阻力訓練與北冬蟲夏草攝食對大鼠骨骼肌IGF-1Ea、MGF和MSTN基因表現的影響

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(1)國立臺灣師範大學運動與休閒學院體育學系博士學位論文. 阻力訓練與北冬蟲夏草攝食對大鼠骨骼肌. IGF-1Ea、MGF 和 MSTN 基因表現的影響. 研究生：王宏豪指導教授：謝伸裕. 中華民國 105 年 6 月中華民國臺北市.

(2) 阻力訓練與北冬蟲夏草攝食對大鼠骨骼肌 IGF-1Ea、MGF 和 MSTN 基因表現的影響 2016 年 6 月. 研究生：王宏豪指導教授：謝伸裕摘要. 前言：阻力訓練對於骨骼肌肌力發展基因表現的提升具有正面的效果，如果訓練同時增補具有活化肌力發展基因調控之增補物，可能提升負重運動表現。北冬蟲夏草 (Cordyceps militaris，以下簡稱蟲草) 中之蟲草素 (cordycepin) 可能誘發老鼠骨骼肌脂肪代謝基因表現，而對於肌力表現的調節因子如 IGF-1Ea、MGF 和 myostatin (MSTN) 則尚無研究發表，如以動物模式輔以負重訓練，是否能如預期誘發肌力基因表現，需要進一步證實。目的：探討負重階梯攀爬訓練對攝食北冬蟲夏草大鼠骨骼肌肌力發展基因表現之影響。方法：將 32 隻 7 週齡 SD 大鼠分成 4 組：1.控制組 (C, n=8)：無處理。2.蟲草組 (CM, n=8)：灌食劑量 200 mg/kg/d 北冬蟲夏草粉劑。3.訓練組 (T, n=8)：負重訓練。 4.蟲草訓練組 (TCM, n=8)：灌食劑量 200 mg/kg/d 北冬蟲夏草粉劑外加負重訓練。訓練組實施 3 次/週，共 6 週之負重階梯攀爬訓練，3 週時各組犧牲 4 隻 (中測)，6 週結束前各組實施負重測試後犧牲 (後測)。取腓腸肌 (快縮肌) 和比目魚肌 (慢縮肌) 實施半定量反轉錄-聚合酶鏈鎖反應 (semi-quantitative SqRT-PCR) 分析肌力發展調控基因之表現。統計以二因子變異數分析以及杜凱氏事後比較，顯著水準為 p＜.05。結果：6 週蟲草攝食和負重訓練對於體重和負重運動表現無顯著影響，但上調腓腸肌 IGF-1Ea. (後測). 和 MGF (中測和後測) 基因，同時下調 MSTN (中測和後測) 基因，且 TCM 在 MSTN 基因的下調具有協同效應 (synergistic effect)；對比目魚肌 IGF-1Ea 和 MGF 的調控影響不大，只有 TCM 下調 MSTN (後測) 基因。結論：蟲草攝食和負重訓練對大鼠快縮肌群 IGF-1Ea 和 MGF 基因具有正向調控效果，但對慢縮肌群的表現影響較小；無論在快縮或慢縮肌，蟲草攝食和負重訓練對 MSTN 基因的下調表現皆有顯著影響。. 關鍵詞：北冬蟲夏草、阻力訓練、IGF-1Ea、MGF、MSTN iii.

(3) The Effects of Resistance Training and Cordyceps Militaris Supplementation on Muscle Strength Growth Factor Gene Expression in Rats June, 2016 Author: Wang, Hung-Hao Advisor: Hsieh, Shen-Yu. Abstract Introduction：Recent studies have confirmed that resistance training can regulate the gene expression of muscle strength growth factors (MSGF). It has been demonstrated that Cordycepin of Cordyceps militaris (CM) can induce the fatty-acid metabolism gene in rat muscles , such as AMPK, PGC-1α and PPAR-δ. However, the effects on genes involved in muscle strength, such as the genes coding for IGF-1Ea、MGF and myostatin (MSTN) have not been examined. The effects of resistance training with CM supplementation to enhance muscle strength factor needs further investigation. Purpose: To investigate the effects of resistance training on MSGF gene expression in CM supplemented rats. Methods: Thirty-two 7-wk-old Sprague-Dawley rats were divided into 4 groups: 1.Control group (C, n=8): general feeding. 2. CM feeding group (CM, n=8): general feeding mixed with 200mg/kg/d CM extract. 3. Training group (T, n=8): loaded resistance training on climbing ladder. 4. Training with CM feeding group (TCM, n=8): general feeding mixed with 200mg/kg/d CM extract, and loaded resistance training on climbing ladder. A progressive exercise training protocol was adopted 3 days/week on T and TCM for 6 weeks. Four rats from each group were sacrificed after 3 weeks of experimentation as middle-testing. The others were sacrificed after the loading-test at the end of the experiment as final-testing. Semi-quantative RT-PCR was used to analyse the expression of muscle strength genes on gastrocnemius (fast twitch muscle) and soleus (slow twitch muscle). A 2-way ANOVA and Tukey’s test was used to compare the differences among the groups. Significant level was set at p <.05. Results: CM supplementation and iv.

(4) resistance training for 6 weeks had no significantly effects on the body weight and the loading-test results. However, IGF-1Ea was up-regulated in gastrocnemius in the final-test, and MGF was up-regulated in both middle- and final-tests. MSTN was down-regulated in gastrocnemius in both middle- and final-tests. Resistance training and CM supplementation had synergistic effect on down-regulating the MSTN. In soleus, no significant effect on regulation of IGF-1Ea and MGF was observed, but down-regulation of MSTN was detected in TCM. Conclusions：CM supplementation and resistance training had positive effects on IGF-1Ea and MGF expressions, and negative effects on MSTN expressions of fast twitch muscles in rats, as well as minor effects on slow twitch muscles.. Key words: Cordyceps militaris, resistance training, IGF-IEa, MGF, MSTN. v.

(5) 謝. 誌. 歷經九個寒暑、二次資格考、多次投稿的反覆修正、炸掉 2 台高速低溫離心機、深夜一人獨守實驗室 PCR machine，拖到最後一刻，終於將博士論文付梓，是自己時間管理不佳，加上學術的不夠到位，其間的滋味只有陪我走過歷程的朋友才能略知一二。謝謝指導教授謝伸裕博士從大一帶著我進游泳隊，大學四年的學習，碩士班、博士班的耐心提點，對我有著比其他學生更多包容和關心，近三十年如師如父如友般的情誼，點滴心頭。林乃君教授在友人請託下，大方讓我進台大實驗室學習，四年期間耗費的人力物力不計其數，對毫無分生實驗知識的我不忍苛責，銘感五內。因為林教授的一句話就帶著我從零開始學習的靖芳，說是朋友，實則是師父，謝謝妳對年近半百、記憶力退化的老學生的包容和幫忙。林教授赴海外發表期間，友義放下自己的實驗，在時間的壓力下，從破細胞不厭其煩陪著我將實驗完成，怎麼覺得實驗室有這麼多好人?當然，從預備研究開始，每天花 4 小時幫我餵養和訓練老鼠的侑倖、又嫻、俐毅、柏穎、徐芸，怕老鼠和吃素的各位最後還幫忙犧牲老鼠，如果這不是義氣，甚麼才是義氣?特別感謝生科系吳忠信教授二話不說，大方出借動物中心和器材；慕求生技公司免費提供價值不斐的蟲草做為動物增補，免去許多實驗的財力負擔。比我還著急能不能畢業的麥秀英老師，從我學生時代，一直到畢業、工作、成家，一路陪伴與鼓勵，論文的完成是您的加持。內人雪貞在我實驗和論文農忙期一肩扛起家裡所有工作，子衿、子佩懂事配合，讓我在實驗室和研究室無後顧之憂，妳們是我論文能夠完成的最重要支柱。母親米姿女士含辛茹苦將我拉拔長大，雖然您常說沒讀甚麼書，希望養出一個博士兒子能平復您一些遺憾。以此論文，獻給天上的父親，榮耀王家。. 王宏豪謹誌 2016.7.11.. vi.

(6) 目. 次. 口試委員與系主任簽字之論文通過簽名表………….….……………………………………i 論文授權書…………….……………………………………….…..…………………………ii 中文摘要…………………………………..…………………….……………………………iii 英文摘要……………………………………………………………..………………………..iv 謝誌………………………………………………………………………….……………… vi 目次………………………………………………………………….………...……………vii 表次…………………………………………………………………………………..………ix 圖次………………………………………………………………............... ….…….………x. 第壹章. 緒論…...………………………………………………………………1. 第一節. 前言…...……………………………………….………………………………1. 第二節. 研究目的…...…………………………………………………………………4. 第三節. 名詞操作性定義………………………………………………………………4. 第四節. 研究範圍與限制…...…………………………………………………………6. 第五節. 研究的價值…...…..…………………………………………………………7. 第貳章. 文獻探討…...…………………………………..……………………9. 第一節. 運動和基因表現之相關文獻….………………………………………………9. 第二節. 冬蟲夏草之相關文獻...………………………………………………..……15. 第三節. 蟲草攝食與運動表現之相關文獻…………………………………………18. 第參章. 研究方法與步驟……………………………..……………………23. vii.

