圖 3-1 使用 PCR(A) 和 real-time PCR；(B) 偵測 BBTV 之 專一性試驗。
組織培養
兩種優良甘藍品種之小孢子培養與雙單倍體生 產 甘藍是臺灣重要的葉菜類蔬菜，利用小孢子培養 生產雙單倍體（doubled haploid, DH）植株，可大幅 縮短 F1育種所需之純系親本的育成時間。本研究針 對「初秋」和「臺中 2 號」兩個優良甘藍品種，比較 供試植株開花時之栽培溫度、花蕾所在之花序位置以 及小孢子處理溫度等條件對改善小孢子胚分化率之影 響。研究結果顯示「初秋」和「臺中 2 號」甘藍開花 株在 15℃ /10℃（日 / 夜）栽培溫度下較 20℃ /15℃
表現出較高之小孢子生成量（表3-1），此外取自側 生花序之花蕾較取自頂生花序之花蕾亦表現出較高之 小孢子生成量（表3-2），但開花株栽培溫度以及花 蕾所在之花序位置兩因子對小孢子的胚形成率並無明 顯之影響效果。兩品種中以「初秋」的胚分化力較 高，將「初秋」甘藍小孢子以 32℃處理 1~3 天，小 孢子之胚分化率在 1~2 天處理間差異不大，但處理延 長至 3 天則會導致胚分化率下降（表3-3）。將「初 秋」甘藍小孢子處理溫度從 32℃提高到34℃處理 1 天，胚分化率明顯由 0.2 胚 / 皿提高至 2.0 胚 / 皿（表 3-4）。以流式細胞儀檢測「初秋」甘藍的DH 植株 比率為43.1%（表3-5），續將單倍體小苗以1.2 mM 秋水仙素處理 2 天，染色體倍加比率（2N）為 38.5%
（表3-6）。
表 3-1 開花株之栽培溫度對甘藍小孢子胚形成之影響z Cultivar Blooming
temperature(℃ ) Bud numbers Microspores /buds Embryos/plate
K-Y Cross 20/15 48 17 x104 1.33 ay
15/10 48 19 x104 1.34 a
Taichung No. 2 20/15 50 14 x104 0.03 b
15/10 50 15 x104 0.17 b
z Microspore culture medium was 1/2 NLN-13 with 4 × 104microspores per mL.
y Means with different letters in the same column are significantly different (P < 0.05) by LSD test.
表 3-2 取自頂生花序或側生花序之甘藍花蕾對小孢子胚形成之影響z
Cultivar Inflorescence position Bud numbers Microspores/ buds Embryos/ plates
K-Y Cross Terminal 35 9.5 x104 1.07 ay
Axillary 48 19.0 x104 1.34 a
Taichung No. 2 Terminal 25 9.8 x104 0.04 b
Axillary 48 14.5 x104 0.17 b
z,y same as Table 3-1.
(A)
生 物 技 術
孤挺花組織培養種苗量化繁殖技術開發 利用鱗 莖直徑約3~5 mm 之組培苗作為培植體，進行 1.5~9%
蔗糖與0~2 gL-1活性碳濃度組合之複因子試驗，結果 顯示 6% 蔗糖配合1~2 gL-1活性碳處理，對於增加組 培苗之鱗莖直徑與鮮重最為有利，分別可達8.0 mm 與 1.73~1.75 g，但是蔗糖濃度達 9% 時，對組培苗 之生長會產生抑制效果。綜合而言，提高蔗糖濃度 至 6%，可顯著提高孤挺花組培苗之鱗莖直徑、鮮重 及根數，同時添加適量活性碳則具有協同增效蔗糖之
表 3-3 溫度處理天數對甘藍小孢子胚形成率之影響z
Cultivar 32℃(days) Bud numbers Embryos / plates
K-Y Cross 1 16 0.50 ay
2 16 0.45 a
3 16 0.08 ab
Taichung No.2 1 19 0.10 ab
2 19 0.00 b
3 18 0.00 b
z , y same as Table 3-1.
