現當 Bcl-w - / -小鼠受到臨床藥物5-FU或γ-射線輻照處理，小鼠腸道中增加了六倍的細胞凋亡(Pritchard et al., 2000)。 c. Bid 促凋亡蛋白Bid可誘發細胞色素c釋出至細胞質中。Bid受到活化產生裂解，形成具有羧基端的片段，其分子量約為15 kDa，稱為t-Bid， (Green, 2000; H. Li, Zhu, Xu, & Yuan, 1998)。而t-Bid進一步影響粒線體內的凋亡蛋白，利用其BH3結構與更多其它Bcl-2家族中促凋亡蛋白的交互作用，並促進其活化，使他們從粒線體轉至細胞質中，造成更. 32.

(52) 多細胞色素c的釋放。另一方面，Bid的羧基端的片段也會活化Bak所引起的細胞色素c釋出，增強細胞凋亡的發生(Ulukaya, et al., 2011; M. C. Wei et al., 2000)。 d. Bax 促凋亡蛋白Bax位於細胞質中(Nechushtan, Smith, Hsu, & Youle, 1999)，受到細胞凋亡的刺激後，會與粒線體膜結合，引起孔洞的產生，形成粒線體膜電位陰離子依賴性通道。選擇性離子滲透性的損失，造成細胞色素c和AIF從粒線體釋出至細胞質(Shimizu, Ide, Yanagida, & Tsujimoto, 2000; Shimizu, Narita, & Tsujimoto, 1999)，進而啟動一連串的細胞凋亡訊息。（2）非Bcl-2蛋白家族 a. Cytochrome c 氧化磷酸化帶動了電子進入電子傳遞鏈造成粒線體的膜電位差（mitochondrial membrane potential，ΔΨm）。位於粒線體內膜上的細胞色素c，在電子傳遞鏈最後一個步驟中扮演了重要的角色，將電子從複合體三號（bc1 complex）傳至複合體四號（cytochrome c oxidase， CcO）。除了在電子傳遞鏈中，cytochrome c在參與細胞凋亡的過程中也是相當重要的。cytochrome c從粒線體釋出後透過dATP或ATP的協助，與Apaf-1及pro-caspase 9結合形成凋亡體，使得caspase 9被活化. 33.

(53) 進而引發下游caspase 3的活化，啟動細胞凋亡路徑(X. Wang, 2001)。 b. Smac/DIABLO Smac/DIABLO是一個分子量為29 kDa大小的粒線體蛋白質，它也是許多粒線體內對抗抑制凋亡蛋白的其中之一。當細胞凋亡被引發時，Smac/DIABLO就會形成23 kDa大小的成熟蛋白質並轉至細胞質 (van Loo, et al., 2002)。Smac/DIABLO能和許多抑制凋亡蛋白產生結合，包含XIAP、c-IAP1、c-IAP2、survivin和桿狀病毒蛋白baculoviral Op-IAP等(Du, et al., 2000; Verhagen et al., 2000)。透過將抑制凋亡蛋白的移除，進而刺激caspase的活化(Du, et al., 2000)，包括caspase 3、 caspase 7及caspase 9的活化，引發細胞凋亡的產生。 c. Endonuclease G Endonuclease G（endoG）是一種粒線體特異性的核酸內切酶，當細胞凋亡發生時，endoG會從粒線體轉移至細胞核內。EndoG會切斷細胞核內染色質的DNA，並進入核小體，所以與caspase的作用機轉不相同。因此endoG代表一個來自粒線體但不同於caspase所引發細胞凋亡的路徑(L. Y. Li, Luo, & Wang, 2001)。研究發現，endoG從粒線體釋放後引發細胞凋亡過程中也誘發TNF-產生(van Loo et al., 2001)。 d. AIF. 34.

(54) 凋亡誘導因子（AIF）是不依賴 caspase 而能參與刺激細胞凋亡的蛋白質之一，是一種可溶性蛋白，也是一種粒線體氧化還原酵素(Joza et al., 2001)。AIF 存在於線粒體的間隙中，從粒線體轉移到細胞核，參與大規模的 DNA 片段化和染色質濃縮(Susin et al., 2000; Susin et al., 1999)。除了在細胞核內產生的反應以外，高度表現的 AIF 也會誘發與細胞凋亡相關的特點，包括：粒線體跨膜電位的消耗或改變細胞膜上的磷脂暴露(Susin, et al., 1999)。 e. NF-B NF-B 是一種複雜的轉錄因子，有五種次單位（p50、p52、RelA、 RelB、c-Rel）。激酶複合體（IKK IKK和 IKK/NEMO）會藉由抑制下游的 IB 而促使 NF-B 的活化，當這個複合體的抑制次單位（IBα, IBβ, or IBε）受到磷酸化後引發蛋白酶體降解，接著以 RelA、RelC 及 p50 所組成的同質或異質二元體的 NF-B 就會在核內逐漸增加並啟動轉錄作用(Demchenko et al., 2010; Ghosh & Karin, 2002; Hayden & Ghosh, 2008)。化學治療藥物刺激癌細胞時，NF-B 也會被活化，可能與藥物引發細胞自噬而導致死亡具有相關性 (Baldwin, 2001)。在疾病中 NF-B 常是異常的活化，例如在腫瘤生長過程中。NF-B 會與 TNF-或與其它家族成員連結，透過 NF-B 的活化，TNF-會誘發多種基因的表現，而這些基因與被侵襲或轉移的. 35.

(55) 組織有關(T. L. Lee et al., 2008; Paul, Gohil, & Bhutani, 2006)。研究得知 NF-B 的活化能抑制細胞凋亡，此情況相似於增強腫瘤增生，因此，可透過抑制異常活躍的 NF-B 來達到預防腫瘤增生(Perkins, 2000, 2004)，同時 NF-B 在化學藥物產生阻抗性上可能扮演重要的角色(du Plessis-Stoman, du Preez, & van de Venter, 2011)。. 36.