(7) 第一節. 研究對象…...…………………………………………………………………23. 第二節. 實驗設計...……………………………………………………………..……23. 第三節. 飼育環境……………………………………………………………………25. 第四節. 實驗飼料與增補物…………………………………………………………25. 第五節. 預備研究 ……………………………………………………………………26. 第六節. 阻力訓練和負重測試之實驗設計…………………………………………28. 第七節. 動物犧牲和組織摘取………………………………………………………31. 第八節. 組織及基因指標分析………………………………………………………31. 第九節. 統計分析……………………………………………………………………36. 第肆章. 結果…...……...………………………………..……………………37. 第一節. 體重與運動表現…...………...………………………………………………37. 第二節. 腓腸肌肌力發展因子基因表現……………………………………………38. 第三節. 比目魚肌肌力發展因子基因表現…………………………………………41. 第伍章. 討論…...……...………………………………..……………………45. 第一節. 體重與運動表現…...…...…...…...…………………………………………45. 第二節. 肌力發展因子正向調控基因表現…………………………………………48. 第三節. 肌力發展因子負向調控基因表現…………………………………………51. 第四節. 結論…………………………………………………………………………53. 引用文獻 ………………………………………………………………………………55 附件…………………………………………………………………………………………71. viii.

(8) 表. 次. 表 1 大鼠漸進式負重階梯攀爬阻力訓練模式表…………………………………………30 表 2 肌肉生長因子相關基因之引子對序列………………………………………………32 表 3 大鼠中測和後測各組體重之平均數及標準差………………………………………37 表 4 大鼠 6 週實驗後負重與體重比值之平均數及標準差………………………………38 表 5 大鼠腓腸肌中測和後測肌力發展因子基因表現倍數………………………………38 表 6 大鼠比目魚肌中測和後測肌力發展因子基因表現倍數……………………………41. ix.

(9) 圖. 次. 圖 1. 北蟲草成分分析和蟲草素 HPLC 分析………….………………………………5 圖 2. DNA 和 RNA 之結構……….……………….…………………….………………9 圖 3. 運動調控 IGF-1 和 MSTN 對蛋白質合成分解路徑簡圖………………….………14 圖 4. 西藏蟲草和北冬蟲夏草…………….…………….….…………………….………16 圖 5. 大鼠攀爬架及實際攀爬圖………….……….……………….…………….………28 圖 6. 大鼠 6 週實驗後各組骨骼肌基因表現電泳圖……………………………………36 圖 7. 大鼠腓腸肌中測和後測 IGF-1Ea 基因表現倍數…………………………………39 圖 8. 大鼠腓腸肌中測和後測 MGF 基因表現倍數……………………………………40 圖 9. 大鼠腓腸肌中測和後測 MSTN 基因表現倍數……………………………………41 圖 10. 大鼠比目魚肌中測和後測 IGF-1Ea 基因表現倍數……………………………42 圖 11. 大鼠比目魚肌中測和後測 MGF 基因表現倍數…………………………………43 圖 12. 大鼠比目魚肌中測和後測 MSTN 基因表現倍數………………………………44. x.

(10) 第壹章第一節. 緒論前言. 生物骨骼肌因其能量代謝來源和收縮速率的不同，區分為有氧型慢縮肌 (Type I)、有氧醣解快縮肌 (Type II a) 和醣解快縮肌 (Type II b) (Pette & Staron, 2000)。其中，Type I 肌纖維以慢縮蛋白酶作為表現，主要能量來源為脂肪酸氧化作用，能穩定且長時間提供 ATP，對於耐力性運動表現優於 Type II 肌纖維，而 Type II 肌纖維則是以快縮蛋白酶作為表現，主要能量來源為葡萄糖氧化作用。骨骼肌是具有可塑性的，在動物實驗中，不同運動訓練刺激或運動神經的調控下，不同的肌肉類型可以互相轉換 (Booth ＆ Thomason, 1991)。TypeⅡb 肌纖維有可能轉換成 TypeⅡa 或 TypeⅠ肌纖維，主要是透過鈣離子信號路徑 (calcium signaling pathway) 來調控，而這些路徑的調控則源自於這些肌纖維代謝基因目標轉錄因子 (calcineurin, calmodulin-dependent kinase, transcriptional cofactor PGC1-α) 的基因再設定 (reprogramming) (Wang et al., 2004)。. 透過運動訓練可以提升運動表現，其機轉是引發一連串骨骼肌基因表現程式的重組，透過改變肌原纖維的代謝程式 (metabolic programs) 和結構性蛋白 (structural proteins)，同時改變能量受質的使用和肌纖維收縮蛋白量，因而延遲耐力運動衰竭的發生 (Fluck & Hoppeler, 2003)。從基因表現的角度來看，耐力運動訓練產生的肌肉適應，主要是提升慢縮肌纖維粒線體的呼吸作用和脂肪酸氧化作用的基因表現 (Garnier et al., 2005; Siu, Donley, Bryner, & Always, 2004; Short et al., 2005; Timmons et al.,2005)，骨骼肌反覆收縮過程提升PGC1-α的表現，從而增加穿膜蛋白 FNDC5 (fibronectin type III domain containing protein 5) 的活性，FNDC5 於胞外被修剪釋放肌肉激素 (irisin)，活化粒線體的第一型解偶聯蛋白 (uncoupling protein 1, UCP1) 表現，使得氧化磷酸化途徑減少ATP的產生，轉而以非顫抖性產熱的方式釋放能量 (蔡易珊和王鶴森，2013)。. 1.

(11) 由於中樞神經的刺激和肌肉產生的適應，適當的阻力訓練 (resistance training) 對於肌力、肌耐力及肌纖維量的提升具有正面的效果 (Fitts, 2003)，普遍的研究認為6-12週的阻力訓練可以提升大鼠骨骼肌重量/體重的比值，其中比目魚肌比率約為31-45%，蹠肌比率約為26-34%，而腓腸肌比率則約7-18% (Tamaki, Uchiyama, & Nakano, 1992)，同時在血液的生化及荷爾蒙的表現上，部分研究也支持單次或即時 (acute) 的阻力訓練可以增加人體荷爾蒙濃度 (Craig, Brown, & Everhart,1989)，而長期 (chronic) 的阻力訓練更能大幅提升血液中總睪固酮 (total testosterone)、游離睪固酮 (free testosterone)、皮質醇 (cortisol) 和生長荷爾蒙 (growth hormone, GH) 等生化值的濃度 (Ahtiainen, Pakarinen, Alen, Kraemer, & Häkkinen,2004; Mccall, Byrnes, Fleck, Dickinson, & Kraemer, 1999)。. 這些與雄性激素相關的血液荷爾蒙，常常是肌力增加或骨骼肌肥大 (hypertrophy) 的客觀證據，而除了透過運動訓練外，許多研究也證實雄性激素 (例如睪固酮) 的增補也能增加這些荷爾蒙的表現，同時顯著增加肌肉量和提升最大自主肌力 (Bhasin et al., 1996; Bhasin et al., 1997; Bhasin et al., 2001)。Casaburi等 (2004) 發現如果分別實施阻力訓練或耐力訓練的話，血液睪固酮濃度分別提升了17.2%和17.4%，但是如果服用睪固酮同時實施阻力訓練，發現睪固酮濃度的提升高達26.8%，亦即增補劑透過阻力訓練的誘發 (也可能是阻力訓練透過增補劑的誘發) 能夠使得血液中代表阻力運動表現的荷爾蒙得到加成的表現。有趣的是，Staron等 (1994) 指出8週阻力訓練能提升男性訓練初期 (第4週) 的安靜睪固酮，但是在皮質醇濃度則會在第6週下降。Kraemer等 (1999) 也發現類似的結果，其原因可能是睪固酮的生合成受下視丘及腦下垂體前葉調控，當睪固酮含量過高時，會啟動負回饋調控機制，抑制下視丘及腦下垂體前葉，使促性腺激素荷爾蒙和黃體激素無法釋放，從而抑制萊氏細胞 (Leydig cell) 繼續製造並分泌睪固酮 (劉春英和許美智，1999)。雖然部分研究支持額外的雄性激素增補可以提升肌力表現，但由於賀爾蒙負回饋機制的影響，部分研究無法證實可以提升血液中之雄性激素生化指標，欲尋求更上游之證據，分子生物學 (molecular biology) 的基因分析提供了一個更客 2.

(12) 觀的方法。. 冬蟲夏草 (Cordyceps sinensis，以下簡稱蟲草) 為東方高級的傳統中藥材，是由真菌寄生於昆蟲的幼蟲屍體長成之菌種，因自然界數量稀少，近年開始以人工方式培育，其內含之重要成分蟲草素並未因人工育種減少。中國對於冬蟲夏草的功能敘述極多，認為蟲草能「補精髓，治膈症，療腰膝痛楚，緩老化」及「保肺益腎，止血化痰，巳勞嗽」 (黃懷玉和許美智，2000)。許多西藏和尼泊爾地區的居民以蟲草攝食來治療高山症，而在西方則是用來作為運動員提升運動成績或預防老化的增補物。 20年來，許多中國奧運運動員 (曲棍球、越野滑雪、女子足球、自由車選手) 聲稱其運動成績之提升，是得利於長期服食中國傳統中藥 (如鱉血、馬拉膠…等)，而使用較多的是冬蟲夏草。其中最典型的例子是1993年中國女子田徑隊「馬家軍」打破女子1500 公尺、3000公尺和10000公尺世界記錄讓冬蟲夏草聲名大噪 (Earnest et al., 2004)。蟲草對於運動表現的增能仍有部分爭議，支持提升運動表現可能之機轉包含三個部份：一、改變雄性荷爾蒙的濃度：增加人體或動物血漿中的睪固酮和皮質醇 (李立仁，1997)，睪固酮可以增加肌肉蛋白合成，而皮質醇則可以促進脂肪組織之脂肪酸和肌肉中之胺基酸分解，因而增加肌力或提升能量代謝表現。二、改變血液中血紅素濃度：蟲草可以誘發老鼠骨髓生成紅血球 (Li, Chen, & Jiang, 1993) 和血紅素的生成 (張權發，1997)，增加血液攜氧能力，或是增加肌肉中磷酸肌酸激酶 (phosphocreatine kinase) 活性 (張家俊和陳文為，1992)，增加抗疲勞之功效。三、降低因急性運動產生之氧化傷害：蟲草可以增加肌肉中過氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 之活性 (Kumar et al., 2011)，降低丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 含量,提升自由基之清除，降低DNA之損傷程度，避免機體產生傷害。因此在不違運動倫理且無身體副作用的前提下，自然界中能提升內源性睪固酮生成的傳統食補中藥「冬蟲夏草」，提供運動營養增能研究的想像空間。目前大部分研究支持蟲草攝食對人體耐力運動表現的提升具有正面的影響，但是對於肌力表現的影響因受到實驗條件的干擾 (研究對象為年輕運動員、睪固酮的負回饋機制、商用產品品質不一以及人體實驗控制不佳等) 尚未有定論，加上尚無以動物作為研 3.

