以液體介電泳和介電濕潤建造異質且仿生之細胞培養微結構

國立臺灣大學工學院機械工程學系 碩士論文

Department of Mechanical Engineering College of Engineering

National Taiwan University Master Thesis

以液體介電泳和介電濕潤建造異質且仿生之 細胞培養微結構

Construction of Heterogeneous and Biomimetic Cell Culture Microstructure Using Liquid Dielectrophoresis and

Electrowetting-on-dielectric

羅毅庭 Yi-Ting Lo

指導教授：范士岡 博士 Advisor: Shih-Kang Fan, Ph.D.

中華民國 105 年 7 月

July, 2016

致謝

這兩年的碩士生涯是全新的體驗，很慶幸當初我能加入范士岡老師的實驗室，

一路上跟著老師學習許多之前只是一知半解或是從來就沒接觸過的事物，是個充 滿未知且挑戰的旅程，更重要的是也從老師身上學到做人處事的道理，謝謝老師 這段日子的教導。感謝林頌然教授、許聿翔教授以及陳林祈教授撥冗前來參加我 的口試並擔任口試委員，給予指導以及寶貴的意見，無論是關於論文的內容以及 做研究的方法，都讓我在口試時受益良多。實驗室的夥伴們，特別要感謝祖師爺 敏瑜學姐與我分享許多實驗上的經驗與心得，很多難題跟妳討論過後都迎刃而解，

有幸在最後幾個月從妳身上挖寶；再來是開山始祖奕翰、欣宜、威凱，謝謝你們 帶我們進入這個實驗室，不吝與我們分享專業知識，教我們做實驗；同屆的孟琮、

奕伶、安得、寒來，兩年來有你們的陪伴是我的幸運，有你們在實驗室總是笑聲 連連，就算以後要各奔東西，還是要保持聯絡，永遠的好朋友，謝謝你們一直都 在；下一屆的敬哲、炯輝、家泰、翔麟，在我們碩二下這個關鍵時刻替我們減輕 不少負擔，都是好學弟，謝謝你們的幫助；下下屆的劭元、寬倫、育璿、凱懋，

謝謝你們總是在我講話時很給我面子，也是好學弟；當然還有職業組的夥伴們，

總是為我們帶來無限的歡樂，以及在研究上實質的幫助，尤其是郁凱、元聖，屁 話的同時也能學到很多新知，還有杰龍學長、大欣學姊，都給予我非常多腦力激 盪以及快速學習的契機，謝謝你們。做研究的日子不只是在知識領域上的探索，

更是學習如何與他人相處、向他人求教、調適心理的過程，感謝所有在我碩士生 涯中不吝與我分享的每個人，有你們的幫助我才能夠完成這篇論文，感謝你們。

中文摘要

本研究利用電控微流體技術得以在微小尺度下利用電訊號同時控制多種液 體移動的特性，配合使用含有不同種類細胞的水膠預聚物溶液，以及事先設計好 的仿生電極圖案，將水膠預聚物溶液排列成相對應之圖形後使之交聯，產生具有 固定邊界的細胞培養微結構，並進行培養，探討細胞培養微結構圖案化以及多種 細胞共培養對細胞表型之影響，以證實此技術具有實現人體器官晶片並取代活體 做為藥物測試樣本之潛力。現今已有許多人體器官晶片或是仿生微結構的建造技 術被提出，而這些研究不約而同地著重於重現體內實際組織形態之重要性，如何 製造複雜的細胞組成並進行仿生圖案化，便成為一大課題。而本研究使用電控微 流體技術來建造異質且仿生之三維細胞培養微結構，便是希望提出一個可以同時 排列多種含有細胞的生物材料之生物製造方法。

本研究使用之水膠材料包含 poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA)以及 gelatin methacrylate (GelMA)，皆具光交聯性質，在照射紫外光後會由液態轉為固 態，此特性使得電控微流體技術得以在其為液態時運用電訊號操控之，並在曝光 後產生具有固定形狀之水膠微結構。本研究將針對不同種類的水膠預聚物溶液、

