藥物配製

Triazinone triepoxide TATT分子量為297.26 g/mol。以微量天平（準 確至0.0001 mg）取約1.2 mg triazinone triepoxide TATT，以10l DMSO 溶解，以含10% FBS的DMEM配製成不同濃度triazinone triepoxide TATT。利用不同濃度的triazinone triepoxide TATT（0、2、4、8、10 μM）

分別處理HT-29細胞，於不同的時間（0、6、12、24、48 hr）將細胞 收取後進行實驗。

Cisplatin、carboplatin和oxaliplatin分子量分別為300、371.3和 397.29 g/mol。以微量天平（準確至0.0001 mg）取0.0001~0.0003 g的 cisplatin、carboplatin和oxaliplatin，以10 μl 0.9% NaCl溶解，以含10%

FBS的DMEM配製成4 M之cisplatin、carboplatin和oxaliplatin。利用 配製好的4 M之cisplatin、carboplatin和oxaliplatin分別處理HT-29與 HUVEC細胞24小時後，將細胞收取後進行實驗。

薑黃素（curcumin）的分子量為368.5 g/mol。以DMSO溶解，先 配製較高濃度（30 mM）的庫存液（stock solution）。配製好的藥物 存放於-20℃，在兩個星期內需使用完畢。實驗時將庫存液（30 mM）

以DMEM稀釋1000倍（30 μM）。

三、細胞存活率分析（cell viability analysis）

原理：主要是利用活細胞粒線體中琥珀酸去氫酶（succinate dehydrogenase）將黃色的 3-(4,5-dimethyl

thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide（MTT）tetrazolium 還原 成藍紫色之產物 MTT formazan。MTT 只能測存活的細胞，加入之 DMSO 會將還原態藍紫色的 MTT-formazan 結晶溶解，再以 ELISA reader 測量吸光值（波長 590 nm）。

將 HT-29 細胞與 HUVEC 細胞以 1.2×10³ cells/100 μl /well 的細胞 密度種於 96-well microplate，放至 5% CO₂、37℃恆溫培養箱中培養 24 小時，將上清液吸掉，給予不同濃度（0、6.25、12.5、25、50 μM）

的 triazinone triepoxide TATT、cisplatin、carboplatin 與 oxaliplatin（溶 在含 10% FBS 的 DMEM）培養 24 小時。將培養液吸乾淨後，避光 加入 MTT 試劑 100 μl /well，置入 5% CO₂、37℃恆溫培養箱中培養 4 小時，把 MTT 試劑吸掉，再加入 DMSO 50 μl /well，等待 5 分鐘，

以 ELISA reader 讀取 OD 590 nm 之吸光值。當活的細胞越多，藍紫 色的結晶會越深，代表細胞存活率越高，因此，可做為細胞存活率的 指標。

MTT 試劑配製

將 5 mg 的 MTT 粉末溶在 1 ml 的 PBS，分裝在褐色的微量離心管，

避光進行儲存，放至-20℃冰箱冷藏，需用鋁箔紙包覆離心管。使用 時需要以 PBS 進行 10 倍稀釋。

MTT powder 5 mg

1X PBS Buffer 加至 1 ml

四、西方墨點法（western blot analysis）

（ㄧ）、蛋白質之製備

將 HT-29 細胞以 1×10⁶cells/10 ml/dish 的細胞密度種於 10 cm dish，以含有 1%FBS 的 DMEM 培養 24 小時，給予溶於含有 10% FBS 的 DMEM 之化合物處理，再置於 5% CO₂、37℃恆溫培養箱中培養。

將細胞刮下並收至離心管，於 4℃下以 3000 rpm 離心 10 分鐘，去除 上清液，加入 0.5 ml PBS 清洗細胞 3 次，於室溫下以 3000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液，加入 Lysis buffer 放冰上，每隔五分鐘 vortex 一次，重覆 6 次共 30 分鐘後，於 4℃下以 12000 rpm 離心 5 分鐘，

收集細胞上清液，將上清液置於-80 度冰箱備用。

Lysis buffer 配製

M-PER^@ Mammalian Protein Extraction Reagent 250 μl phosphate inhibitor 1 μl

protease inhibitor 1 μl

（二）、蛋白質定量

使用 Bio-Rad protein assay kit 進行蛋白質含量之分析，以牛血清 蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準品並製作標準曲線，利 用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在波長 590 nm 下測吸光值，並求 出趨勢線方程式及 r²值（r²值需> 0.95）。將蛋白質標準品稀釋成濃度 0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mg/ml，分別取 10 μl 後，加入 490 μl Bradford 染劑（需 5 倍稀釋）混合均勻，每 well 加入 100 μl 染劑（四重複）