(13) 究對象的實驗，如能整合動物實驗，嚴謹調控實驗室環境，輔以分子生物學的分析，應能提供蟲草攝食和阻力訓練對肌肉成長的可能證據。. 第二節. 研究目的. 本研究主要以阻力訓練和北冬蟲夏草的攝食為自變項，探討其對大鼠骨骼肌肌力發展之基因表現的關係：. 一、探討阻力訓練支持不同骨骼肌（快縮肌腓腸肌和慢縮肌比目魚肌）肌力發展之基因表現理論。. 二、探討北冬蟲夏草攝食能否改變大鼠骨骼肌中肌力發展之基因表現。. 三、探討阻力訓練和北冬蟲夏草攝食對於改變肌力發展調節基因之表現，是否具有協同效應 (synergistic effect)。. 第三節. 名詞操作性定義. 一、北冬蟲夏草：本研究採用之蟲草為北蟲草，由台灣慕求生技股份有限公司 (Mucho Herb Biotech Co., LTD) 以人工方式培植，非量產之商品，所以品質相對穩定。本實驗使用之北蟲草生物活性分析和蟲草素高效液相層析技術 (high performance liquid chromatography, HPLC) 分析如圖1。. 4.

(14) UV 220nm v.s PL-ELS 2100 冬蟲夏草提取液分離檢測例 Cordycepin. Adenosine Uridine. HPLC:LabAlliance Binary Gradient System Column:Polymamine II 4.6x250mm Eluent A:AeCN Eluent B:50mM NH4OAc in H2O Gradient A%/B%=80/20-40min->60/40->40min-60/40 Flow:1.0ml/min Detection:1.)UV220nm 2.)PL-ELS 2100(Neb.30℃,Evap.40 ℃,N2:1.6SLM) Injection Volume:20ul. UV220nm PL-ELS 2100. 圖 1. 北蟲草成分分析和蟲草素 HPLC 分析資料來源：Mucho Herb Biotech Co., LTD. 北蟲草毒性反應極低，宋文君 (2008) 的研究發現，給予大鼠高達 2000 mg/kg/d 劑量之北蟲草，其體重與控制組無異，餵食 14 天亦無動物死亡案例，以微核實驗 (micronuclues test) 評估亦不具基因毒性；黃懷玉和許美智 (2000) 認為小鼠服食蟲草水萃液的最大耐受量為 45 g/kg，而注射半數致死量 (LD50) 為 21.7±1.3 g/kg；給予相當於人體建議量 5 倍之劑量 (132.5 mg/kg/day)，大鼠血液尿素氮亦未增加 (吳銘芳、呂旭峰、吳龍源、葉明陽和敖曼冠，2011)，顯示蟲草未影響其腎臟功能。本研究參考 Kumar 等 (2011) 之研究，同時修正本研究之預備研究，給予大鼠 200 mg/kg/d 之蟲草凍乾粉劑水溶液作為攝食劑量。. 二、阻力訓練：本研究是以負重階梯攀爬做為大鼠阻力訓練之依據。6週負重訓練採漸 5.

(15) 進原則，每週增加負重和反覆組數，最後動物能完成每週3次，每次4組，每組8次反覆，負重達45 %體重之攀爬訓練 (如圖4)。. 三、肌力發展因子 (muscle strength growth factors, MSGF) 基因表現：依據研究之目的，本實驗以「半定量反轉錄聚合酶連鎖反應」 (semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, SqRT-PCR) 方法檢測的基因指標如下：. 1. 肌力發展正向調節基因：類胰島素生長因子-1 異構物 Ea (insulin like growth factor-1 isoforms, IGF-1Ea)，機械生長因子 (mechano growth factor, MGF)。. 2. 肌力發展負向調節基因：肌肉生長抑制素，簡稱肌抑素 (myostatin, MSTN)。. 第四節. 研究範圍與限制. 一、本實驗使用之蟲草為北蟲草，由人工方式培植，非自然繁殖之品種，其結果可能無法推論至一般市售之商業產品。. 二、本次實驗以蟲草子實體凍乾後直接磨碎成粉劑，融入水中以灌食方法餵食，非以萃取方式純化，除了是大部分研究使用相同之處理外，主要希望增補物能以最接近自然的狀態攝食，增加生態效度 (ecological validity)，期望研究成果能作為未來人體實驗或實際應用之劑量參考。. 三、本實驗以大鼠動物模式為實驗對象，訓練方法以負重階梯攀爬做為肌力訓練之模式，研究結果可能不等同於人體實驗或其他訓練模式。. 6.

(16) 第五節. 研究的價值. 雖有部分研究支持冬蟲夏草可以提升耐力或阻力運動表現，但是也不少文獻認為蟲草對運動成績的影響不大 (Earnest et al., 2004; Thomas & Walker, 2006; Hsu et al., 2011)，造成研究結果的不一致，可能是部分研究以商業產品做為補充物，其真實性和效用在過去文獻中也曾被質疑 (Paterson, 2008)；其次是以人作為受試對象雖具應用性，但實驗控制度較低，容易影響結果；此外，部分研究以血液之荷爾蒙做為分析方法，容易受個體差異之影響，加上雄性激素易受下視丘之負回饋抑制，可能使結果不一。針對以上研究之可能限制，本研究包含以下幾點特色：. 一、. 北蟲草的培育：本實驗選用之北蟲草是以真菌從蟲蛹轉置於米基上 (有性型)，以人工栽培方法取得，因人工培養的天然菌絲體具有最小的遺傳變異 (Singh, Negi, & Ahmed, 2009)，因此培育的蟲草素成份較高。. 二、. 分子生物學分析：選擇以骨骼肌基因表現角度切入，除了不受個體組織和血液荷爾蒙調控差異之影響，更直接聚焦於活動表現肌群之基因表現，期能發現影響結果的機轉。. 三、. 動物阻力訓練模式的選擇：目前已知的動物阻力訓練模式包含蹲式 (squat-type) 運動 (Fluckey, Vary, Jefferson, & Farrell, 2003; Gardiner, Hibl, Simpson, Roy, & Edgerton, 1998; Klitgaard, 1988; Tamaki, Uchiyama, & Nakano, 1992)、等長收縮 (isometric) 訓練 (Exner, Staudte, & Pette, 1973; Klitgaard, Marc, Brunet, Vandewalle, & Monod, 1989)、等張收縮 (isotonic) 訓練(Norenberg & Fitts, 2004)、增強式 (plyometric) 訓練 (Almeida-Silveira, Perot, Pousson, & Goubel, 1994)和電刺激誘發肌肉收縮(electrically evoked contraction) ( Caiozzo, Hadia, Baker, & Baldwin, 1996; Caiozzo, Ma, McCue, Smith, Herrick, & Baldwin, 1992; Wong, & Booth, 1988) 等，不過這些實驗都有實施上的難度和困擾，本實驗選擇以負重階梯攀爬 (weighted 7.

(17) ladder climbing) 作為訓練模式 (Duncan, Williams, & Lynch, 1988; Widrick & Fitts, 1997)，避免以電刺激、吹氣、飢餓、沖水等方法刺激運動，產生訓練副作用，同時更有效率且客觀達到運動訓練的強度要求。. 四、. 動物實驗與實驗室的有效控制：人體實驗常常受外在變項（如飲食、作息、心理預期等）的干擾，如能透過動物實驗模式將生活作息及心理預期等干擾因素排除，同時更嚴謹的控制運動訓練強度及蟲草增補量，其因果關係必定更顯著。如能證實北蟲草支持運動表現的證據，可以提供運動員更安全、更有效果的營養和增能的增補建議。. 8.

(18) 第貳章第一節. 文獻探討. 運動和基因表現之相關文獻. 一、基因的複製 (replication)、轉錄 (transcription) 和轉譯 (translation). 核酸 (nucleic acid) 包含了核醣核酸 (ribonucleic acid, RNA) 和去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA)，是組成基因的重要物質。DNA 或 RNA 是核苷酸的聚合物，主要以一個五碳醣 (ribose) 為中心，連接鹼基 (base) 形成核苷，再加上磷酸基 (phosphate) 所組成 (如圖 2)。鹼基有嘌呤 (purine) 及嘧啶 (pyrimidine) 兩大類，嘌呤包含腺嘌呤 (adenine, A ) 及鳥糞嘌呤 (guanine, G ) ; 嘧啶則包含胸腺嘧啶 (thymine, T )、胞嘧啶 (cytosine, C ) 及尿嘧啶 (uracil, U ) 三種。. 圖 2. DNA 和 RNA 之結構資料來源：興倫信息有限公司網站 http://lms.hanluninfo.com/modx/index.php?id=1163. 9.

