第貳章 文獻探討
第一節 運動和基因表現之相關文獻
一、 基因的複製 (replication)、轉錄 (transcription) 和轉譯 (translation)
核酸 (nucleic acid) 包含了核醣核酸 (ribonucleic acid, RNA) 和去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA)，是組成基因的重要物質。DNA 或 RNA 是核苷酸的聚合 物，主要以一個五碳醣 (ribose) 為中心，連接鹼基 (base) 形成核苷，再加上磷酸基 (phosphate) 所組成 (如圖 2)。鹼基有嘌呤 (purine) 及嘧啶 (pyrimidine) 兩大類，嘌呤 包含腺嘌呤 (adenine, A ) 及鳥糞嘌呤 (guanine, G ) ; 嘧啶則包含胸腺嘧啶 (thymine, T )、胞嘧啶 (cytosine, C ) 及尿嘧啶 (uracil, U ) 三種。
圖 2. DNA 和 RNA 之結構
資料來源：興倫信息有限公司網站 http://lms.hanluninfo.com/modx/index.php?id=1163
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由兩個以上的核苷酸連接起來就變成 DNA 或 RNA，DNA 通常是雙股螺旋結構，
而且由兩條單股 DNA 以 G 和 C 及 A 和 T 互相配對而成。核苷酸的連接是藉著第一個 核苷酸之 3’碳元素的氫氧基與第二個核苷酸的α磷酸基形成磷酸二酯鍵，因此 DNA 或 RNA 的末端，其一端是磷酸基而另一端是氫氧基。因磷酸基是接在第一個核苷酸的 5’
位置，所以此端稱為 5’端，而氫氧基是連在最後一個核苷酸的 3’位置，於是這一端就稱 為 3’端。
基因訊息的傳遞有 3 個主要步驟：複製、轉錄和轉譯。細胞分裂前，其 DNA 要先 複製，複製後先由 DNA 轉錄成 RNA，再由 RNA 轉譯為蛋白質。以 DNA 為模板 (template) 製造 DNA (或是以 RNA 為模板製造 RNA) 稱為複製，若是以 DNA 為模板製造 RNA 則 稱為轉錄，以 RNA 為模板製造蛋白質則稱為轉譯，RNA 也可做為模板來製造 DNA，
此作用稱為反轉錄 (reverse transcription)。
DNA 的複製需要模板、引子 (primer)、DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 和 4 種核 苷酸 dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 的參與。由雙股 DNA 解開之後形成的任一單 股 DNA 皆可作為模板，在引子的引導下，其序列必須與模板結合處的序列互補，其合 成會由 5’往 3’的方向進行。
轉錄時需要模板、RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 和 4 種核苷酸 NTP (ATP、CTP、
GTP、UTP) 的參與，而轉錄並非將 DNA 全部轉成 RNA，通常只轉錄 DNA 的某些部 份；轉錄的起始點位在啟動子 (promoter) 下游大約 10 個鹼基處，終點則在終止子 (terminator)。DNA 被轉錄後所得到的 RNA 產物包括 messenger RNA (mRNA)、transfer RNA (tRNA)、ribosomal RNA (rRNA)、small nuclear RNA (snRNA)、long non-coding RNA 和 small non-coding RNA (smRNA)。
真核生物的 mRNA 在形成之後必須經過改造才能使用，未被改造過的真核 mRNA 稱為 pre-mRNA。pre-mRNA 的改造包括 capping、polyadenylation 及剪接 (splicing)。
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Capping 是在 pre-mRNA 的 5’端加一個第七個位置被甲基化的 guanosine；
polyadenylation 則在 pre-mRNA 的 3’端加大約 50-200 個 A 的核苷酸，形成一 poly-A 的 尾巴；剪接是把 pre-mRNA 上不被表現成蛋白質的中介區 (intron) 切除，然後將會被表 現成蛋白質的表現區 (exon) 序列連接起來，大多數的 pre-mRNA 都有多個 exons，剪接 時是將這些 exons 依序相連，但也有挑選其中某幾個 exons 相連的情形，因此一條 pre-mRNA 經剪接後可能會形成數條不同的 mRNA，這種現象稱為選擇性剪接 (alternative splicing)。
聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 則是一可在試管內合成大量 DNA 的方法，進行 PCR 需有 DNA 模板、兩個引子、可抗熱的 DNA 聚合酶如 Taq DNA polymerase 及 dNTP。PCR 反應包括三個主要步驟，首先將模版加熱到 94℃，使其變性 成單股 DNA，然後將溫度降到大約 50℃，使引子與模版黏合，最後再將溫度上升到 72