表 3-4 不同溫度處理 1 天對甘藍小孢子胚形成之影響z
Cultivar Treatment(℃ ) Embryos / platey
K-Y Cross 32 0.20 b
34 2.00 a
Taichung No.2 32 0.11 b
34 0.00 b
z , ysame as Table 3-1.
表 3-5 甘藍小孢子再生植株以流式細胞儀檢測之倍體數表現
Cultivar Total tested plants Ploidy level No. of plant（%）
C 2C 4C Chimeraz
K-Y Cross 58 17(29.3%) 25(43.1%) 2(3.4%) 14(24.1%)
Taichug No.2 2 0(0%) 2(100.0%) 0(0%) 0(0%)
z Chimera plants include C+2C and 2C+4C.
表 3-6 「初秋」甘藍單倍體以 1.2 mM 秋水仙素處理後之再生植株以流式細胞儀檢測之倍體數表現 Cultivar Total tested plants Ploidy level
No. of plant（%）
C 2C 4C Othersz
K-Y Cross 13 2(15.4%) 5(38.5%) 2(15.4%) 4(30.8%)
z Others include chimera plants.
效果 (表3-7)。將「紅獅」1/4 鱗莖，以 65.0 μM GSH 或 32.5 μM GSH 溶液浸泡 2 hrs，再接種於含有 3% 蔗 糖、1 mgL-1 BA 與 0.1 mgL-1 NAA 之 MS 固態培養基，
每個組培鱗莖於照光條件培養8 wks 後，平均可誘得 12.3 苗，為最佳增殖條件 (表3-8)。利用不同濃度穀 胱甘肽溶液噴施「紅獅」出瓶苗，於溫室環境栽培 32 wks 後之結果顯示，全株鮮重以 162.8 μM GSSG 處 理之36.4 mg 為最高，顯著高於其他處理與對照組 (表 3-9、圖3-2)。
生 物 技 術
表 3-7 蔗糖與活性碳濃度對「孤挺花台農 1 號」組培苗生長之影響z
Su(gL-1) AC(gL-1) Bulb Diameter(mm) Fresh weight(g) Roots number
15 0.0 4.2±0.1 e y 0.32±0.0 g 1.8±0.5 g
15 0.5 4.2±0.1 e 0.62±0.1 f 5.3±1.6 cd
15 1.0 4.7±0.5 e 0.75±0.0 ef 4.1±0.3 def
15 2.0 4.7±0.3 e 0.75±0.1 ef 3.1±1.0 f
30 0.0 4.7±0.3 e 0.35±0.0 g 3.8±1.3 ef
30 0.5 5.6±0.5 e 1.27±0.2 d 9.0±1.1 a
30 1.0 5.8±0.3 d 1.29±0.3 d 6.8±1.3 b
30 2.0 6.8±0.8 bc 1.54±0.2 bc 7.1±0.8 b
60 0.0 4.8±0.4 e 0.36±0.1 g 3.1±0.4 f
60 0.5 7.4±0.9 ab 1.34±0.2 cd 9.6±1.7 a
60 1.0 8.0±0.4 a 1.75±0.2 a 9.4±0.6 a
60 2.0 8.0±0.2 a 1.73±0.1 ab 8.8±0.4 a
90 0.0 4.5±0.1 e 0.22±0.0 g 1.3±0.5 g
90 0.5 6.5±0.6 c 0.70±0.1 ef 6.3±0.6 bc
90 1.0 6.6±0.4 c 0.88±0.2 e 6.1±0.7 bc
90 2.0 6.8±0.4 bc 0.75±0.0 ef 5.0±1.0 cde
Su ***x *** ***
***
***
AC *** ***
Su × AC *** ***
z In vitro bulb explants(about 4 mm in diameter)were cultured on MS medium containing 1 mg L-1 BA and 0.1 mg L-1 NAA in combination with various concentrations of sucrose and activated charcoal(AC)for 10 wks of culture. Each treatment had 4 replications, and 3 explants were used in each replication.
y Means in the column followed by different letters are significantly different at the 5% level by LSD test.
x F-test of ANOVA. *, ** and ***, significant at 5%, 1% and 0.1%, respectively.