尺寸及操控環境探討電控微流體驅動不同液體的工作原理，並以特殊電極形狀排 列含有螢光粒子及細胞之水膠預聚物溶液來展示此技術同時圖案化多種液體之 能力。本研究除了以不同寬度的細胞培養微結構來驅使細胞產生方向性的生長、

研究細胞生長環境之物理限制對其之影響外，也設計仿人類肝臟小葉的電極形狀，

同時排列含有不同種類細胞---包含人類臍帶內皮細胞(HUVEC)、人類肺臟纖維 母細胞(HFL1)、人類肝癌細胞(HepG2)---成仿生圖形之後，以建構模擬人體中真 實組織形態且具有多種細胞排列的培養微環境並在培養後進行染色與表型分析。

關鍵字：電控微流體、多種液體同時排列、三微細胞培養微結構、水膠材料、人 體器官晶片

Abstract

Electromicrofluidics (EMF), simultaneously and flexibly controlling multiple fluids with appropreiate electrical signals, is investigated to pattern various cell-laden hydrogel pre-polymers into in-vivo-like microenvironment concurrently in a single fluid manipulation step. By using photo-crosslinkable hydrogels and pre-designed electrodes with biomimetic patterns, in-vivo-like cell-laden microstructures with defined boundaries can thus be constructed after hydrogel polymerization, which can be harnessed to analyze the influence of the patterned microenvironment and cell multi- culture towards cell phenotype. Among recent biofabrication techniques reported to develop so-called “organs-on-chips”, the trends of in vitro tissue reconstruction emphasize on its consistency towards the in-vivo anatomical microenvironment.

Therefore, to establish microstructures with various cells patterned into biomimetic arrangement becomes an issue to be addressed. In this view, EMF was adopted as a powerful tool to reconstruct 3D heterogeneous and biomimetic cell culture scaffold in a relatively straightforward manner. In this thesis, two kinds of photo-crosslinkable hydrogels, poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) and gelatin methacryloyl (GelMA), were adopted as the manipulated fluids and patterned into pre-designed configurations on our EMF platform. After UV exposure, hydrogel pre-polymers were polymerized and thus formed hydrogel-based microstructures with concrete boundaries and in desired shapes. Different hydrogel pre-polymers were manipulated in altered dimensions and ambience in order to examine the working principle of hydrogel pre- polymer manipulations on the EMF platform. Fluorescent-particle-laden and cell-laden hydrogel pre-polymers were patterned on the platform into pre-designed arrangement by applying electric signals, demonstrating the ability of multiple fluids manipulation with EMF techniques. Human hepatic lobule was selected as the in-vivo model of this

research, as human umbilical vein endothelial cell (HUVEC), human lung fibroblast (HFL1), and human hepatocellular carcinoma (HepG2) were added into hydrogels to perform cell multi-culture and to conduct further investigations.

Keywords: electromicrofluidics, photo-crosslinkable hydrogel, multiple fluids manipulation, 3D heterogeneous and biomimetic microstructure, in vitro tissue