℃，使 Taq DNA 聚合酶開始合成 DNA。接著再回到第一步，如此循環重複這三個步驟 大約 30-40 次後，可將 DNA 從原來的兩條變成幾億條。若以 PCR 擴增 RNA，則需先將 RNA 反轉錄成 cDNA，稱為反轉錄 PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)。
二、阻力運動表現基因
人體骨骼肌是一種機械性組織 (mechanical tissue)，它透過肌肉肥大現象增加動力輸 出，不僅可以提升運動表現，更降低因為肌肉過度強直 (overstrained) 所產生的風險，
由於過度強直這種局部損傷也常發生於正常肌肉，因此需要一個有效率的細胞修復系統 幫忙，生理學家便透過基因編碼來了解這種肌肉細胞的表現 (cellular phenotypes)。骨骼 肌的肌肉肥大是透過肌肉生成作用 (myogenesis) 完成的，肌肉細胞剛開始是鬆散的間 質細胞 (mesenchymal cell)，經過分化拉長形成肌母細胞 (myoblast)，在此時 MyoD 的 基因 family 被活化，造成肌肉母細胞的拉長、融合而形成肌小管(myotube)。因為胚胎 發育時期，許多肌纖維母細胞融合成骨骼肌纖維，因此骨骼肌為多核；肌小管繼續拉長、
融合，形成肌原纖維 (myofilaments)，再形成肌纖維 (muscle fiber)，有些分化成 external
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laminae 再形成肌內膜 (endomysium)。這些肌肉的成長和適應是透過結締組織中蛋白質 合成機制的正向和負向調節因子來平衡，其中 IGF-1 和 MSTN 即是形成肌肉成長平衡 (homeostasis) 二個最重要的調節因子 (Matsakas & Diel , 2005; Goldspink, 2005)。
肌纖維母細胞 (fibroblasts) 和造骨細胞 (osteoblasts) 的機械訊號 (mechanical signals) 是影響肌肉和骨骼細胞的基因表現重要的因素，Goldspink 等 (1992) 以電流刺 激兔子之肌肉，發現可以快速增加肌肉量，而電流刺激 (類似運動訓練造成的骨骼肌收 縮) 的肌肉部位可見到這些機械訊號 RNA 轉錄表現，而休息部位肌肉則無，因此認為 透過運動產生之肌肉肥大現象是局部而非全身性的。除此之外，Goldspink 等人也以序 列分析方法，將肌肉肥大的肌纖維 mRNA 反轉為 cDNA 後，發現其 cDNA 也是 IGF-1 的一種選擇性剪接 (雖然其 3’端的 exons 和肝性或全身性的 IGF-1 不同)，證實肌肉也有 IGF-1 之表現，因此將這個異構物定名為 IGF-1Ea。不過在命名過程發現，當要將 IGF-1Ea 應用到其他非肝性組織時遇到問題，因為在老鼠身上會形成另一種異構物 (IGF-1Eb)，
而在人體又會形成另一種異構物 (IGF-1Ec)，雖然這些異構物都來自相同基因，但特質 各異，為了區別這個特別是由機械敏感性 (mechanosensitive) 所誘發之基因，將其定名 為機械生長因子 mechano growth factor (MGF)。MGF 異於一般 IGF-1 的結構，是在 IGF-1 序列中第 5 個 exon 剪接成 MGF，這個特異性的結合蛋白會結合其他 IGF-1 異構物的羧 基肽 (carboxy peptide) 序列來穩定整個成長因子。當運動後，IGF-1 會先剪接成 MGF，
24 小時左右會完全剪接成全身性的 IGF-1Ea。
IGF-1 在肌肉生成多個層面參與作用，例如衛星細胞 (satellite cell) 的活化、轉錄和 轉譯 (Adams, & McCue,1998; Baldwin, & Haddad, 2002)，是骨骼肌負重誘發的肌肉肥大 的重要調控。人體實驗證實，長期阻力訓練增加 IGF-I 的表達 (Hameed et. al, 2004)，而 動物實驗發現長期阻力訓練的前期 (Adams, & Haddad, 1996; DeVol , Rotwein , Sadow ,
& Novakofski, 1990; Yamaguchi et. al, 2006) 和單次阻力訓練後 (Bamman et. al, 2001) IGF-I 的表達會增加。而等長收縮 isometric contractions (Haddad, & Adams, 2002) 或是等
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長收縮同時結合伸展訓練的阻力訓練 (Hill, & GoldspinK, 2003) 皆能快速提高 MGF 表 現；動物實驗發現，MGF 誘發肌纖維母細胞的促增殖作用，但對於肌纖維細胞的分化 作用(differentiation) 則無明顯影響，而 IGF-IEa 則是在肌肉母細胞增殖後，分化為肌小 管的過程扮演重要角色 (Yang, & Goldspink, 2002)。
Goldspink 和 Yang (2001) 將 MGF 的 cDNA 插入肌肉特異性調節序列的質粒載體 (plasmid vector)，再打入老鼠肌肉，3 週後發現老鼠肌纖維橫斷面積增加 25%；