呈色，反應 10 分鐘。

蛋白質標準品配製

10 mg/ml BSA（l） 1X PBS Buffer（l） 最終濃度（mg/ml）

0 150 0

3.8 146.2 0.25

7.5 142.5 0.5

11 139 0.75

15 135 1

19 131 1.25

5X 稀釋 Protein assay dye 配製

Bradford 染劑 2 ml

D.D. water 8 ml

（三）、樣品蛋白質的定量

取出3 μl 蛋白質樣品與 27 μl 的 PBS 稀釋 10 倍，於 96 well plate 中，每 well 加入稀釋好的 10 μl 蛋白質樣品，再加入 490 μl 染劑（四 重複）呈色。根據標準曲線的回歸公式，計算細胞蛋白質樣品液中蛋 白質含量。

（四）、聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE eletrophoresis）

1. 下層膠（separating gel）：根據蛋白質分子量大小與各蛋白質之間 分離效果，選擇適當濃度之膠體，故 acrylamide/Bis 最終濃度可為 12 和 15%。

separating gel 配製

Separation gel（10 ml） 12% 15%

Acrylamide（30 %） 4 ml 5 ml Tris（1.5 M，pH 8.8） 2.5 ml 2.5 ml SDS（10%） 0.1 ml 0.1 ml APS（10%） 0.1 ml 0.1 ml TEMED 0.004 ml 0.004 ml M.Q. water 3.3 ml 2.3 ml

2. 上層膠（stacking gel）：膠體中 acrylamide/Bis 最終濃度為 5%。

stacking gel 配製

stacking gel（3 ml） 5%

Acrylamide（30 %） 0.5 ml Tris（1.0 M，pH 6.8） 0.38 ml SDS（10%） 0.03 ml APS（10%） 0.03 ml

TEMED 0.003 ml

M.Q. water 2.1 ml

3. 蛋白質樣品製備：取適當之細胞蛋白質樣品液與 6 倍的 Loading dye 混和後置於 100℃水中煮沸 10 分鐘，置於冰上備用。

6X SDS gel loading dye 配製

2-mercaptoethanol 0.6 ml

SDS 1 g

Bromphenol Blue 1.2 mg 100% glycerol 3 ml

M.Q. water 2.9 ml

將以上成分混合溶解後，取 1 ml 出來再加入 1 M 的 DTT 1.5ml

4. 電泳條件：於電泳槽中倒入 1X running buffer（以水將 10X 稀釋成 1X running buffer），再將等量樣品與標準分子量 marker 分別注入各樣 品槽中，固定電流為 60 mA，固定電壓為 100 V，電泳時間約為 2 小 時。

10X running buffer 配製：

Glycine 187.7 g 過）、濾紙，類似三明治夾層，置於轉印緩衝液（1X transfer buffer），

使蛋白質由膠片（負極）往 PVDF 膜（正極）方向移動。固定電流為 400 mA，轉印時間為 1.5 至 2 小時。

1X transfer buffer 配製：

Tris-base 3.03 g

Glycine 14.4 g

100% methanol 200 ml

M.Q. water 加 800 ml 並調 pH 值 pH8.1-8.4

6. 免疫螢光之偵測：PVDF 膜置於含 5% non-fat milk 之 TBST 緩衝 液中，於室溫進行 blocking 2 小時。經 blocking 過的 PVDF 膜以 TBST 清洗 5 分鐘，重複 3~5 次。加入稀釋之一級抗體，於 4℃下反應過夜

（至少 16 小時），以 TBST 清洗 5 分鐘，重複 3~5 次。再加入適當稀 釋之二級抗體，並於室溫下反應 1 小時後，以 TBST 清洗 5 分鐘，重 複 3~5 次，最後將 HRP substrate 與 HRP substrate peroxidase soluation 以 1：1 比例混合，使樣本發出螢光後，利用 X-ray film 進行感光成 像，並利用 Image J 影像軟體（USA National Institutes of Health，NIH）