目錄

致謝... i

中文摘要... ii

Abstract ... iii

目錄... v

圖目錄... vii

表目錄... xiv

第一章 緒論 ... 1

1-1 研究背景與動機 ... 1

1-2 文獻回顧 ... 2

1-3 研究方法與目的 ... 11

第二章 電控微流體技術簡介 ... 13

2-1 介電濕潤理論 ... 13

2-2 液體介電泳理論 ... 16

2-3 電控微流體技術與應用 ... 18

第三章 製程、儀器與實驗系統介紹 ... 27

3-1 電控微流體平臺製程 ... 27

3-1.1 清洗玻璃基板 ... 27

3-1.2 蒸鍍光阻貼附層 ... 27

3-1.3 旋轉塗佈正光阻 ... 28

3-1.4 曝光、顯影及定影 ... 28

3-1.5 濕蝕刻 ... 29

3-1.6 旋轉塗佈介電層 ... 30

3-1.7 旋轉塗佈疏水層 ... 31

3-1.8 上板表面處理 ... 31

3-2 實驗系統 ... 34

3-2.1 電控微流體平臺系統 ... 34

3-2.2 細胞培養系統 ... 34

3-2.3 水膠材料 ... 40

3-2.4 曝光系統 ... 43

3-2.5 電控微流體平臺 ... 43

3-2.6 光罩圖案設計 ... 44

3-2.7 細胞染色 ... 46

第四章 實驗與結果討論 ... 49

4-1 電控微流體平臺之液體驅動力分析 ... 49

4-1.1 理論計算 ... 49

4-1.2 操作電壓量測 ... 57

4-2 細胞與本實驗系統之相容性測試 ... 66

4-2.1 曝光強度與時間 ... 66

4-2.2 水膠材料組成之微環境 ... 68

4-3 建構含螢光粒子之三維圖案化水膠微結構 ... 69

4-3.1 同時圖案化兩股含螢光粒子之水膠預聚物溶液 ... 69

4-3.2 同時圖案化三股含螢光粒子之水膠預聚物溶液 ... 71

4-4 建構不同寬度之三維細胞培養微結構 ... 74

4-4.1 NIH-3T3 ... 76

4-4.2 HUVEC ... 79

4-5 建構仿人類肝臟小葉之細胞培養微結構 ... 83

4-5.1 於電控微流體平臺上建構人類肝臟小葉 ... 83

4-5.2 仿生圖案化且共培養之細胞表型功能分析 ... 87

第五章 結論與未來展望 ... 92

5-1 結論 ... 92

5-2 未來展望 ... 92

參考文獻... 94

附錄一 實驗儀器 ... 103

圖目錄

Fig. 1-3：利用微流道來排列肝臟細胞並輸送養分進行體外培養[16]。 ... 5

Fig. 1-4：利用聚合物材料構成的支架以及含有細胞的生物材料列印出三維組織 結構[19]。 ... 6

Fig. 1-5：利用光顯影技術搭配具有特殊圖案的光罩，產生各種形態的細胞培養 微環境並分析其對細胞生長的影響[5]。 ... 7

Fig. 1-6：C. H. Liu 團隊提出的仿人類肝臟小葉形態之電極圖案，利用不均勻電 場來控制不同細胞的分布[7]。 ... 8

Fig. 1-7：A. R. Wheeler 團隊利用電控微流體技術操控含有細胞的水膠，在晶片 上固定、定形水膠並行細胞培養[23]。 ... 9

Fig. 1-8：利用不同的培養環境刺激來促使血管生成[9]。 ... 10

Fig. 1-9：以細胞和微流道系統建構生長因子梯度並驅使血管內皮細胞往特定方 向生長[8]。 ... 11

Fig. 1-10 本研究提出的生物製造技術之概念流程圖。 ... 12

Fig. 2-1：根據圖中的三個介面上的表面張力在水平方向上的力平衡關係式，可 以導出式(1)，即 Young’s relation [29]。 ... 14

Fig. 2-2：在施加電壓後電荷累積於電濕潤結構以及介電濕潤結構之情形[30]。

在電濕潤架構下(a)未施加電壓與(b)施加電壓之接觸角變化以及電雙 層分布情形。在介電濕潤架構下(c)未施加電壓與(d) 施加電壓之接觸 角變化以及電雙層分布情形。... 15 Fig. 2-3：介電濕潤的實驗架構以及接觸角隨施加電壓改變的情形[35]。 ... 16 Fig. 2-4：Pellat 實驗示意圖，介電液體沿施加電壓的兩平行板向上爬升[37]。 16 Fig. 2-5：Quincke 氣泡實驗架設圖[40]，可利用此架設測量由平行板電極產生之

