此章節將簡介本研究主題的動機與目的，以及比較電控微流體技術與其他研 究團隊所提出之方法，最後提出結合電控微流體技術與建構體外仿生組織的方法。
1-1 研究背景與動機
近年來，建構體外組織(In-vitro tissue)的相關研究已逐漸邁入較傳統二維結 構更為複雜且仿生的三維結構，所使用的技術與方法也推陳出新。其中有許多研
3. 以建造仿人類肝臟小葉的肝組織晶片為目標，望日後能做為肝臟相關藥物之 測試平臺，降低藥物測試所需的時間以及成本。
1-2 文獻回顧
對於仿生物組織於體外再造此議題，近年來已有眾多方法被提出，已下將列 舉各個團隊對於如何完整重現生物體內之組織形態---包含其物化性質、細胞排列 狀態以及多種細胞組成---所發展之生物製造技術，並介紹其特點。
建構仿生細胞培養微環境須確定使用的材料具有生物相容性，且得以調整出 具有符合生理環境之物理與化學性質，故材料的選用上相當重要。如J. W. Nichol 團隊[10] 於 2010 年所提出的論文，該團隊使用可透過改變材料鍵結時間長短與 配製濃度的水膠材料作為細胞培養微結構的素材，並探討不同的水膠濃度組成對 於在其中的細胞生長之影響，如Fig. 1-1 所示。
Fig. 1-1：於不同濃度水膠構成的微結構中進行細胞培養並分析細胞表現[10]。
除了材料本身的性質之外，生物組織中各種細胞之間的互動影響也不可忽視，
已有研究團隊提出多種細胞共培養之情況下會影響細胞之表型功能(Phenotype function)，故如何建造出含有多種細胞之體外細胞培養微結構便成為一大課題。
不同的技術如圖案化細胞培養環境之表面硬度[11,12]或是圖案化之表面處理[13-15]皆是利用細胞對於不同材料表面的選擇性貼附來排列細胞，如 S. N. Bhatia 團 隊[13]在 2008 年提出之方法，其先行於晶片上定義出細胞外間質(Extracellular matrix, ECM)的圖案，之後種上肝臟細胞，由於細胞會選擇性地貼附在有 ECM 之 區域，故可間接二維排列肝臟細胞；之後再種上較無貼附選擇性的纖維母細胞，
便完成了兩種細胞的排列以及共培養(如 Fig. 1-2(a))，並在培養數日後進行肝臟 細胞表型分析(如 Fig. 1-2(b)、(c))；該團隊利用肝臟細胞分泌物：白蛋白(Albumin) 以及尿素(Urea)，來檢視此二維圖案化細胞共培養的生長條件，對於細胞的生理 功能是否有明顯的影響。
Fig. 1-2：利用表面處理圖案化細胞並進行共培養與細胞表型分析[13]。(a)利用 圖案化特殊表面塗層使細胞在特定區域貼附。在培養過程中收取培養液並定量
(b)白蛋白及(c)尿素之分泌量。
對於較為複雜的生物組織結構，更需要三維的生物製造技術來產生相對應的 微環境，近年來微流體技術(Microfluidics)發展迅速，已有多個團隊利用微流道 (Microchannel)系統來進行體外細胞培養，利用微流道系統輸送營養物質、生長因 子以及代謝產物，並利用特殊的微結構設產生模擬生物組織之體外培養環境。如 P. J. Lee 團隊[16]模仿人類肝臟小液中的微血管以及肝臟細胞之分布形態，設計 仿生之微流道結構，讓肝臟細胞能在仿生的形態下生長，其概念如Fig. 1-3 所示。
(a)
(b) (c)
Fig. 1-3：利用微流道來排列肝臟細胞並輸送養分進行體外培養[16]。
除了利用微流道系統之外，近年興起的三維列印技術(3D printing)也漸漸發 展出三維生物列印(3D bioprinting)，此類技術使用含有細胞的材料，如同印表機 的作業原理，將含有細胞的材料印出並排列成各種形狀，也可以一層一層地列印、
疊出三維組織結構[17-19]。舉例來說，F. Pati 等人[19]先利用特殊的聚合物材料 建構出一支架，之後再使用由人體組中萃取出的細胞外間質和細胞配製成水膠材 料來當作三維生物列印的墨水，一層一層地建造出三維結構，如Fig. 1-4 所示。
Fig. 1-4：利用聚合物材料構成的支架以及含有細胞的生物材料列印出三維組織 結構[19]。
光顯影技術(Photolithography)亦是三維體外組織之建構方法中的大宗，顧名 思義是利用曝光系統使生物材料產生特定形狀、或是使細胞產生特定形態的分布 之方法。此方法的應用相當廣泛，有許多研究團隊搭配使用微機電系統(MEMS) 製程中常使用到的光罩(Photomask)來定義細胞培養支架的形狀，利用事先設計 好的光罩圖案來排列細胞[5,20]；例如 A. Khademhosseini 團隊[5]利用具光固化性 質、事先已加入細胞的水膠材料，搭配條紋狀的光罩圖案照射紫外光，在去除未
反應的材料後便可得到如同光罩上圖案的水膠結構，以此流程製作出不同寬度與 高度的培養支架，進而分析微環境尺寸以及固定邊界限制對於血管內皮細胞生長 的影響，如Fig. 1-5 所示。
Fig. 1-5：利用光顯影技術搭配具有特殊圖案的光罩，產生各種形態的細胞培養 微環境並分析其對細胞生長的影響[5]。