表 3-8 照光或黑暗條件下穀胱甘肽對孤挺花「紅獅」組培苗增殖之影響z
Illumination Immersion Treatment (conc.) 8 wks 12 wks
Light 1 hr Control 10.7±0.3 bcy 12.3±0.9 bcd
GSH 32.5 μM 8.7±0.3 de 9.3±0.3 gh GSH 65.0 μM 9.7±0.9 cd 11.7±0.3 cde GSSG 16.2 μM 9.3±0.3 cd 11.0±0.2 def GSSG 32.5 μM 12.0±0.6 ab 12.7±0.3 bc
2 hrs Control 10.0±0.6 cd 11.7±0.3 cde
GSH 32.5 μM 10.3±0.3 c 11.0±0.6 def GSH 65.0 μM 12.3±0.9 a 14.7±0.8 a GSSG 16.2 μM 9.3±0.7 cd 10.7±0.3 efg GSSG 32.5 μM 12.3±0.3 a 13.7±0.3 ab
Dark 1 hr Control 7.3±0.3 ef 7.3±0.3 ij
GSH 32.5 μM 7.3±0.9 ef 8.0±0.6 hi GSH 65.0 μM 7.3±0.3 ef 9.7±0.7 fg GSSG 16.2 μM 7.0±0.1 fg 8.0±0.1 hi GSSG 32.5 μM 7.3±0.3 fb 8.0±0.2 hi 2 hrs Control 6.7±0.9 fb 7.3±0.3 ij GSH 32.5 μM 6.7±0.7 fb 6.7±0.9 ij GSH 65.0 μM 6.0±0.6 fg 6.0±0.6 j GSSG 16.2 μM 5.7±0.9 g 6.7±0.2 ij GSSG 32.5 μM 6.7±0.3 fg 6.9±0.3 ij
z One-quarter bulb explants were immersed into autoclaved water(control), GSH or GSSG solution for 1 hr or 2 hrs, and then inoculated on MS medium containing 3% sucrose, 1 mg L-1 BA and 0.1 mg L-1 NAA under light or dark condition for 8 and 12 wks of culture.
y Means of plantlets per bulb in each column followed by different letters are significantly different at the 5% level by LSD test.
生 物 技 術
圖 3-2 孤挺花「紅獅」出瓶組培苗於溫室環境下生長達32 wks 之植株生長情形。組培苗出瓶種植於混合介質 ( 泥炭苔：蛭
石：珍珠石 =2：1：1，體積比)，於種植後第 8 wks 開始處理，每 4 wks 噴施純水 (Control)、GSH(162.8 µM、325.7 µM 及 651.4 µM；GSH-a、-b、-c) 及 GSSG (81.4 µM、162.8 µM 及 325.7 µM；GSSG-a、-b、-c) 直到種植後第 25 wks，共噴 施處理 5 次，直到栽培32 wks 後進行調查；每處理 3 重複，每重複 5 株，每 15 株噴施 50 mL 處理溶液。大苗 (Larger) 與 小苗(Smaller) 種植達 32 wks 後，植株之生長與發根情形。Bars=10 cm。
表 3-9 穀胱甘肽對溫室環境孤挺花「紅獅」植株鱗莖直徑與鮮重之影響z
Bulb size Treatment Concentration (μM) Diameter of bulb (mm) FW of bulb (g) FW of leaf (g) Total fresh weight (g) Larger Control 0 25.3±0.4 abcy 14.6±1.0 ab 16.8±0.2 fg 31.4±1.0 bcd