Barton-Davis, Shoturma, Musaro, Rosenthal, 和 Sweeney (1998) 將全身性 (systemic type) 或肝性 (liver type) IGF-1 以腺病毒載體 (adenoviral vector) 調控的肌球蛋白輕鏈
(myosin light chain, MLC) 調節序列打入老鼠肌肉，亦發現具有同樣之效果，不過卻需 4 個月才能提升肌纖維橫斷面積 15%，Coleman 等 (1995) 和 Musaro 等 (2004) 分別以雞 的α 肌動蛋白啟動子 (α-actin promoter) 和肌球蛋白輕鏈 1 及 3 (MLC1、MLC3) 作為 IGF-1Ea 基因轉殖老鼠之序列，發現 IGF-1 對局部肌肉組織具有表現，由以上之研究可 知，MGF 和 IGF-1Ea 在肌力的表現上扮演正向調節的角色。
相對於 IGF-1，肌抑素 (MSTN) 是肌肉發展的負面調節因子，MSTN 是轉化成長 因子β (transforming growth factor-β, TGF-β) 的超家族 (superfamily) 的一員，主要功能 是調節肌肉和骨骼之成長和分化。無論是老鼠、牛或人體實驗，去除 MSTN 功能將會提 升肌肉量，而當給予肌肉萎縮蛋白缺陷 (dystrophin-deficient) 的基因轉殖老鼠肌抑素 時，其肌肉再生現象將會被阻斷 (Lee,2004; Schuelke et al., 2004)。Thomas 等 (2000) 研 究發現，肌抑素會抑制成年老鼠肌肉衛星細胞活化和蛋白質合成作用，同時抑制肌細胞 生成作用中肌纖維母細胞之增殖。
肌抑素具有劑量效應 (dose-dependent)，當在胚胎期時，肌抑素會因為骨骼肌成長 而被抑制，不過當成年後，肌抑素將持續由肌肉分泌並表現。另外，肌抑素會和 propeptide 結合，在血液中以潛伏型態循環，最後被一種金屬性蛋白酶 (BMP1/Tolloid matrix metalloproteinase) 裂解後形成活潑型態，活潑的肌抑素結合本身的受器 (type II b activin receptor , ActRIIB)，透過 TGF-β 訊息路徑，調節其標靶基因的表現 (Elkasrawy & Hamrick,
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2010)。IGF-1 和 MSTN 對蛋白質合成分解路徑如圖 3。
圖 3. 運動調控 IGF-1 和 MSTN 對蛋白質合成分解路徑簡圖。SMAD2/3: stimulate atrogene transcription 2 & 3; UPS: ubiquitin-proteasome system。資料來源：Skeletal muscle wasting in cachexia and sarcopenia: Molecular pathophysiology and impact of exercise training. Bowen, T. S., Schuler, G., & Adams, V. (2015). Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle, 1(1), 9-21.
許多研究證實，無論是長期或短期的阻力訓練 (Haddad & Adams, 2002)，甚至是單 次的急性阻力運動 (Kim, Cross, & Bamman, 2005)，皆會降低人體肌抑素的表現，而在 動物模式中，不只是阻力訓練，甚至耐力訓練也會降低肌抑素的表現 (Matsakas, Friedel, Hertrampf, & Diel, 2005)。Peters 等人 (2003)發現單次 acute 阻力訓練增加 MSTN mRNA 表現，特別是在運動後 3-6 小時達到高峰，因為參與單次運動的基因調節可能與多次長 時間訓練不同，因此無法一體討論 (Haddad, & Adams,2002)，而且單次訓練造成的 MSTN 表現上升是短暫性的 transient increase。無運動經驗者經長期阻力訓練結束後立即取得肌 肉樣本的分析，也發現肌肉 MSTN mRNA 表現上升 (Willoughby, 2004) 。不過 Raue ,
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Slivka , Jemiolo , Hollon , & Trappe (2006) 的研究，發現年輕 (18-30 歲) 和年老女子 (80-89 歲) 經過中等強度阻力訓練 4 小時後 MSTN mRNA 表現卻是下降的，代表單次運 動訓練反應仍不明，因此推論 MSTN mRNA 的變化僅能代表蛋白質表現的變化，且是受 酵素的活化(enzymatic activation) (Wolfman et. al, 2003)。
根據以上之研究，證實阻力訓練誘發肌肉肥大的基因機轉是降低肌肉成長負向調 節因子 (MSTN) 之表現，同時提升正向調節因子 (IGF-IEa, MGF) 之表現所致，本研究 期望透過大鼠負重攀爬之阻力訓練再次檢驗此一機轉，同時探討北蟲草攝食的介入，是 否改變肌肉生長因子之表現。