(19) 由兩個以上的核苷酸連接起來就變成 DNA 或 RNA，DNA 通常是雙股螺旋結構，而且由兩條單股 DNA 以 G 和 C 及 A 和 T 互相配對而成。核苷酸的連接是藉著第一個核苷酸之 3’碳元素的氫氧基與第二個核苷酸的α磷酸基形成磷酸二酯鍵，因此 DNA 或 RNA 的末端，其一端是磷酸基而另一端是氫氧基。因磷酸基是接在第一個核苷酸的 5’ 位置，所以此端稱為 5’端，而氫氧基是連在最後一個核苷酸的 3’位置，於是這一端就稱為 3’端。. 基因訊息的傳遞有 3 個主要步驟：複製、轉錄和轉譯。細胞分裂前，其 DNA 要先複製，複製後先由 DNA 轉錄成 RNA，再由 RNA 轉譯為蛋白質。以 DNA 為模板 (template) 製造 DNA (或是以 RNA 為模板製造 RNA) 稱為複製，若是以 DNA 為模板製造 RNA 則稱為轉錄，以 RNA 為模板製造蛋白質則稱為轉譯，RNA 也可做為模板來製造 DNA，此作用稱為反轉錄 (reverse transcription)。. DNA 的複製需要模板、引子 (primer)、DNA 聚合酶 (DNA polymerase) 和 4 種核苷酸 dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP) 的參與。由雙股 DNA 解開之後形成的任一單股 DNA 皆可作為模板，在引子的引導下，其序列必須與模板結合處的序列互補，其合成會由 5’往 3’的方向進行。. 轉錄時需要模板、RNA 聚合酶 (RNA polymerase) 和 4 種核苷酸 NTP (ATP、CTP、 GTP、UTP) 的參與，而轉錄並非將 DNA 全部轉成 RNA，通常只轉錄 DNA 的某些部份；轉錄的起始點位在啟動子 (promoter) 下游大約 10 個鹼基處，終點則在終止子 (terminator)。DNA 被轉錄後所得到的 RNA 產物包括 messenger RNA (mRNA)、transfer RNA (tRNA)、ribosomal RNA (rRNA)、small nuclear RNA (snRNA)、long non-coding RNA 和 small non-coding RNA (smRNA)。. 真核生物的 mRNA 在形成之後必須經過改造才能使用，未被改造過的真核 mRNA 稱為 pre-mRNA。pre-mRNA 的改造包括 capping、polyadenylation 及剪接 (splicing)。 10.

(20) Capping 是在 pre-mRNA 的 5’端加一個第七個位置被甲基化的 guanosine； polyadenylation 則在 pre-mRNA 的 3’端加大約 50-200 個 A 的核苷酸，形成一 poly-A 的尾巴；剪接是把 pre-mRNA 上不被表現成蛋白質的中介區 (intron) 切除，然後將會被表現成蛋白質的表現區 (exon) 序列連接起來，大多數的 pre-mRNA 都有多個 exons，剪接時是將這些 exons 依序相連，但也有挑選其中某幾個 exons 相連的情形，因此一條 pre-mRNA 經剪接後可能會形成數條不同的 mRNA，這種現象稱為選擇性剪接 (alternative splicing)。. 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 則是一可在試管內合成大量 DNA 的方法，進行 PCR 需有 DNA 模板、兩個引子、可抗熱的 DNA 聚合酶如 Taq DNA polymerase 及 dNTP。PCR 反應包括三個主要步驟，首先將模版加熱到 94℃，使其變性成單股 DNA，然後將溫度降到大約 50℃，使引子與模版黏合，最後再將溫度上升到 72 ℃，使 Taq DNA 聚合酶開始合成 DNA。接著再回到第一步，如此循環重複這三個步驟大約 30-40 次後，可將 DNA 從原來的兩條變成幾億條。若以 PCR 擴增 RNA，則需先將 RNA 反轉錄成 cDNA，稱為反轉錄 PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)。. 二、阻力運動表現基因. 人體骨骼肌是一種機械性組織 (mechanical tissue)，它透過肌肉肥大現象增加動力輸出，不僅可以提升運動表現，更降低因為肌肉過度強直 (overstrained) 所產生的風險，由於過度強直這種局部損傷也常發生於正常肌肉，因此需要一個有效率的細胞修復系統幫忙，生理學家便透過基因編碼來了解這種肌肉細胞的表現 (cellular phenotypes)。骨骼肌的肌肉肥大是透過肌肉生成作用 (myogenesis) 完成的，肌肉細胞剛開始是鬆散的間質細胞 (mesenchymal cell)，經過分化拉長形成肌母細胞 (myoblast)，在此時 MyoD 的基因 family 被活化，造成肌肉母細胞的拉長、融合而形成肌小管(myotube)。因為胚胎發育時期，許多肌纖維母細胞融合成骨骼肌纖維，因此骨骼肌為多核；肌小管繼續拉長、融合，形成肌原纖維 (myofilaments)，再形成肌纖維 (muscle fiber)，有些分化成 external 11.

(21) laminae 再形成肌內膜 (endomysium)。這些肌肉的成長和適應是透過結締組織中蛋白質合成機制的正向和負向調節因子來平衡，其中 IGF-1 和 MSTN 即是形成肌肉成長平衡 (homeostasis) 二個最重要的調節因子 (Matsakas & Diel , 2005; Goldspink, 2005)。. 肌纖維母細胞 (fibroblasts) 和造骨細胞 (osteoblasts) 的機械訊號 (mechanical signals) 是影響肌肉和骨骼細胞的基因表現重要的因素，Goldspink 等 (1992) 以電流刺激兔子之肌肉，發現可以快速增加肌肉量，而電流刺激 (類似運動訓練造成的骨骼肌收縮) 的肌肉部位可見到這些機械訊號 RNA 轉錄表現，而休息部位肌肉則無，因此認為透過運動產生之肌肉肥大現象是局部而非全身性的。除此之外，Goldspink 等人也以序列分析方法，將肌肉肥大的肌纖維 mRNA 反轉為 cDNA 後，發現其 cDNA 也是 IGF-1 的一種選擇性剪接 (雖然其 3’端的 exons 和肝性或全身性的 IGF-1 不同)，證實肌肉也有 IGF-1 之表現，因此將這個異構物定名為 IGF-1Ea。不過在命名過程發現，當要將 IGF-1Ea 應用到其他非肝性組織時遇到問題，因為在老鼠身上會形成另一種異構物 (IGF-1Eb)，而在人體又會形成另一種異構物 (IGF-1Ec)，雖然這些異構物都來自相同基因，但特質各異，為了區別這個特別是由機械敏感性 (mechanosensitive) 所誘發之基因，將其定名為機械生長因子 mechano growth factor (MGF)。MGF 異於一般 IGF-1 的結構，是在 IGF-1 序列中第 5 個 exon 剪接成 MGF，這個特異性的結合蛋白會結合其他 IGF-1 異構物的羧基肽 (carboxy peptide) 序列來穩定整個成長因子。當運動後，IGF-1 會先剪接成 MGF， 24 小時左右會完全剪接成全身性的 IGF-1Ea。. IGF-1 在肌肉生成多個層面參與作用，例如衛星細胞 (satellite cell) 的活化、轉錄和轉譯 (Adams, & McCue,1998; Baldwin, & Haddad, 2002)，是骨骼肌負重誘發的肌肉肥大的重要調控。人體實驗證實，長期阻力訓練增加 IGF-I 的表達 (Hameed et. al, 2004)，而動物實驗發現長期阻力訓練的前期 (Adams, & Haddad, 1996; DeVol , Rotwein , Sadow , & Novakofski, 1990; Yamaguchi et. al, 2006) 和單次阻力訓練後 (Bamman et. al, 2001) IGF-I 的表達會增加。而等長收縮 isometric contractions (Haddad, & Adams, 2002) 或是等 12.

(22) 長收縮同時結合伸展訓練的阻力訓練 (Hill, & GoldspinK, 2003) 皆能快速提高 MGF 表現；動物實驗發現，MGF 誘發肌纖維母細胞的促增殖作用，但對於肌纖維細胞的分化作用(differentiation) 則無明顯影響，而 IGF-IEa 則是在肌肉母細胞增殖後，分化為肌小管的過程扮演重要角色 (Yang, & Goldspink, 2002)。 Goldspink 和 Yang (2001) 將 MGF 的 cDNA 插入肌肉特異性調節序列的質粒載體 (plasmid vector)，再打入老鼠肌肉，3 週後發現老鼠肌纖維橫斷面積增加 25%； Barton-Davis, Shoturma, Musaro, Rosenthal, 和 Sweeney (1998) 將全身性 (systemic type) 或肝性 (liver type) IGF-1 以腺病毒載體 (adenoviral vector) 調控的肌球蛋白輕鏈 (myosin light chain, MLC) 調節序列打入老鼠肌肉，亦發現具有同樣之效果，不過卻需 4 個月才能提升肌纖維橫斷面積 15%，Coleman 等 (1995) 和 Musaro 等 (2004) 分別以雞的 α 肌動蛋白啟動子 (α-actin promoter) 和肌球蛋白輕鏈 1 及 3 (MLC1、MLC3) 作為 IGF-1Ea 基因轉殖老鼠之序列，發現 IGF-1 對局部肌肉組織具有表現，由以上之研究可知，MGF 和 IGF-1Ea 在肌力的表現上扮演正向調節的角色。相對於 IGF-1，肌抑素 (MSTN) 是肌肉發展的負面調節因子，MSTN 是轉化成長因子 β (transforming growth factor-β, TGF-β) 的超家族 (superfamily) 的一員，主要功能是調節肌肉和骨骼之成長和分化。無論是老鼠、牛或人體實驗，去除 MSTN 功能將會提升肌肉量，而當給予肌肉萎縮蛋白缺陷 (dystrophin-deficient) 的基因轉殖老鼠肌抑素時，其肌肉再生現象將會被阻斷 (Lee,2004; Schuelke et al., 2004)。Thomas 等 (2000) 研究發現，肌抑素會抑制成年老鼠肌肉衛星細胞活化和蛋白質合成作用，同時抑制肌細胞生成作用中肌纖維母細胞之增殖。肌抑素具有劑量效應 (dose-dependent)，當在胚胎期時，肌抑素會因為骨骼肌成長而被抑制，不過當成年後，肌抑素將持續由肌肉分泌並表現。另外，肌抑素會和 propeptide 結合，在血液中以潛伏型態循環，最後被一種金屬性蛋白酶 (BMP1/Tolloid matrix metalloproteinase) 裂解後形成活潑型態，活潑的肌抑素結合本身的受器 (type II b activin receptor , ActRIIB)，透過 TGF-β 訊息路徑，調節其標靶基因的表現 (Elkasrawy & Hamrick, 13.

