本研究摘取之肌肉組織依其部位特性區分為腓腸肌 (快縮肌) 和比目魚肌 (慢縮 肌) ，以 SqRT-PCR 方法分析老鼠於訓練和攝食處理後之阻力運動表現基因 (骨骼肌肌 力正負調節基因) 指標。依分析類型及方法分述如下：
一、 分析類型
1. 基本指標：體重 (body mass, BM)、相對負重運動表現 (犧牲前負重測試成績/
體重)。
2. 肌力發展因子基因指標：
(1) 肌力發展正向調節基因：IGF-1Ea、MGF (2) 肌力發展負向調節基因：MSTN
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基因 Primer sequences
GADPH Reagent (Thermo Fisher Scientific) 至微量離心管中，均勻混合後置於室溫下 5 分鐘，使 TRIzol Reagent 與樣品充分作用。
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(5) 將樣品在 4℃下以 12,000 × g 的速度，離心 10 分鐘後，於管底得到一小塊白 色沈澱物，移除上清液後，加入 75%的乙醇 (ethanol) 後，以 Vortex 劇烈搖 晃清洗沉澱物。
(6) 將樣品在 4℃下以 7,500 × g 的速度，離心 5 分鐘。去除酒精後，在 4℃下以 13,000 × g 的速度，離心 1 分鐘，以微量吸管吸除剩餘的酒精，再短暫風乾 沉澱物。
(7) 最後加入 30-50 μl DEPC-H2O，在 55-60℃下放置 10 分鐘溶解 RNA 後。取 2 μl 的 RNA，以 Tris-HCl 稀釋至 200 μl，再使用分光光度計 (BioPhotometer, Eppendorf, Hamburg, Germany) 定量。
2. RNA 電泳
(1) 依分光光度計定量之濃度，每個樣品取 3 μg RNA 至 1.5 ml 微量離心管，加 入 10 μl glycoxal reaction mixture 後，混合均勻，短暫離心後，置於 55℃ 乾 浴槽 20-30 分鐘，再將樣品置於冰上 2 分鐘。
(2) 短暫離心將微量離心管壁之水氣離下後，加入 RNA loading dye 混合均勻。
(3) 製備瓊脂凝膠膠體：稱取 1.2 g 瓊脂粉，加入 40 ml BTPE buffer，以微波爐加 熱溶解，每片膠體 17 個孔洞。
(4) 於裝有 1X BTPE buffer 的電泳槽中，以 135V 電壓 20 分鐘進行瓊脂電泳分析。
(5) 將膠體置於 BIO Doc-It Imaging System (UVP, Upland, CA, USA) 箱中觀察 RNA 的品質及定量。
3.以 DNase 處理去除 RNA 樣品中的 DNA 殘留
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(1) 於 1.5 ml 微量離心管中，依下列配方進行反應：1 μl 的 TURBO DNase (2U/μl)、5 μl 的 10X TURBO DNase Buffer (44-X) μl 的 DEPC- H2O、X μl (5 μg RNA) 的 RNA sample，反應總體積為 50 μl。
(2) 配好後置於 37℃，反應一小時；再加入 5 μl 的 DNase Inactivation Reagent，
於室溫中反應 2 分鐘。
(3) 再以 10,000 × g 離心 1.5 分鐘後，吸取 45 μl 上清液置乾淨的 1.5 ml 微量離 心管內。
4.合成第一股 cDNA
(1) 本實驗以 Invitrogen™公司所生產的 SuperScriptTM III First-Strand Synthesis Syatem For RT-PCR kit (Cat. No:18080-051) (Waltham, MA, USA) 進行。首先 先進行 RNA 變性(RNA Denature)，將下列成份：8 l 的 DNA-free total RNA 1 μl 的 50 μM random hexamer、1 μl 的 10mM dNTP mix，一起加入 200 μl 微量離 心管中，於 65℃加熱 5 分鐘。
(2) 加熱後的離心管，置於冰上至少一分鐘。短暫離心後，加入 10 μl cDNA Synthesis Mix 到微量離心管內，37℃反應 50℃反應 50 分鐘。cDNA Synthesis Mix 中包含 2 μl 的 10× RT Buffer 4 μl 的 25mM MgCl2、 2 μl 的 0.1M DTT、
1 μl 的 RNaseOUT™ (40U/μl) 、1 μl 的 SuperScript™ III RT (200U/μl)。控制 組則是以 DEPC-H2O 代替 SuperScript™ III RT。
(3) 最後於 85℃加熱 5 分鐘終止反應後，將微量離心管置於冰上冷卻。短暫離心 後，加入 1 μl RNaseH (2U/μl)，於 37℃培養箱反應 20 分鐘後，加入 DEPC-HO 稀釋至 200 μl，用以接下來的 PCR 試驗。
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5.聚合酶連鎖反應 (PCR)
(1) 將合成好的 cDNA 稀釋到 100 ng/μl 之後備用。接著使用 cDNA 為模版，將下 列的反應物加入微量離心管中：4 μl 的 2.5 mM dNTP、10 μM 的 Forward 和 Reverse Primer 各 1 μl、2.5 μl 10X Taq Buffer、0.25 μl YEA Taq Polymerase，
最後加水至 25 μl，再進行聚合酶連鎖反應。
(2) 在 95℃，加熱 2 分鐘，接著 95℃加熱 30 秒，再來在 50℃加熱 1 分鐘，之後 於 72℃，加熱 1 分 30 秒，並重覆步驟 2 到 4，進行 40 循環，並在 72℃，加 熱 15 分鐘，最後將產物保存於 4℃。
6. PCR 產物瓊脂凝膠電泳分析
(1) 將 PCR 產物加入 4 μl 的 6X DNA loading dye，震盪後短暫離心。吸取 15 μl 含有 DNA loading dye 的 PCR 產物注入 2% 瓊脂凝膠凹槽中。
(2) 於含有 1×TAE bufeer 的電泳槽中，以 100 Volt 的電壓進行電泳反應 20 分鐘。
最後將膠體置於 BIO Doc-It Imaging System 分析記錄基因產物條帶。
7. 基因表現量分析
以繪圖軟體 Image J (National Institutes of Health, Maryland, USA) 計算產物 條帶光點區之解析度作為其表現量，因樣本數較多，同一膠體分三排跑電 泳，故以每排之 1 Kb DNA ladder 亮度為基準做標準化 (如圖 6)。將中測和 後測各個基因表現量數據分別除以前測 (base line)表現量平均數，作為中測 和後測基因表現倍數。
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圖 6. 大鼠 6 週實驗後各組骨骼肌基因表現電泳圖 (以腓腸肌 IGF-1Ea 基因為例)