除了單純利用光作為定義細胞排列形態的機制外，其他團隊也利用電場去 排列在生物材料中的細胞，再透過化學反應或是光顯影技術去固定被電場控制 的細胞，最終實現在生物材料中操控細胞位置以及定義其分布狀態[6,7,21,22]。
以C. H. Liu 團隊[7]於 2013 年提出的論文為例，該研究以人類肝臟小葉(Hepatic lobule)為模型，在微流道系統底部放置具有特殊電極形狀的基板，透過強、弱 電場的分布來排列肝臟以及血管內皮細胞，其分部狀態形成仿生的組織模型，
如Fig. 1-6 所示，便可在三維結構中排列兩種細胞形成仿生組織形態。
Fig. 1-6：C. H. Liu 團隊提出的仿人類肝臟小葉形態之電極圖案，利用不均勻電 場來控制不同細胞的分布[7]。
如 A. R. Wheeler 團隊[23]在 2013 年發表的論文中利用數位微流體技術 (Digital Microfluidics, EMF)操控含有細胞的溫感型水膠材料，配合改變部分表面 的親疏水性，使水膠材料固定在較為親水的區域，最後改變溫度使水膠成形，如 Fig. 1-7 所示，亦是另一種在三維尺度下圖案化細胞的方法；該團隊也利用類似 概念在數位微流體系統上做細胞培養[24]以及探討電訊號對細胞之影響[25]。
Fig. 1-7：A. R. Wheeler 團隊利用電控微流體技術操控含有細胞的水膠，在晶片 上固定、定形水膠並行細胞培養[23]。
縱觀以上研究不難發現，在建構體外三維組織的相關技術中，營養物以及代 謝產物之輸送為一重大課題，許多研究皆是以排列或是組織化血管內皮細胞為研 究目的[5-9]，這些技術的提出對於在三維組織中產生血管的機制與方法有重大貢 獻；如Fig. 1-8 所示，以微流體技術而言，促使血管內皮細胞生成血管的方法包
含利用動態流體產生的剪應力促使細胞方向性地排列生長、在培養環境中產生生 長因子梯度驅使細胞有方向性地延伸擴散、利用細管狀的水膠材料限制細胞生長 範圍等等，皆可讓血管內皮細胞生長成血管的形態[9]。
Fig. 1-8：利用不同的培養環境刺激來促使血管生成[9]。
舉例來說，N. L. Jeon 團隊[8]利用多個平行的微流道來建構一個由細胞產生 的生長因子梯度，如Fig. 1-9 所示，最外面的微流道種有纖維母細胞，此細胞會 產生一生長因子的濃度梯度，使得位於中央流道的血管內皮細胞向特定方向生長 而形成一有方向性的血管網絡。
Fig. 1-9：以細胞和微流道系統建構生長因子梯度並驅使血管內皮細胞往特定方 向生長[8]。
1-3 研究方法與目的
縱觀以上各種技術與人體器官晶片之研究進程，為了建立如同生物體內組織 結構的仿生細胞培養微結構，所使用的技術需要具有排列多種細胞且建構出三維 細胞培養結構等能力，並且在組織中生成血管以利營養物以及代謝產物之交換。
本研究將利用電控微流體技術(Electromicrofluidics, EMF)可以同時操控多種液體 的能力，操控並排列含有細胞且具光交聯性質的水膠預聚物溶液(Hydrogel pre-polymer)，如此一來即可控制不同細胞的分布，並且是同時進行不同種類細胞的 排列，與之前敘述的方法相比相對直接，且只需一次曝光使水膠預聚物溶液交聯 以定形，有效降低實驗過程中對細胞造成的傷害；細胞排列完成後利用曝光系統 使水膠預聚物溶液定形，在維持仿生結構形態的狀況下進行細胞培養，如此便可
讓細胞於三維細胞培養微結構中生長，整個實驗方法之概念及流程如Fig. 1-10 所 示。
Fig. 1-10 本研究提出的生物製造技術之概念流程圖。
本研究預計將建構一電控微流體平臺操控水膠預聚物溶液的工作原理，運用 理論計算去探討操液體驅動力與操控液體尺寸大小之間的關係。以此為基礎發展 組織工程上的應用，期望能以不同的電極圖案設計使細胞在圖案化的三維細胞培 養微結構中生長。本研究以人類肝臟小葉為參考模型，並利用包含人類臍帶內皮 細胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)、人類肺臟纖維母細胞(Human ling fibroblast, HFL1)、人類肝癌細胞(Human hepatocellular carcinoma, HepG2)等 細胞，將這些細胞放入水膠預聚物溶液中並利用電控微流體平臺控制這些含有細 胞的液體，圖案化後曝光使之形成具仿生形態的三維細胞培養微結構，最後再進 行多種細胞共培養。以上結合電控微流體以及光顯影技術用於生物製造的方法，
探討仿生培養微結構對細胞以及不同細胞之間的影響，將利用細胞染色以及細胞 分泌物檢測等方式來分析。
本研究預期發展一具有潛力的體外人造組織建造之技術，製造出的仿生細胞 培養微結構得以用來進行藥物篩檢、細胞與細胞間互動模式以及細胞對環境因子 之反應等研究，希望日後能利用此技術所建造出更多樣化的體外組織做基礎的細 胞生理學研究，也得以作為藥物活體試驗的替代方案。