(23) 2010)。IGF-1 和 MSTN 對蛋白質合成分解路徑如圖 3。. 圖 3. 運動調控 IGF-1 和 MSTN 對蛋白質合成分解路徑簡圖。SMAD2/3: stimulate atrogene transcription 2 & 3; UPS: ubiquitin-proteasome system。資料來源：Skeletal muscle wasting in cachexia and sarcopenia: Molecular pathophysiology and impact of exercise training. Bowen, T. S., Schuler, G., & Adams, V. (2015). Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle, 1(1), 9-21. 許多研究證實，無論是長期或短期的阻力訓練 (Haddad & Adams, 2002)，甚至是單次的急性阻力運動 (Kim, Cross, & Bamman, 2005)，皆會降低人體肌抑素的表現，而在動物模式中，不只是阻力訓練，甚至耐力訓練也會降低肌抑素的表現 (Matsakas, Friedel, Hertrampf, & Diel, 2005)。Peters 等人 (2003)發現單次 acute 阻力訓練增加 MSTN mRNA 表現，特別是在運動後 3-6 小時達到高峰，因為參與單次運動的基因調節可能與多次長時間訓練不同，因此無法一體討論 (Haddad, & Adams,2002)，而且單次訓練造成的 MSTN 表現上升是短暫性的 transient increase。無運動經驗者經長期阻力訓練結束後立即取得肌肉樣本的分析，也發現肌肉 MSTN mRNA 表現上升 (Willoughby, 2004) 。不過 Raue , 14.

(24) Slivka , Jemiolo , Hollon , & Trappe (2006) 的研究，發現年輕 (18-30 歲) 和年老女子 (80-89 歲) 經過中等強度阻力訓練 4 小時後 MSTN mRNA 表現卻是下降的，代表單次運動訓練反應仍不明，因此推論 MSTN mRNA 的變化僅能代表蛋白質表現的變化，且是受酵素的活化(enzymatic activation) (Wolfman et. al, 2003)。根據以上之研究，證實阻力訓練誘發肌肉肥大的基因機轉是降低肌肉成長負向調節因子 (MSTN) 之表現，同時提升正向調節因子 (IGF-IEa, MGF) 之表現所致，本研究期望透過大鼠負重攀爬之阻力訓練再次檢驗此一機轉，同時探討北蟲草攝食的介入，是否改變肌肉生長因子之表現。. 第二節. 冬蟲夏草之相關文獻. 冬蟲夏草學名為 Cordyceps sinensis，是屬於微生物界真菌類蟲草屬的菇蕈，可分有性型 (生殖) 和無性型2種；有性型係依賴孢子形成菌絲後再長成子實體，而無性型則是直接由菌絲繁殖成菌絲。目前世界上已發現同屬「蟲草屬」的蟲草已有380種之多，其中在中國已發現的超過60餘種，例如西藏蟲草、北冬蟲夏草、蟬花、香棒蟲草、古尼蟲草、珊瑚蟲草…等等。雖然已發現的品種繁多，但其中具有藥用價值的品種並不多，比較具有代表性的2個品種是西藏蟲草 (有時直接稱冬蟲夏草) 與北冬蟲夏草 (Cordyceps militaris)。基本上北蟲草與西藏蟲草具有相同的藥理功能與臨床效果，西藏蟲草由真菌 Cordyceps sinensis 感染蝙蝠蛾的幼蟲所形成，而北冬蟲夏草則由真菌 Cordyceps militaris 感染鱗翅目昆虫的蛹形成。此類幼蟲或是蟲蛹蟄伏於泥土中，於夏季時，飄浮於空中的冬蟲夏草孢子會寄生其上，入侵的菌絲在冬季會形成休眠菌絲狀之組織體，其外表狀似僵硬的死蟲，故稱之為「冬蟲」；隔年春末夏初，幼蟲或是蟲蛹頭部會長出棍棒狀、黃褐色、外觀像草芽的子實體，稱之為「夏草」（圖4）。. 15.

(25) 西藏蟲草. 北冬蟲夏草. 圖4. 西藏蟲草（左）和北冬蟲夏草（右）資料來源：Mucho Herb Biotech Co., LTD網站 http://www.muchoherb.com/CF_sec01.html. 蟲草的化學組成包含了30%蛋白質、9%脂肪、25%碳水化合物、6%灰份及10%水份 (Hsu, Shiao, Hsieh, & Chang, 2002)，從化學成分分析發現，蟲草的子實體萃取物富含超過10種以上的核苷成分，包含腺嘌呤、腺核苷 (adenosine)、鳥糞嘌呤、鳥糞核苷 (guanosine)、纖維核 (inosine)、次黃嘌呤 (hypoxanthine)、胸腺嘧啶、尿嘧啶及蟲草素 (cordycepin)等，此外，還有蟲草酸 (cordycepic acid)、蟲草多醣 (cordycepy polysaccharide)、D-甘露醇 (d-mannitol)、過氧化物歧化酶、麥角甾醇 (ergosterol)、類胡蘿蔔素、維生素、硒、鋅、30多種無機微量元素及多種胺基酸 (Li, Yang, & Tsim, 2006)，其中，學術研究上最重視的是蟲草素和蟲草多醣的成分活性。北蟲草之蟲草素較西藏蟲草高出60倍，且蟲草酸和蟲草多醣體也分別高出1.5倍 (Zhu, Halpern, & Jones, 1998a; Zhu, Halpern, & Jones, 1998b)，所以台灣目前用於臨床實驗及藥用研究都是以北蟲草為主。. 蟲草在科學上的研究，已被證實的功能包含：一、提升SOD活性，降低脂質過氧化作用，增加自由基清除能力，減低氧化傷害 (王靖雅，2010；簡瑞涓，2010；莊曉莉、李祥麟和黃檀溪，2003)。二、黃芪和蟲草複方降低血液中總膽固醇、三酸甘油脂、低密度脂蛋白膽固醇，提升高密度脂蛋白膽固醇濃度，降低罹患心血管疾病因子 (蔡九英等，2004；Zhu, Halpern, & Jones, 1998a)。三、蟲草素、蟲草多醣體能夠抑制腫瘤細胞 16.

(26) 株 K562、Vero、Wish、Calu-1、Raji、Jurkat、WM-1341、HL-60、RPMI-8226、U937 等的生長 (Bok, Lermer, Chilton, Klingeman, & Towers, 1999; Kuo et al., 1994)，提高老鼠存活時間和存活率 (陳永佳，2002；Chiu et al., 1998; Zhu, Halpern, & Jones, 1998a)。四、增加小鼠肝臟重量，改善肝臟 Kupffer 細胞之吞噬功能，提升IL-1、IFN、TNF的能力，增加肝臟功能 (Liu, Zhu, Huang, & Liu, 1996)。五、降低老化老鼠之老化總分，無論是被動或主動迴避實驗皆提升學習記憶能力，降低腦部β類澱粉蛋白的沉積並延緩老化 (王靖雅，2010)。六、可以促進大鼠胰島素分泌和改善胰島素耐受性，提升葡萄糖代謝功能和胰島素敏感度，改善糖尿病 (黃鈺玲，2008；Zhao et al., 2002；Zhu, Halpern, & Jones, 1998a)。七、抑制主動脈內皮細胞形成斑塊和血小板凝集，降低血壓和心跳率，增加血管舒張活力和動脈血流量，強化心臟血管的維護 (Chiou, Chang, Chou, & Chen, 2000 ; Mei et al., 1989; Zhu, Halpern, & Jones, 1998b)。八、葛根與蟲草複方可以改善摘除卵巢雌鼠之骨重量、骨密度和骨鈣含量，有效預防骨質疏鬆症 (姚紅、黃少華、蘇子仁和溫娜， 2005)。九、改善 Adriamycin 引起之腎功能衰竭，包含促進血紅素生成，改善蛋白尿，減輕腎絲球傷害，維護腎臟功能 (李立人，1996)。十、提高大鼠週邊血液與脾臟 T helper 細胞，提升淋巴球細胞存活率，提高 T helper/T suppressor 比值，降低細胞之免疫抑制作用 (Cheng, 1992)，促進人類血液單核細胞 (mononuclear cells) 產生IFN-γ、TNF-α和 IL-1，活化細胞株 U937 細胞的成熟、分化與吞噬能力，改善免疫系統的功能 (Zhu, Halpern, & Jones, 1998b)。十一、提升未成熟小鼠血液睪固酮濃度，增加小鼠性成熟度，推論可以提升精子數量，增加睪丸造精能力，改善性能力 (Huang, Leu, Liu, Sheu, & Huang, 2004)。. 17.