GSH 162.8 26.0±0.3 ab 15.8±0.5 a 17.3±0.1 bc 33.1±0.5 b GSH 325.7 26.1±0.3 ab 15.0±0.7 ab 18.2±0.0 cde 33.2±0.8 b GSH 651.4 24.5±0.8 bcd 12.7±0.3 cd 13.7±1.2 h 26.4±1.3 g GSSG 81.4 23.1±1.3 cde 11.9±0.7 de 15.7±0.4 g 27.6±1.2 fg GSSG 162.8 27.4±1.2 a 16.3±0.5 a 20.1±0.2 ab 36.3±0.6 a GSSG 325.7 25.3±0.7 abc 13.9±0.1 bc 16.2±0.1 fg 30.1±0.2 cde Smaller Control 0 22.8±0.7 de 12.2±0.7 cd 20.4±0.5 a 32.6±1.1 bc
GSH 162.8 23.7±0.4 cde 12.7±0.2 cd 18.8±0.3 bc 31.4±0.2 bcd GSH 325.7 22.6±0.6 de 11.6±0.7 de 17.1±0.6 ef 28.7±0.8 efg GSH 651.4 21.7±0.7 e 10.5±0.7 e 18.5±0.6 cd 29.0±1.3 ef GSSG 81.4 22.8±1.3 de 11.0±0.6 de 18.6±0.2 c 29.7±0.6 def GSSG 162.8 23.5±1.1 cde 12.6±0.6 cd 19.4±0.2 abc 32.1±0.8 bcd GSSG 325.7 23.5±0.6 cde 12.2±0.3 cde 20.0±0.3 ab 32.2±0.1 bc
z In vitro rooted larger(about 12 mm in bulb diameter)and smaller(about 8 mm in bulb diameter)plantlets of H. hybridum‘Red Lion’
were planted on a mixed substrate (peat moss: vermiculite: perlite =2: 1: 1, v/v/v) for 8 wks of culture, then treated 5 times with various types and concentrations of glutathione (0,162.8, 325.7, 651.4 μM GSH and 0, 81.4, 162.8, 325.7 μM GSSG) from week 9th to week 25th per 4 wks, and investigated until 32 wks of cultivation. Each treatment had 3 replications, and 5 plants per replications, 50 ml solution was sprayed on 15 plants.
y Means in the column followed by different letters are significantly different at the 5% level by LSD test.
生 物 技 術
薑組織培養種苗量化繁殖技術開發 本研究利 用「廣東薑」與「竹薑」根莖之新生芽體為培植體，
建立其組織培養苗大量繁殖方式。切取長約1 cm 之 新生根莖芽體作為培植體，先利用 75% 酒精處理 30 sec 後，再以 0.6% NaOCl 消毒 15 min，培養於含有 0.4 mgL-1 BA 之 B5 固態培養基中 12 wks 後，建立無菌 培養瓶苗 (圖3-3)。將「廣東薑」與「竹薑」之組培