電場E 造成的液氣介面壓力差 ΔP。 ... 17 Fig. 2-6：施加電壓於平行板電極，利用介電泳機制移動介電液體[44]。 ... 18 Fig. 2-7：利用電濕潤機制驅動液體，決定光線通過像素與否，是最初期電濕潤

顯示技術的概念[47]。 ... 19 Fig. 2-8：利用連續電濕潤現象來操控汞[48]。 ... 19 Fig. 2-9：M. Washizu 利用開放式電控微流體平臺以及電極陣列操控液滴[49]。

... 20 Fig. 2-10：M. G. Pollack 團隊提出的三明治結構介電濕潤晶片[50]。 ... 21 Fig. 2-11：介電濕潤顯示器的運作示意圖[56]。 ... 22 Fig. 2-12：以數位微流體平臺操控液滴，展示以電訊號混合、分裂、產出以及

運送液滴的技術[58]。 ... 23 Fig. 2-13：實驗室晶片的概念在電控微流體平臺上實現[58]。 ... 24 Fig. 2-14：搭配磁珠以及傳統醫檢的檢測方式，在電控微流體平臺上實現快速

且可程式化之免疫檢測[67]。 ... 24 Fig. 2-15：共平面電極架構圖以及利用介電泳現象驅動液體[15,71]。 ... 25 Fig. 2-16：利用高低頻率的電訊號產生介電泳及介電濕潤現象，在同一平臺上

操控導電與介電液體[44]。 ... 26 Fig. 2-17：使用適當的電訊號頻率，利用顆粒介電泳分離液體中的顆粒[73]。 26

Fig. 3-1：氣相蒸鍍 HMDS 於 ITO 玻璃基板表面。 ... 28

Fig. 3-2：旋塗正光阻於 ITO 玻璃基板上。 ... 28

Fig. 3-3：基板經過曝光後放入顯影劑，定義正光阻圖案，最後放入水中定影。 ... 29

Fig. 3-4：將基板放入稀釋王水溶液中進行濕蝕刻，以定義 ITO 電極圖案，隨後 將基板放入去光阻劑中，去除殘留之正光阻。... 30

Fig. 3-5：旋塗介電層於已定義 ITO 電極形狀之基板上。 ... 31

Fig. 3-6：旋塗疏水層於表層。 ... 31

Fig. 3-7：電控微流體平臺系統架構示意圖。 ... 34

Fig. 3-8：NIH-3T3 生長形態。(比例尺：100 µm) ... 37

Fig. 3-9：HUVEC 生長形態。(比例尺：100 µm) ... 38

Fig. 3-10：HFL1 生長形態。(比例尺：100 µm) ... 39

Fig. 3-11：HepG2 生長形態。(比例尺：100 µm) ... 39

Fig. 3-12：在 50˚C 環境下使 gelatin 與 methacrylic anhydride 反應形成鍵結[10]。 ... 40

Fig. 3-13：GelMA 加入光起始劑並照射紫外光後交聯[10]。 ... 41

Fig. 3-14：PEGDA 加入光起始劑並照射紫外光後交聯[76]。 ... 42

Fig. 3-15：電控微流體平臺之剖面與上視圖。 ... 44

Fig. 3-16：中間四條橫線之寬度由上而下分別為 400 μm、300 μm、200 μm 以及 100 μm，各自的左方皆有一個邊長為 1 mm 之正方形。(比例尺：5 mm) ... 45