(27) 第三節. 蟲草攝食與運動表現之相關文獻. 一、蟲草攝食與耐力運動表現. 1993年世界田徑錦標賽，中國女子田徑隊一舉刷新3項高懸多年的中長距離世界紀錄，神秘而古老的東方草藥「冬蟲夏草」一瞬間在西方世界暴紅，許多針對冬蟲夏草的生理或生化研究接踵而來，這些研究大都是針對蟲草與耐力運動表現的相關，有些是探討蟲草對運動員葡萄糖代謝的功能 (Colson et al., 2005)，有些是探討蟲草改善人體通氣能力 (ventilation capacity) ( Xiao, Huang, & Chen, 1999)，有些是降低因高強度運動造成氧化傷害的抗氧化功能 (Kumar et al., 2011)，有些是增加紅血球和血紅素，提升肌肉和組織攜氧功能，進而增進耐力性運動表現或延遲疲勞的發生 (Li, Chen, & Jiang, 1993)，也有一些是探討蟲草提升運動員血管擴張能力 (vasodilation) ( Zhu, Halpern, & Jones,1998a &1998b)，或是增加紅血球ATP的生成、多醣體誘發脂肪酸利用率，提升能量代謝，從而增進耐力運動表現 (江俊逸，2002；Kumar et al., 2011；Dai, Bao, Xu, Cooper, & Zhu, 2001)，期望透過這些生理改變提升耐力運動成績。. 在人體實驗中，大多是以運動表現和通氣能力探討蟲草攝食之功能， Hiyoshi, Akasu, Yoshisugu, 和 Fujiwara (1996) 長期給予運動選手冬蟲夏草攝食，發現蟲草改善長距離運動選手運動表現，可惜並無直接生理或生化證據支持；Zhu和Rippe (2004) 研究指出 ‧ 12週蟲草攝食，顯著提升非運動員之攝氧峰值 (VO2peak)、功率輸出 (work output) 和縮短1英里走路時間；另外，持續6週 (每天3克) 和12週 (每天3次，每次333 mg) 的蟲草發酵萃物攝食，提升健康老年人通氣閾值 (ventilatory threshold, VT) 和疲勞耐受性 (Yi, Xi-zhen, & Jia-shi, 2004; Chen, Huang, & Huang, 2010)；也有研究支持6週蟲草攝食提升老 ‧ 年人VO2 max和無氧閾值 (Xiao, Huang, & Chen, 1999)；Nagata, Tajima, 和 Moriyasu (2002)以及Nagata, Tajima, 和 chida (2006) 給予受試者每天0.5 g蟲草之攝食，持續2週後 ‧ ‧ ‧ 實施單次衰竭運動，發現蟲草攝食降低年輕男子恢復期VO2、 VCO2、VE和乳酸堆積， 18.

(28) 其尿液中兒茶酚胺 (catecholamine) 增加，皮質醇降低，顯示蟲草對於衰竭運動後之能量利用和抗疲勞獲得改善。. 不過，也有部分研究認為蟲草對於有氧能力和耐力運動表現並無顯著之影響，這些研究發現無論是蟲草或蟲草相關製品攝食，皆無法增加自由車選手能量代謝或運動成績 (Colson et al., 2005; Herda, Ryan, Stout, & Cramer, 2008)；Earnest等 (2004) 以14天蟲草與 ‧ 紅景天 (Rhodiola rosea) 複方商業產品給予自由車選手攝食，其對VO2peak、VT、功率輸出峰值 (peak power output)、心跳峰值 (peak heart rate)、衰竭時間皆無顯著影響；Parcell, Smith, Schulthies, Myrer, 和 Fellingham (2004) 實施5週，每天3克之蟲草膠囊攝食，對自 ‧ 由車選手之VO2peak、VT或運動表現亦無明顯改變。. 由以上研究發現，支持蟲草提升運動表現之人體實驗，其受試者大都是非專業運動員或老年人，而以運動員為受試對象之結果較不一致，其原因可能是運動員的代謝能力和通氣反應因高強度運動訓練已達顛峰，因此進步幅度不多。而在動物實驗模式中其結果較一致，無論是口服蟲草菌絲碎片溶液 (8天，每天每公斤體重150mg) (Koh, Kim, Kim, Song, & Suh, 2003) 或蟲草多醣體 (21天，每天每公斤體重200mg) (Li & Li, 2009) 皆能提升大鼠游泳衰竭時間，並延緩疲勞和降低壓力 (改變壓力指標：腎上腺、脾臟、胸腺、甲狀腺之重量)；8週蟲草菌絲體灌食 (每天每公斤體重132.5 mg)，也顯著增加大鼠跑步持續時間 (吳銘芳、呂旭峰、吳龍源、葉明陽和敖曼冠，2011)。. 從生物能量 (bioenergy) 的角度分析，口服蟲草四週，每天每公斤體重200 mg，增加一般和貧血大鼠肝臟血流 (hepatic blood flow) 和能量代謝 (Manabe et al., 2000)；Dai, Bao, Xu, Cooper和Zhu (2001) 給予7天，每天每公斤體重200 mg或400 mg之蟲草，分別提升老鼠肝臟穩定狀態ATP 12.3%和18.4%；Guo等 (2010) 的研究則認為蟲草可以增加能量代謝和運動持續時間，可能是碳水化合物 (約佔45-51％) 和蟲草多醣體可以穩定血糖代謝，增加ATP的產生，此外蟲草中的重要成分「蟲草素」可以活化倉鼠肝臟AMPK。這些證據雖可提供能量運用提升的可能機轉，但以肝臟之分析無法推論其他可能更直接 19.

(29) 影響運動表現的ATP儲存組織，例如肌肉。. 最近一個以分子生物學角度所做的研究，大概可以說明蟲草提升能量使用效率的證據。Kumar等 (2011) 以大鼠為對象，每天每公斤體重200 mg蟲草灌食15天，結果單純游泳訓練組運動持續時間較控制組提升1.79倍，若同時加上蟲草攝食，其衰竭時間更高出2.9倍。以real time q-PCR方法分析，發現腓腸肌 (gastrocnemius ) 代謝調節基因 AMPK、PGC-1α、PPAR-δ的基因表現顯著增加，而這些基因表現影響的是肝醣分解、糖解作用、葡萄糖吸收、脂肪酸氧化作用等的增加 (Lin et al., 2002; Wang et al., 2004; Hardie & Sakamoto, 2006)；此外乳酸轉運調節因子MCT1 (monocarboxylic acid transporters)、MCT4和葡萄糖轉運子GLUT4 (insulin-responsive glucose transporter) 的表現增加，也提升了乳酸轉化和葡萄糖能量運用的能力；血管內皮生長因子vascular endothelial growth factor (VEGF) 表現上升，顯示血管新生作用 (angiogenesis) 的增加，明顯上調骨骼肌之代謝調節 (Kumar et al., 2011)。. 運動活化AMPK以增加耐力運動表現，是透過PGC-1α調控慢縮肌群的參與，而 PPAR-δ在骨骼肌中的表現可以提升耐力運動成績，若是服用PPARδ的增能劑 (GW1516) 加上運動訓練的刺激，其運動表現較僅有運動訓練的老鼠佳 (Narkar et al., 2008)。. 二、蟲草攝食與肌力運動表現. 蟲草與運動相關的研究大部分以耐力運動表現為主，在肌力運動表現的研究相對較少。這些少數探討肌力表現之研究，主要以蟲草攝食增加精子數量，誘發雄性激素分泌，間接增加肌肉增生，推論可能提升阻力運動表現為研究主題。. 在動物實驗模式中，攝食蟲草促使大鼠腎上腺皮質細胞分泌皮質醇 (李立仁， 1997)，而蟲草成分中之蟲草素和蟲草多醣體其結構類似促黃體生成素 (luteinizing hormone, LH)，可與LH受器結合，刺激睪固酮和皮質醇之生成。睪固酮是由睪丸間質細 20.

(30) 胞所分泌的固醇類荷爾蒙，睪固酮增加促使肌肉肝醣儲存及肌肉蛋白合成，提升氮的正平衡 (王世切，2005；Hsu, Huang, Tsai, Sheu, & Huang, 2003)，這些推論可以增加肌肉量和體重，強化肌力運動之表現；而皮質醇將脂肪組織之脂肪酸和肌肉中的氨基酸游離出來，供糖質新生使用，增加能量來源，減少體內葡萄糖消耗，可能延長耐力性運動持續時間 (黃懷玉和許美智，2000)。不過，Kumar等 (2011) 以大鼠為研究對象，給予每天每公斤體重200 mg蟲草餵食，同時以15天之游泳耐力訓練介入，結果顯示蟲草攝食無顯著增加體重或肌肉量。. 依據動物實驗之理論，人體實驗模式假設透過雄性激素的分泌可以達到提升肌力表現的結果，研究顯示蟲草攝食並無顯著改變血液中黃體生成激素及皮質醇之含量，但睪固酮含量和睪固酮與皮質醇比值在蟲草攝食後顯著增加，顯示蟲草促進肌力運動表現的可能性，而檢驗尿液中睪固酮及表睪固酮 (epitestosterone) 比值均未大於6，且表睪固酮含量未超過 200 mg/ml，均未達違反國際奧委會之禁藥規定 (劉春英，1999)；當蟲草攝食和阻力性訓練同時介入時，非運動員的最大總肌力顯著上升，不過初期 (第4週) 睪固酮濃度雖然上升12.34％，後期 (第8週) 卻降回原來水平 (黃懷玉，2001)。. 不過也有不同的研究認為蟲草對於肌力提升無顯著影響。Herda, Ryan, Stout,和 Cramer (2008) 實施7天，每天給予6顆，每顆含350 mg蟲草之複合增補劑，檢測單次肌力運動表現 (包含垂直跳、前臂反覆屈曲、腿部最大自主離心收縮和50次最大向心收縮)，其結果與控制組無顯著差異；Hsu等 (2011) 以年輕運動員為受試對象，實施8週阻力訓練和每天2.4 g之蟲草攝食，結果顯示肌力表現 (包含仰臥推舉、大腿推蹬、坐姿划船)、身體組成、血漿睪固酮濃度、血清尿素氮、肌酸酐、天門冬安酸轉氨酶 (aspartate transaminoferase) 和丙氨酸轉氨酶 (alanine transaminoferase) 等與控制組均無顯著差異。. 由以上研究發現，蟲草提升肌力運動表現之人體實驗結果較不一致，其原因之ㄧ可能是睪固酮負回饋機制之影響。睪固酮的分泌和合成是受下視丘和腦下垂體前葉調控， 21.