根莖培養於含有0.5~2.0 mgL-1 BA 與 0.1 mgL-1 NAA 之B5 固態培養基 8 wks 後，兩品種每個培植體平均 可誘得4.8~6.0 株，苗高約 1.8~2.6 cm 之組培苗，且 瓶苗具有良好之根系；提高BA 濃度至 4 mgL-1雖可 增加苗數，但苗高顯著降低；反之，對照組之組培苗 雖然較高，但其苗數顯著較少 (表3-10)。
圖 3-3 建立「廣東薑」組織培養初代培養。新生根莖芽體萌發於採自田間之根莖 (A，Bar= 5 cm)(B，Bar=2 cm)；根莖芽 體培植體培養於含有0.4 mg L-1 BA 之 B5 固態培養基4 wks 後所形成之芽體 (C，Bar=1 cm)；將此無菌芽體直接繼代於相 同組成之固態培養基達8 wks 後所形成之瓶苗增殖與生長情形 (D，Bar=1 cm)。
表 3-10 BA 濃度於固態培養下對「廣東薑」與「竹薑」組培苗增殖與生長之影響z
Plant growth regulator
No. of plantlets Plantlet height (cm)
Plantlet height
BA NAA < 2 cm 2~4 cm > 4 cm
－(mgL-1) － － (%) －
'Guang Dong'
0 0.1 4.4±0.4 c y 2.2±0.1 a 34.2±11.2 b 57.6±17.5 a 8.1±2.1 a 0.5 0.1 5.6±0.7 bc 1.8±0.2 b 32.6±12.6 b 67.4±12.6 a 0.0 b 1.0 0.1 5.4±1.1 bc 1.8±0.2 b 43.5±18.8 b 56.5±18.8 a 0.0 b 2.0 0.1 6.0±0.5 ab 1.8±0.1 b 33.8±11.7 b 66.2±11.7 a 0.0 b 4.0 0.1 7.2±0.5 a 1.3±0.2 c 71.2±10.6 a 28.8±10.6 b 0.0 b 'Chu'
0 0.1 4.1±0.4 cy 3.2±0.3 a 19.6±8.2 ab 30.4±9.3 b 50.0±1.1 a 0.5 0.1 4.8±0.4 bc 2.6±0.3 b 13.3±3.1 b 80.1±6.8 a 6.7±1.7 b 1.0 0.1 4.9±0.2 bc 2.2±0.2 bc 22.8±5.0 ab 77.2±6.4 a 0.0 c 2.0 0.1 6.0±0.6 b 2.1±0.1 cd 27.0±8.4 ab 73.0±8.4 a 0.0 c 4.0 0.1 7.7±1.8 a 1.8±0.1 d 32.1±8.1 a 67.9±8.1 a 0.0 c
z Explants were cultured on B5 medium containing various concentration of BA and 0.1 mg L-1 NAA for 8 wks. Nine explants were used in each treatment.
y Means in each same column followed by different letters are significantly different at the 5% level by LSD test.
生 物 技 術
藍紫色蝴蝶蘭育種之研究 以花寶 1 號為基礎培 養基，配合 0.1% 活性炭，1~2% 蔗糖以及 2.5%~5.0%
之香蕉與馬鈴薯添加，將所採收雜交組合CYT193、
CYT194、CYT198 果莢進行無菌播種皆可獲得實生 後代，之後藉由調整蔗糖與蔬果添加物之濃度完成繼 代培養並出瓶種植，其中雜交組合CYT193 可獲得實 生小苗124 株，CYT194 實生苗 63 株，CYT198 實生 苗 226 株 (表3-11)。CYT167、CYT177 二個藍紫色 蝴蝶蘭雜交組合可成功獲得 83~121 株實生後代 (表
3-12)，並進行藍紫色系之單株選拔，其中於CYT167
可選拔出具有金黃色花瓣與淡藍紫色唇瓣優良單株，
表 3-11 藍紫色蝴蝶蘭親本之雜交組合結果調查