進行分析。

TBST buffer 配製：

NaCl 43.875 g

Tris-base 12.114 g

Tween 20 5 ml

M.Q. water 加至 5 liters 並調 pH 值 7.4

五、細胞週期分析（cell cycle analysis）

原理：Propidium iodide（PI）是一種核酸染劑，會與細胞結合並 嵌入細胞核內的 DNA 與 RNA，為了避免干擾 PI 對 DNA 的測定，因 此 PI 染劑會加入 100 μg/ml RNase A。正常人體細胞的染色體，在 G0/G1 期具有 2 套染色體（2N），G2/M 期具有 4 套染色體（4N），

而 S 期介於 G0/G1 與 G2/M 期。當產生細胞凋亡時，有 DNA 片段化

情況發生，使染色體含量少於 2N，在 G0/G1 期前有 Sub-G1 的波峰 出現，因此，利用流式細胞儀可以得知細胞的染色體數目，觀察細胞 週期的變化，也可當作細胞凋亡的指標。

將 HT-29 細胞以 1×10⁵ cells/2 ml/ well 的細胞密度種於 6 well plate，以含有 1%FBS 的 DMEM 培養 24 小時後，將 1%FBS 的 DMEM 吸掉並給予溶於含 10% FBS 的 DMEM 的不同濃度的藥物處理，於 5% CO2、37℃恆溫培養箱中培養 12、24 小時或以相同濃度（4 μM）

的 triazinone triepoxide TATT、cisplatin、carboplatin 和 oxaliplatin 分別 單獨處理或合併30 μM curcumin 處理後，將培養液收集至離心管，

加入 1 ml PBS 清洗細胞 2 次，以 500 μl 胰蛋白酶作用 3~5 分鐘，輕 拍培養盤使細胞懸浮，再加入500 μl DMEM 中和反應，混合後吸至 同濃度的離心管中，以 3000 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液，輕拍離 心管將細胞打散。加入冰的 PBS 清洗兩次，於室溫下以 3000 rpm 離 心 5 分鐘，倒掉上清液。最後，一邊 vortex（轉速調整 2~3）一邊加 入 1 ml 的 75%酒精固定細胞，並增加細胞膜通透性，以便 PI 染劑可 以進入細胞核，靜置於 4℃冰箱下放置隔夜。

上機前取出固定好的細胞，以 3000 rpm 離心 5 分鐘，將酒精倒 掉，輕拍離心管分散細胞。加入冰的 PBS 清洗兩次，於室溫下以 3000 rpm 離心 5 分鐘，移除上清液，每個樣品加入 20 μl PI（2 μg/ml）、5 μl

RNase A（100 μg/ml）、800 μl PBS，避光反應 30 分鐘，細胞懸浮液 以篩網過濾至 Falcon tube，以流式細胞儀於 FL2-H 進行分析，激發 PI 釋放紅色螢光的波長為 530 nm，每管收集 10000 顆細胞，數據以 WinMDI 2.8 軟體（Windows Multiple Ducument Interface Flow

Cytometry Application）進行處理分析。

PI 染劑配製：

PI（2 μg/ml） 20 μl RNase A（100 μg/ml） 5 μl

1X PBS 800 μl

六、細胞早期凋亡分析（cell apoptosis analysis）

原理：在正常細胞中，磷脂絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）只 分佈在細胞膜脂質雙層的內側。在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂絲 氨酸由脂膜內側往外側翻。而 Annexin V 是一種分子量為 35～36 kDa 的 Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂絲氨酸有高度親和力，可與暴露 的磷脂絲氨酸結合，因此 Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏 指標之一。

將HT-29細胞以1×10⁵ cells/2 ml/ well的細胞密度種於6 well

plate，以含有1%FBS的DMEM培養24小時，將1%FBS的DMEM吸掉，

給予溶於含10% FBS的DMEM的不同濃度的藥物處理，置入5%

CO₂、37℃恆溫培養箱中培養12、24小時或以相同濃度（4 μM）的

triazinone triepoxide TATT、cisplatin、carboplatin和oxaliplatin分別單獨 處理或合併30 μM curcumin處理後，將培養液收集至離心管，加入1 ml PBS清洗細胞2次，以500 μl胰蛋白酶作用3~5分鐘，輕拍培養盤使細 胞懸浮，再加入500 μl DMEM中和反應，混合後吸至同濃度的離心管 中，以3000 rpm離心10分鐘，倒掉上清液，輕拍離心管將細胞打散，