Fig. 3-17：由兩股構成之同心圓、指叉形以及 NTU 字母樣式的電極圖案。 (比 例尺：1 mm) ... 45

Fig. 3-18：由三股構成之圓型螺旋陣列。(比例尺：2 mm) ... 46

Fig. 3-19：模仿人類肝臟小葉形態的六角形光罩圖案。(比例尺：1 mm) ... 46

Fig. 3-20 HUVEC 經過 DAPI、f-actin 以及 CD31 染色過後所拍攝之螢光照片。

(比例尺：100 µm) ... 48 Fig. 4-1：將電控微流體平臺表示成一電路圖，其中介電液體是不導電的，故沒

有電阻，為一電容；而導電液體則具有一定的電阻[40]。 ... 50 Fig. 4-2：利用理論[40,81,82]計算出在不同的輸入訊號頻率下，降在細胞培養液

(曲線 C)與水(曲線 B)上之分壓比率[73]。 ... 51 Fig. 4-3：電控微流體平台之上視圖與側視圖，以及各個參數相對應的位置。 . 53 Fig. 4-4：施加電壓與接觸角關係實驗架設圖。(a)(b)為示意圖，(c)(d)為實際情

形。圖中基板與電控微流體平臺之下板結構組成相同。(比例尺：1 mm) ... 55 Fig. 4-5：不同液體之接觸角與施加電壓關係圖。 ... 56 Fig. 4-6：測試液滴在不同寬度電極上的操作電壓之實驗狀況。(a)圖中較細電極

未施加電壓，(b)圖中較細電極施加足夠電壓使液滴變形並驅動液 滴。(比例尺： 1 mm) ... 58 Fig. 4-7：在高度為 40 μm、環境為油浴之情況下各液體在不同寬度電極上所需

之操作電壓。... 60 Fig. 4-8：在高度為 100 μm、環境為油浴之情況下各液體在不同寬度電極上所需

之操作電壓。... 60 Fig. 4-9：在高度為 40 μm、環境為空氣之情況下各液體在不同寬度電極上所需

之操作電壓，以及理論計算出之值(T)。 ... 61 Fig. 4-10：在高度為 100 μm、環境為空氣之情況下各液體在不同寬度電極上所

需之操作電壓，以及理論計算出之值(T)。 ... 61 Fig. 4-11：在高度為 40 μm 之情況下各式 PEGDA 在不同寬度電極上以及不同環

境下所需之操作電壓。... 64 Fig. 4-12：在高度為 100 μm 之情況下各式 PEGDA 在不同寬度電極上以及不同

環境下所需之操作電壓。... 64 Fig. 4-13：在環境為油浴情況下各式 PEGDA 在不同寬度電極上以及不同高度下

所需之操作電壓。... 65 Fig. 4-14：在環境為空氣情況下各式 PEGDA 在不同寬度電極上以及不同高度下

所需之操作電壓。... 66 Fig. 4-15：NIH-3T3 細胞在照射 9 s 之紫外光後染色之結果。(比例尺：100 μm)

... 67 Fig. 4-16：各式細胞對曝光時間長短之存活率。 ... 68 Fig. 4-17：各式細胞在經過 8 hr 於水膠環境中培養後的存活率。... 69 Fig. 4-18：兩股含有不同顏色螢光粒子的水膠預聚物溶液因施加電壓於 NTU 圖

案的電極而排列成形之過程。液體圖案化過程同(a)-(d)順序。(比例 尺：1 mm) ... 70 Fig. 4-19：含有不同顏色螢光粒子之水膠預聚物溶液於電控微流體平臺上排列

成(a)(b)同心圓、(c)(d)指叉型以及(e)(f)NTU 字母等圖案，其中(a)、

(c)、(e)為明視野照片，(b)、(d)、(f)為螢光顯微鏡拍攝之照片。(比例 尺：1 mm) ... 71 Fig. 4-20：在電控微流體平臺上同時圖案化三種含有螢光粒子之水膠預聚物溶

液之過程。(比例尺：1 mm) ... 72 Fig. 4-21：含有不同顏色螢光粒子之水膠預聚物溶液於電控微流體平臺上排列

成(a)-(d)同心螺旋形狀，並以螢光顯微鏡於不同倍率物鏡下拍攝照 片。(比例尺：500 µm) ... 73 Fig. 4-22 共軛焦顯微鏡所拍攝之螢光照片。(a)圖中白色虛線標示之截面以及其