雜交組合編號 藍紫色親本系統 實生苗數 胚與小苗畸形率 (%) 小苗型態與生長概況
CYT193 Phal. violacea ‘Indigo’ 母本 124 0 正常
CYT194 Phal. violacea ‘Indigo’ 父本 63 0 正常
CYT198 Phal. violacea ‘Taiwan’父本 226 0 正常
表 3-12 選拔之雜交組合 CYT167、CYT177 之實生苗藍紫花色之表現
雜交組合編號 藍紫色親本系統 實生苗數 花色表現 香氣 小苗型態與生長
概況 CYT 167 Phal.violacea‘Taiwan’ ( 父本 ) 83 金黃花瓣淡藍唇辦 濃郁 正常 CYT 177 Phal.violacea‘Taiwan’ ( 父本 ) 121 雪白花瓣藍插角 明顯 正常
表 3-13 比較 2 倍體藍紫色蝴蝶蘭 P. Siam Treasure 與誘導所得之 4 倍體植株之園藝性狀
倍體數 花徑(cm) 梗長(cm) 梗徑(mm) 葉長(cm) 葉寬(cm) 葉厚(mm)
2 倍體 3.9 a 33.7 a 2.5 b 12.2 a 4.0 a 1.6 b
4 倍體 3.9 a 19.6 b 3.2 a 8.6 b 3.6 a 2.2 a
而於CYT177 可選拔出雪白花瓣藍紫色插角與深藍紫 色唇瓣之優良單株 (圖3-4)，二者皆具有香氣，花期 在夏季，由於實生苗株尚未全數開花，爾後將繼續選 拔優良單株。經流式細胞儀檢測確定倍體數 (圖3-5) 並比較藍紫色蝴蝶蘭P. Siam Treasure 2 倍體與秋水仙 素誘導所得之4 倍體植株的園藝性狀，結果顯示 4 倍 體P. Siam Treasure 花徑雖未較 2 倍體大，但花朵質地 較佳，且植株與花梗型態則顯示出明顯差異，花梗較 粗矮，葉片較寬短、厚 (表3-13、圖3-6)。有關4 倍 體之雜交親和性尚需進一步測試。
圖 3-4 於藍紫色蝴蝶蘭雜交組合所選拔優良單株(A) 雜交編號 CYT167 苗株具有金黃色花瓣與淡藍紫色唇瓣，具濃郁香氣；
(B) 雜交編號 CYT177 苗株具有雪白花瓣藍紫色插角與深藍紫色唇瓣，具明顯香氣。
生 物 技 術
圖 3-5 利用流式細胞儀分析藍紫色蝴蝶蘭P. Siam Treasure(A)2x 倍數體；(B)4x 倍數體之圖譜。
圖 3-6 藍紫色蝴蝶蘭 P. Siam Treasure(A)2 倍體與 4 倍體之花朵與；(B) 植株形態。
白雪文心蘭組培優化 將擬原球體已分化成約 3 cm 高之「文心蘭台農 4 號 - 白雪」組培苗小苗，接種 於基本培養基為全量之MS 基本鹽類，20 gL-1蔗糖，
並添加3 gL-1 tryptone、50 gL-1香蕉和50 gL-1馬鈴薯，
每瓶接種 60 個培植體，4 重覆，分別將瓶苗放置於培 養室以及有風扇水牆之溫室等不同培養環境進行子瓶 階段之培養，培養室培養環境為溫度 25℃ ±1℃，光照 強度為 38 μMm-2s-1及14 h 光週期，12 週後進行性狀 調查。將子瓶階段之瓶苗於培養室以及水牆溫室環境 下培養，小苗生長皆良好，且無叢生狀生長不佳之小 苗，然二者培養環境間假球莖形成率、芽數、株高、葉
數、葉長、葉寬、根數以及鮮重等性狀具顯著差異( 表
3-14)。觀察植株生長型態顯示出於培養室培養之瓶苗
因光照強度較不足而稍有徒長現象，葉片較細長，葉 色黃綠，而於水牆溫室環境下光線較強，於此環境下 培養之瓶苗植株較翠綠，而且根數與葉數較多( 圖3-7)。 本研究於子瓶階段即移至水牆溫室環境中培養，評估
「文心蘭台農4 號 - 白雪」組培苗是否適應此培養環境 條件，雖瓶苗性狀部分劣於培養於培養室之瓶苗，但 植株較為精壯翠綠，且根數與葉數較多，整體小苗品 質較佳，顯示出「文心蘭台農4 號 - 白雪」組培苗應可
「文心蘭台農4 號 - 白雪」組培苗是否適應此培養環境 條件，雖瓶苗性狀部分劣於培養於培養室之瓶苗，但 植株較為精壯翠綠，且根數與葉數較多，整體小苗品 質較佳，顯示出「文心蘭台農4 號 - 白雪」組培苗應可