加入1 ml PBS 使細胞懸浮，以3000 rpm離心10分鐘，移除上清液，

將每一所需藥物作用時間的細胞計數為 1 × 10⁵ cells/ml，加入1X binding buffer，各取100l懸浮液分裝至5 ml 離心管，以annexin V-FITC染色。每一個懸浮液各自加入annexin V-FITC（0.5g/ml），

於避光環境下作用15分鐘，加入400l的1X binding buffer終止作用，

以流式細胞儀於FL1-H進行分析，以488 nm波長激發annexin V-FITC 釋放綠色螢光，每管收集10000顆細胞。數據最後則以WinMDI 2.8軟 體（Windows Multiple Ducument Interface Flow Cytometry Application）

進行分析。

1X binding buffer配製：

HEPES 2.38 g

NaCl 8.18 g

CaCl2 0.28 g

M.Q. water 加至1 liter並調pH值7.4

七、共軛聚焦顯微鏡（confocal microscope）觀察粒線體電位（△Ψm）

的改變

在 6 well plate 中置入無菌的蓋玻片，進行 UV 照射過夜，再將 HT-29 細胞以 1×10⁵ cells/2 ml/well 的細胞密度種於 6 well plate，以含 有 1%FBS 的 DMEM 培養 24 小時，將 1%FBS 的 DMEM 吸掉，給予 溶於含 10% FBS 的 DMEM 的單獨 4 μM 的 triazinone triepoxide TATT、10 μM 的 cyclosporin A 與事先以 10 μM 的 cyclosporin A 預處 理 4 小時候再加入 4 μM 的 triazinone triepoxide TATT 的兩者合併處 理，置入 5% CO2、37℃恆溫培養箱中培養 24 小時，加入 rhodamine 123

（5 mΜ）並在 37℃避光的環境下反應 30 分鐘，再以 PBS 將蓋玻片 清洗三次，以 100%冰的 methanol 固定細胞 15 分鐘，經 PBS 清洗三 次後將蓋玻片固定在加附 poly-L-Lysine 的載玻片上，以 Leica TCSNT 雷射掃描共軛影像系統和 Leica DMRBE 顯微鏡 Leica 630 fluotar objective 鏡頭擷取影像。在波長 488 nm、功率 25 Mw 的雷射激發後，

在電腦上即時以斷層掃描方式擷取細胞的中央部位影像。

八、收取細胞質蛋白質（cytosolic protein extraction）與粒線體蛋白 質（mitochondrial protein extraction）

將 HT-29 細胞以 1×10⁶ cells/10 ml 的細胞密度種於 10 cm dish，

以含有 1%FBS 的 DMEM 培養 24 小時後，將 1%FBS 的 DMEM 吸掉，

給予溶於含 10% FBS 的 DMEM 的藥物處理不同時間，在冰上刮取細

胞，移至 50 ml 的離心管中，在 4℃的環境中以 3000 rpm 進行離心 10 分鐘，將上清液吸掉，加入 1 ml 的 1X PBS 沖洗，將細胞液移至 微量離心管中，以 3000 rpm 離心 10 分鐘，將上清液吸掉，加入 4℃

的TSE buffer 300 μl（每 10 盤 10 cm dish 的細胞量加入 300 μl 的 TSE buffer），輕輕的 pipetting 至細胞打散，再以 26 G x1/2”的針與 24 Gx1”

（0.55x25 mm）的針頭，對細胞液進行抽吸 5 分鐘，再以 4℃ 3000 rpm 離心 15 分鐘，取上清液移至新的微量離心管，再進行 4℃ 3000 rpm 離 心 15 分鐘，取上清液移至新的微量離心管，最後進行 4℃ 14000rpm 離心 30 分鐘，上清液為 cytosolic protein 的懸浮液，沉澱物為

mitochondrial pellet。mitochondrial 的 pellet 加入與 pellet 等量的 Lysis buffer（M-PER^@ Mammalian Protein Extraction Reagent：phosphate inhibitor：protease inhibitor＝250 μl：1 μl：1 μl）在 4℃的環境下等待

mitochondrial pellet。mitochondrial 的 pellet 加入與 pellet 等量的 Lysis buffer（M-PER^@ Mammalian Protein Extraction Reagent：phosphate inhibitor：protease inhibitor＝250 μl：1 μl：1 μl）在 4℃的環境下等待

在文檔中 植化素薑黃素藉由引發細胞凋亡促進新穎及傳統鉑金屬大腸直腸癌化療藥物之敏感性 (頁 73-0)