(31) 下視丘會釋放促性腺激素刺激腦下垂體前葉，使其分泌LH刺激萊氏細胞，萊氏細胞即製造分泌睪固酮至血中，而當睪固酮含量過高時，反而會啟動大腦負回饋機制，抑制下視丘和腦下垂體活動，使GnRH和LH無法釋放，此時血液中之睪固酮即恢復成平常值，王四切 (2005) 分析北蟲草對睪固酮生合成之影響發現，蟲草攝食第3天其睪固酮濃度皆顯著上升，但在攝食第7天後，無論高低劑量蟲草攝食組別其睪固酮濃度甚至比控制組更低。. 其次是以運動員為受試對象其結果較無表現之原因，可能是運動員的肌肉能力和機械反應因高強度運動訓練已達顛峰，因此較顯現不出其成果；再則，大部份研究是以市售之商品為補充物，其成分真實性和效用在過去文獻中也曾被質疑 (Paterson, 2008)，加上人體實驗之飲食和生活的實驗室控制性較不佳，可能都會影響結果之準確性。. 由於目前尚無以動物模式研究阻力訓練和蟲草攝食介入之文獻，若能以基因模式探討肌力表現之機轉，除了可以避免以上文獻之研究限制，還能提供蟲草攝食提升阻力運動表現更上游之證據，值得進一步研究。. 22.

(32) 第參章研究方法與步驟第一節. 研究對象. 本實驗之動物為購自國立陽明大學實驗動物中心 7 週齡之雄性 SD (Sprague -Dawley) 品系大白鼠 36 隻。SD 老鼠之外型特色為白色毛皮，頭部窄尾巴較長 (尾巴長度約與身長相當)，係源自於威斯康辛州麥迪遜的 Sprague-Dawley 農場所生產，其比威斯達大鼠 (Wistar rat) 發育成長更快。因 SD 老鼠容易取得、遺傳穩定、處理容易、聰明且適應能力強等多項優點，加上 SD 老鼠體型較大，檢體取得容易，運動訓練也較不容易死亡，因此本實驗以此品系老鼠作為對象。本實驗經國立臺灣師範大學動物試驗委員會審查通過 (附件 1)。. 第二節. 實驗設計. 將購入的大鼠依體重分籠飼養，第 1 週為適應週，適應週結束前先犧牲 4 隻大鼠作為各組前測的基本值 (以下簡稱前測)，第 2 週起依訓練和蟲草攝食之有無將 32 隻大鼠平均分為控制組、蟲草攝食組、阻力訓練組和蟲草攝食加阻力訓練組等四組，3 週後 (第 4 週結束) 各組犧牲 4 隻動物 (以下簡稱中測)，再 3 週後 (第 7 週結束) 各組動物實施一次負重測試後犧牲 (以下簡稱後測)，實驗期為期 6 週，實驗分組和流程圖如下：. 一、控制組 (control group, C)：一般飼料餵食，無運動訓練。. 二、北冬蟲夏草攝食組 (Cordyceps militaris consumption group, CM)：每天灌食 200 mg/kg 劑量之北蟲草，無運動訓練。以下簡稱蟲草組。. 三、阻力訓練組 (training group, T)：一般飼料餵食，每週 3 次之漸進負重階梯攀爬訓練。 23.

(33) 以下簡稱訓練組。. 四、蟲草攝食和阻力訓練組 (TCM)：每天灌食 200 mg/kg 劑量之蟲草，每週 3 次之漸進負重階梯攀爬訓練。以下簡稱蟲草訓練組。. 24.

(34) 第三節. 飼育環境. 本實驗動物飼養於國立臺灣師範大學之動物飼養中心，依不同實驗分組，每 3 隻飼養於同一動物飼育盒中。飼育環境之室溫設定為攝氏 22±2 ℃，溼度控制於 40-60%，光照週期為 12 小時光照，12 小時黑暗，為符合齧齒類動物夜行性習慣並兼顧飼育和訓練之方便性，採日夜顛倒模式開關燈源。每天定時於下午 2-6 時添加飼料、更換飲水及灌食蟲草 (攝食組)，每週三次清理老鼠飼育盒中之墊料和排泄物。. 飲水採水瓶餵飼，每天更換乾淨的逆滲透水，並給予自由攝食。將飼料置於飼育盒頂架，採每天更換及自由攝食方式。大鼠購入後第 1 週為適應週，測量體重後隨機均分至各實驗組，各組飲食統一為一般實驗室專用飼料及飲水，訓練組和攝食訓練組實施適應週訓練，適應週結束前確定分組後，於老鼠尾巴根部以不同顏色油性筆標記組別，並剪耳做為個數標記。每天由專人記錄其飲食及各項生活狀況，同時每週定期測量體重及記錄訓練之運動強度。. 第四節. 實驗飼料與增補物. 無攝食蟲草之組別 (C, T) 採用的飼料為實驗室專用之實驗鼠無菌顆粒狀飼料 (Laboratory Rodent Diet 5001, PMI Nutrition International, U.S.A)，採自由進食方式，每天更換並添加新飼料。有攝食蟲草的組別 (CM, TCM) 老鼠之北冬蟲夏草係採用台灣慕求生技股份有限公司所提供之北蟲草，將其子實體先切成細小碎片，加入少許水 (蟲草及水之比例為 6：1) 以機器加以磨漿，再以冷凍乾燥法製備成蟲草濃縮塊，最後再研磨成細小粉狀，即為蟲草凍乾粉末。. 本研究之預備研究 (pilot study，見本章第五節) 直接以蟲草凍乾粉末混和一般實驗室粉狀飼料餵食，並依混入比例 (0.5% 和 1%) 將劑量設定為低劑量和高劑量。餵食過程發現大鼠不喜歡蟲草之味道，容易將飼料撥出，造成劑量準確性不高，實驗結果也顯 25.

(35) 示高低劑量在骨骼肌各基因指標無顯著性差異；為求劑量之精準，參考 Kumar 等 (2011) 之研究同時修正預備研究設計，走攝食蟲草的組別 (CM, TCM) 之劑量設定以每天每公斤體重 200 mg (200 mg/kg/d) 之蟲草凍乾粉末混入飲水，以灌食器直接灌食，無攝食蟲草的組別 (C, T) 亦給予相同劑量之蒸餾水灌食，以避免因灌食產生壓力傷害的差異，有訓練的組別 (T, TCM) 於每次運動訓練前 1 小時完成灌食以避免產生訓練之干擾。. 第五節. 預備研究. 由於國內動物阻力訓練模式之研究不多，訓練器材和強度設定等之資訊不足，加上本次由慕求生技公司所提供之蟲草為新的育種，為了解劑量之設定，於正式實驗前實施阻力訓練之預備研究以確認運動強度和蟲草劑量設定的可行性。. 一、研究對象：雄性 7 週齡 SD 大白鼠 18 隻。. 二、實驗設計：本研究將 18 隻 SD 雄性大鼠均分為以下 6 組處理： 1. 控制組 (C, n=3)：7 週一般飼料餵食，無阻力訓練。 2. 低劑量蟲草組 (LCM, n=3)：7 週一般飼料加上 0.5%北冬蟲夏草萃取物 (以下簡稱蟲草萃物) 餵食，無阻力訓練。 3. 高劑量蟲草組 (HCM, n=3)：7 週一般飼料加上 1%蟲草萃物餵食，無阻力訓練。 4. 阻力訓練組 (E, n=3)：7 週一般飼料餵食，每週 3 天阻力訓練。 5. 低劑量蟲草和阻力訓練組 (ELCM, n=3)：7 週一般飼料加上 0.5%蟲草萃物餵食，每週 3 天阻力訓練。 6. 高劑量蟲草和阻力訓練組 (EHCM, n=3)：7 週一般飼料加上 1%蟲草萃物餵食，每週 3 天阻力訓練。 26.