Z 軸之粒子分佈情形。(b)可看出圓形螺旋之水膠微結構聚三維型態。

(比例尺：200 μm) ... 74 Fig. 4-23：建構含細胞之水膠微結構實驗架構圖。 ... 74

Fig. 4-24：操控含有 HUVEC 細胞之水膠預聚物溶液形成不同寬度之微結構。

(比例尺：1 mm) ... 76 Fig. 4-25：明視野下細胞於不同寬度之微結構中培養之情形。(a)(b)(c)(d)圖為培

養1 天後之情形，(e)(f)(g)(h)圖為培養 4 天後之情形，由(a)至(d)、由 (e)至(h)分別為寬度 400 μm、300 μm、200 μm 與 100 μm 的細胞培養 微結構。 (比例尺：200 μm) ... 77 Fig. 4-26：細胞於不同寬度之微結構中培養 6 天後之螢光染色照片，綠色(f-

actin)部分為細胞骨架，藍色(DAPI)則為細胞核。(a)(b)(c)(d)分別為寬 度400 μm、300 μm、200 μm 與 100 μm 的細胞培養支架。(比例尺：

100 μm) ... 78 Fig. 4-27：分析在各種尺寸之水膠微結構中 NIH-3T3 細胞核長軸與水平方向夾

角，並以10˚為區間計算各區間之細胞數所占細胞總數之百分比。 . 79 Fig. 4-28：明視野下細胞於不同寬度之微結構中培養之情形。(a)(c)(e)圖為培養

14 天後之情形，分別為寬度 400 μm、300 μm 與 200 μm 的細胞培養 微結構。(b)(d)(f)圖為培養 21 天後之情形，分別為寬度 400 μm、300 μm 與 200 μm 的細胞培養微結構。(比例尺：200 μm) ... 80 Fig. 4-29：細胞於不同寬度之微結構中培養 21 天後之螢光染色照片，紅色

(CD31)為內皮細胞貼附因子，綠色(f-actin)部分為細胞骨架，藍色 (DAPI)則為細胞核。(a)(b)(c)為 20X 物鏡下之視野，分別為寬度 400 μm、300 μm 與 200 μm 的細胞培養支架。(d)為 10X 物鏡下之視野，

為寬度200 μm 的細胞培養支架。(比例尺：200 μm) ... 81 Fig. 4-30 以共軛焦顯微鏡所拍攝之含有 HUVEC、寬度為 200 μm 的水膠微結構

影像。(a)圖中白色線所標示之截面上可觀察到細胞在不同高度上生 長。(b)具有三維型態之細胞培養微結構。(比例尺：200 μm) ... 82 Fig. 4-31：分析在各種尺寸之水膠微結構中 HUVEC 細胞核長軸與水平方向夾

角，並以10˚為區間計算各區間之細胞數所占細胞總數之百分比。 . 83 Fig. 4-32：於電控微流體平臺上將含有 HepG2、HUVEC 與 HFL1 之水膠預聚物

溶液圖案化排列成仿人類肝臟小葉之圖形。(比例尺：1 mm) ... 85

Fig. 4-33：細胞於仿人類肝臟小葉細胞培養微結構中的培養情形。其中紅色虛 線包圍之區域為HepG2 細胞原本佔據之區域。(a)(c)(e) 4 倍物鏡下分 別於培養後第2、6、10 天拍攝之細胞生長情形。(b)(d)(f) 10 倍物鏡 下分別於培養後第2、6、10 天拍攝之細胞生長情形。(比例尺：200 μm) ... 86

Fig. 4-34：本實驗使用以上三組分別代表細胞單獨培養、多種細胞共培養以及 仿生圖案化多種細胞共培養之樣本，來測試其對HepG2 細胞表型功 能之影響。... 88

