西方墨點法（western blot analysis）

（ㄧ）、蛋白質之製備

將 HT-29 細胞以 1×10⁶cells/10 ml/dish 的細胞密度種於 10 cm dish，以含有 1%FBS 的 DMEM 培養 24 小時，給予溶於含有 10% FBS 的 DMEM 之化合物處理，再置於 5% CO₂、37℃恆溫培養箱中培養。

將細胞刮下並收至離心管，於 4℃下以 3000 rpm 離心 10 分鐘，去除 上清液，加入 0.5 ml PBS 清洗細胞 3 次，於室溫下以 3000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液，加入 Lysis buffer 放冰上，每隔五分鐘 vortex 一次，重覆 6 次共 30 分鐘後，於 4℃下以 12000 rpm 離心 5 分鐘，

收集細胞上清液，將上清液置於-80 度冰箱備用。

Lysis buffer 配製

M-PER^@ Mammalian Protein Extraction Reagent 250 μl phosphate inhibitor 1 μl

protease inhibitor 1 μl

（二）、蛋白質定量

使用 Bio-Rad protein assay kit 進行蛋白質含量之分析，以牛血清 蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準品並製作標準曲線，利 用酵素免疫分析儀（ELISA reader）在波長 590 nm 下測吸光值，並求 出趨勢線方程式及 r²值（r²值需> 0.95）。將蛋白質標準品稀釋成濃度 0、0.25、0.5、0.75、1、1.25 mg/ml，分別取 10 μl 後，加入 490 μl Bradford 染劑（需 5 倍稀釋）混合均勻，每 well 加入 100 μl 染劑（四重複）

呈色，反應 10 分鐘。

蛋白質標準品配製

10 mg/ml BSA（l） 1X PBS Buffer（l） 最終濃度（mg/ml）

0 150 0

3.8 146.2 0.25

7.5 142.5 0.5

11 139 0.75

15 135 1

19 131 1.25

5X 稀釋 Protein assay dye 配製

Bradford 染劑 2 ml

D.D. water 8 ml

（三）、樣品蛋白質的定量

取出3 μl 蛋白質樣品與 27 μl 的 PBS 稀釋 10 倍，於 96 well plate 中，每 well 加入稀釋好的 10 μl 蛋白質樣品，再加入 490 μl 染劑（四 重複）呈色。根據標準曲線的回歸公式，計算細胞蛋白質樣品液中蛋 白質含量。

（四）、聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE eletrophoresis）

1. 下層膠（separating gel）：根據蛋白質分子量大小與各蛋白質之間 分離效果，選擇適當濃度之膠體，故 acrylamide/Bis 最終濃度可為 12 和 15%。

separating gel 配製

Separation gel（10 ml） 12% 15%

Acrylamide（30 %） 4 ml 5 ml Tris（1.5 M，pH 8.8） 2.5 ml 2.5 ml SDS（10%） 0.1 ml 0.1 ml APS（10%） 0.1 ml 0.1 ml TEMED 0.004 ml 0.004 ml M.Q. water 3.3 ml 2.3 ml

2. 上層膠（stacking gel）：膠體中 acrylamide/Bis 最終濃度為 5%。

stacking gel 配製

stacking gel（3 ml） 5%

Acrylamide（30 %） 0.5 ml Tris（1.0 M，pH 6.8） 0.38 ml SDS（10%） 0.03 ml APS（10%） 0.03 ml

TEMED 0.003 ml

M.Q. water 2.1 ml

3. 蛋白質樣品製備：取適當之細胞蛋白質樣品液與 6 倍的 Loading dye 混和後置於 100℃水中煮沸 10 分鐘，置於冰上備用。

6X SDS gel loading dye 配製

2-mercaptoethanol 0.6 ml

SDS 1 g

Bromphenol Blue 1.2 mg 100% glycerol 3 ml

M.Q. water 2.9 ml

將以上成分混合溶解後，取 1 ml 出來再加入 1 M 的 DTT 1.5ml

4. 電泳條件：於電泳槽中倒入 1X running buffer（以水將 10X 稀釋成 1X running buffer），再將等量樣品與標準分子量 marker 分別注入各樣 品槽中，固定電流為 60 mA，固定電壓為 100 V，電泳時間約為 2 小 時。

10X running buffer 配製：

Glycine 187.7 g 過）、濾紙，類似三明治夾層，置於轉印緩衝液（1X transfer buffer），

使蛋白質由膠片（負極）往 PVDF 膜（正極）方向移動。固定電流為 400 mA，轉印時間為 1.5 至 2 小時。

1X transfer buffer 配製：

Tris-base 3.03 g

Glycine 14.4 g

100% methanol 200 ml

M.Q. water 加 800 ml 並調 pH 值 pH8.1-8.4

6. 免疫螢光之偵測：PVDF 膜置於含 5% non-fat milk 之 TBST 緩衝 液中，於室溫進行 blocking 2 小時。經 blocking 過的 PVDF 膜以 TBST 清洗 5 分鐘，重複 3~5 次。加入稀釋之一級抗體，於 4℃下反應過夜

（至少 16 小時），以 TBST 清洗 5 分鐘，重複 3~5 次。再加入適當稀 釋之二級抗體，並於室溫下反應 1 小時後，以 TBST 清洗 5 分鐘，重 複 3~5 次，最後將 HRP substrate 與 HRP substrate peroxidase soluation 以 1：1 比例混合，使樣本發出螢光後，利用 X-ray film 進行感光成 像，並利用 Image J 影像軟體（USA National Institutes of Health，NIH）

進行分析。

TBST buffer 配製：

NaCl 43.875 g

Tris-base 12.114 g

Tween 20 5 ml

M.Q. water 加至 5 liters 並調 pH 值 7.4