(36) 三、飼育環境：以吊籠飼養，其餘與本章第三節所述相同。. 四、實驗飼料與增補物. 無冬蟲夏草攝食之組別 (C, E) 採用的飼料為實驗室專用之實驗鼠無菌粉狀飼料 (Laboratory Rodent Diet 5001, PMI Nutrition International, U.S.A)，採自由進食方式，每天更換並添加新飼料。有冬蟲夏草攝食組 (LCM, HCM, ELCM, EHCM) 老鼠之北冬蟲夏草係採用 Mucho Herb Biotech Co., LTD 所提供之北蟲草，培植和製備方法同本章第四節所述，分別以 0.5% 和 1% 蟲草萃取物混和一般飼料作為蟲草攝食組之劑量，劑量之選擇係參考 Kumar 等 (2011)，以老鼠每天灌食 200 mg/kg 之劑量換算而來。. 五、阻力訓練之實驗設計：與本章第六節所述相同。. 六、組織和基因指標分析：取右大腿之股直肌 (快縮肌)，其餘基因指標類型和分析方法同本章第八節。. 七、結果：各組間無論是在描述性指標 (體重和心臟重)或是肌力正負調節因子 (IGF1-Ea, MGF, MSTN) 皆無統計之差異 (無顯示)。. 八、討論：本次預備研究證實大鼠負重階梯攀爬之阻力訓練模式可行，其訓練強度亦接近大鼠負荷之極限，因此訓練模式於正式實驗時可實施。然造成結果不顯著之原因可能為：. 1.直接以蟲草凍乾粉劑融入粉狀飼料，大鼠對味道敏感，常將飼料撥出盒外，造成劑量不夠精準。. 2.取大腿股直肌分析容易取到肌膜而非肌肉。. 3.約 2/3 數量大鼠於實驗中期罹患感冒，犧牲後發現部分大鼠肺部纖維化，推論罹 27.

(37) 患黴漿菌產生之肺部浸潤，其原因可能以無木質墊料保溫之吊籠飼養，且大鼠屬近親繁殖，其免疫能力較低，飼育環境應加強清潔和滅菌。. 4.研究者對 SqRT-PCR 分析方法不夠純熟，樣本處理過程過久，產生樣本的降解，或是微量滴管 (pipet) 使用的穩定度不足造成結果誤差。. 九、修正建議：. 1. 設定蟲草劑量為 200 mg/kg/day，改以灌食方法，希望能更精準控制老鼠攝食劑量。. 2. 改取小腿腓腸肌和比目魚肌，除可避免誤取肌膜外，亦可比較快縮肌和慢縮肌間之差異。. 3. 改以飼育盒飼養，實驗前以消毒水和酒精清潔大鼠飼育環境，清潔空調之濾網，降低傳染風險。. 4. 增加實驗操作機會，熟練分析技巧。. 第六節. 阻力訓練和負重測試之實驗設計. 一、阻力訓練設計：. 參考 Duncan, Williams 和 Lynch (1997) 的研究，自行研發設計大鼠專用之攀爬架 (圖 5) 作為阻力訓練工具。攀爬架以不鏽鋼材製作 (不易使大鼠受傷)，架高 60 cm，雙邊各做一可拆卸之攀爬階梯 (可拆下清洗並提供 2 隻大鼠同時操作)，階梯規格 48 cm× 15 cm，階梯間隙 1 cm，共 40 階，頂置一托盤 (56 cm×21 cm)，訓練時放置顆粒飼料於托盤，養成大鼠攀爬之動機和慣性，同時提供訓練時組間休息 (set rest) 之處所。 28.

(38) 圖 5. 大鼠攀爬架及實際攀爬圖. 訓練前，將大鼠置於頂部托盤自由攝食並習慣高度 5 分鐘；訓練時，將老鼠置於階梯架底部，老鼠因其好奇天性會主動攀爬至頂部，無需以飢餓、沖冷水、吹氣、電擊等不自然方式刺激，若老鼠無攀爬動作，以手輕拍尾部或輕推軀幹即可。. 運動強度以漸進的攀爬組數及增加尾部鉛錘重量來調整負荷。1 次攀爬 (以下稱 1 次反覆，1 repetition) 約為 2-8 秒，到達頂部休息 10 秒後執行下一次反覆，8 次反覆設定為 1 組 (1 set)，組間休息為 2 分鐘。以老鼠體重之比例作為負荷強度之依據，將相對應重量之金屬墊片 (中有圓孔) 以膠帶黏合，將老鼠尾巴穿入圓孔後，以塑膠螺旋式髮帶固定於其尾巴根部，既可分散壓力防止老鼠尾巴受傷，也不會妨礙老鼠攀爬動作。. 二、阻力訓練模式：. 大鼠購入後，參與訓練之組別 (T, TCM) 先進行1週7天之運動適應，每天進行8次反覆的無負重攀爬訓練，訓練時間及休息時間皆不受限制。實驗第1週起，參考Duncan, 29.

(39) Williams和Lynch (1997) 的實驗和本研究之預備研究，尾部綁負15% 體重之金屬墊片以為負荷，實施每週3次、每次2組、每組8次反覆的攀爬，每次反覆時間約為2-8秒 (若8 次反覆操作時間總和超過5分鐘可視為完成1組)，在第2週結束前，應能完成2組、25%體重負重、每組8次反覆的攀爬。第3週起至第6週，負重每週漸進增加5%體重或組數，直至無法完成4組時，負重不再增加。組間休息時間為2分鐘，反覆間休息10秒，每次訓練前以2組、每組5次無負重攀爬作為暖身活動，每次訓練結束後，以1組5次無負重攀爬作為緩和活動 (訓練模式表如表1)。表1. 大鼠漸進式負重階梯攀爬阻力訓練模式表週次. 負重 (%). 反覆次數 (R). 組數 (S). 暖身運動. 緩和運動. 適應週. 0%. 8. 1. 1. 15%. 8. 2. 5R×2S. 5R×1S. 2. 25%. 8. 2. 5R×2S. 5R×1S. 3. 30%. 8. 3. 5R×2S. 5R×1S. 4. 35%. 8. 3. 5R×2S. 5R×1S. 5. 40%. 8. 4. 5R×2S. 5R×1S. 6. 45%. 8. 4. 5R×2S. 5R×1S. 三、負重測試：. 第6週結束前，各組實施一次負重測試作為運動表現之依據。因無阻力訓練的組別 (C, CM) 無負重攀爬經驗，為避免欠缺技巧學習影響負重測試表現，實驗最後一週，此二組每天實施一次1組1反覆漸進負荷攀爬練習 (負重重量由第一天20%體重每天增加 5%，直至第七天50%體重)。. 負重測試的實施，第一次皆以大鼠100%體重為負荷，依其能否完成1次攀爬，第二次增減5%體重繼續測試 (可完成者增為105%，無法完成者減為95%，依此類推)，直至大鼠能負荷最大重量完成1次攀爬為其負重成績，每次調整負重至少維持休息30分鐘以上間隔，以確保動物能測得實際肌力表現，取大鼠最重的負荷和體重比值作為運動表現。 30.

(40) 第七節. 動物犧牲和組織摘取. 所有組別於負重測試 72 小時後犧牲。犧牲前一天下午 8 點後即停止供食，正常供水。犧牲前一天將所有犧牲工具以酒精和焦碳酸二乙酯水 (diethylpyrocarbonate H2O，簡稱 DEPC 水) 消毒和去 DNA，所有放置檢體的微量離心管 eppendorf 和檢體盒皆事先標號，工作人員事前分工。. 犧牲日各組老鼠秤重後，個別置於乙醚桶中麻醉，再以二氧化碳將動物窒息後犧牲，接著使用組織剪刀剪取右後腿比目魚肌 (soleus) 及腓腸肌，分切成 5mg 後分別放入微量離心管，置於液態氮桶中急速冷凍，將各組織有系統的分開、冰凍，並儲存於-80 ℃冰箱直至基因分析。. 第八節. 組織及基因指標分析. 本研究摘取之肌肉組織依其部位特性區分為腓腸肌 (快縮肌) 和比目魚肌 (慢縮肌) ，以 SqRT-PCR 方法分析老鼠於訓練和攝食處理後之阻力運動表現基因 (骨骼肌肌力正負調節基因) 指標。依分析類型及方法分述如下：. 一、分析類型 1. 基本指標：體重 (body mass, BM)、相對負重運動表現 (犧牲前負重測試成績/ 體重)。 2. 肌力發展因子基因指標： (1). 肌力發展正向調節基因：IGF-1Ea、MGF. (2). 肌力發展負向調節基因：MSTN. 31.

(41) 二、 SqRT-PCR 分析方法. 本研究以半定量反轉錄酶-鏈鎖聚合反應 (SqRT-PCR) 分析骨骼肌中目標基因之表現情形，使用相關基因之引子對序列是利用 Vector NTI 9.0 軟體 (Thermo Fisher Scientific) 所設計，由波仕特生物科技股份有限公司 (臺灣，臺北市) 所合成，如表 2。表2. 肌肉生長因子相關基因之引子對序列基因. Primer sequences. GADPH. 5’-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC-3’ 5’-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3’. IGF-1 Ea. 5’- GGA GGC TGG AGA TGT ACT GTG CT-3’ 5’- TGT GTT CTT CAA GTG TAC TTC CTT CTG -3’ 5’- GGA GGC TGG AGA TGT ACT GTG CT -3’ 5’- TCC TTT GCA GCT TCC TTT TCT TG -3’ 5’- TGC TGT AAC CTT CCC AGG ACC A -3’. MGF MSTN. 5’- GTG AGG GGG TAG CGA CAG CAC -3’ 1. RNA 萃取 (1)以大型組織擊碎機將經凍於液態氮之肌肉組織擊碎後，加入 1 ml 的 TRIzol Reagent (Thermo Fisher Scientific) 至微量離心管中，均勻混合後置於室溫下 5 分鐘，使 TRIzol Reagent 與樣品充分作用。. (2)加入 0.2 ml 的三氯甲烷 (chloroform)，劇烈搖晃 15 秒後，放置室溫 2 到 3 分鐘。 (3)將樣品在 4℃下以 12,000 × g 的速度，離心 15 分鐘，將有機層與水層分離開。 (4)取上層水層至新的微量離心管中，並加入 0.5 ml 異丙醇 (isopropanol) 後放置室溫下 10 分鐘。. 32.