Fig. 4-35：白蛋白之標準曲線，表示吸光值與白蛋白濃度之間的關係。 ... 89

Fig. 4-36：尿素之標準曲線，表示吸光值與尿素濃度之間的關係。 ... 89

Fig. 4-37：進行培養後每 2 天收集之樣本之白蛋白濃度。 ... 91

Fig. 4-38：進行培養後每 2 天收集之樣本之尿素濃度。 ... 91

表目錄

Table 1：量測一體積為 4 μL 之去離子水於各式材料表面之接觸角。 (比例尺：

1 mm) ... 33

Table 2：不同液體之起始接觸角與達到接觸角飽和時之接觸角。 ... 56

Table 3：兩板間距為 40 μm 之下於各粗細電極所做計算之 ΔP 值。 ... 59

Table 4：兩板間距為 100 μm 之下於各粗細電極所做計算之 ΔP 值。 ... 59

第一章 緒論

此章節將簡介本研究主題的動機與目的，以及比較電控微流體技術與其他研 究團隊所提出之方法，最後提出結合電控微流體技術與建構體外仿生組織的方法。

1-1 研究背景與動機

近年來，建構體外組織(In-vitro tissue)的相關研究已逐漸邁入較傳統二維結 構更為複雜且仿生的三維結構，所使用的技術與方法也推陳出新。其中有許多研 究團隊藉由使用具生物相容性的生醫材料，並將細胞放入該材料建構出的微環境 中進行體外培養，同時搭配生物製造(Biofabrication)相關技術，將細胞培養之微 環境的形態、基本組成及物化性質等等參照生物體內真實情形來設計，以建造出 真正的體外仿生微結構。如此一來不僅可做為基礎生理學研究的體外模型，更可 代替人活體做為藥物測試以及開發的工具，甚至是達成再生醫學之願景，這也是 人體器官晶片(Organs-on-chips)的開發背景與概念[1-3]。

目前對於較簡易的組織結構，例如皮膚、膀胱以及軟骨等等，已有相當成熟 的研究發展[4]，但對於人體內其他較為複雜的器官組織結構，需從傳統的二微結 構跳脫至三維結構，在此進程中有一重大課題，便是如何在人造組織中長出血管，

使得營養及代謝產物得以輸送進出組織，細胞才能在三維結構之中存活。近年來 以有許多團隊提出於體外進行血管增生(Angiogenesis)的相關技術[5-9]，更進一 步使血管生成特定之組織形態。

本研究將根據以上人體器官晶片的概念以及血管增生對於三維組織結構的 重要性，提出一建構體外異質且仿生之細胞培養微結構的方法，研究動機包含：

1. 現今所提出的生物製造技術中，鮮少技術有能夠在微小尺度下同時排列且圖 案化多種細胞及生物材料，對於仿生體外組織培養，這是必須克服的困難。

2. 利用較少被運用在此領域的電控微流體技術，搭配適當的生物材料，當作建 造體外組織晶片的方法，探討此技術的可行性以及發展性。

3. 以建造仿人類肝臟小葉的肝組織晶片為目標，望日後能做為肝臟相關藥物之 測試平臺，降低藥物測試所需的時間以及成本。

1-2 文獻回顧

對於仿生物組織於體外再造此議題，近年來已有眾多方法被提出，已下將列 舉各個團隊對於如何完整重現生物體內之組織形態---包含其物化性質、細胞排列 狀態以及多種細胞組成---所發展之生物製造技術，並介紹其特點。

建構仿生細胞培養微環境須確定使用的材料具有生物相容性，且得以調整出 具有符合生理環境之物理與化學性質，故材料的選用上相當重要。如J. W. Nichol 團隊[10] 於 2010 年所提出的論文，該團隊使用可透過改變材料鍵結時間長短與 配製濃度的水膠材料作為細胞培養微結構的素材，並探討不同的水膠濃度組成對 於在其中的細胞生長之影響，如Fig. 1-1 所示。

Fig. 1-1：於不同濃度水膠構成的微結構中進行細胞培養並分析細胞表現[10]。

除了材料本身的性質之外，生物組織中各種細胞之間的互動影響也不可忽視，

已有研究團隊提出多種細胞共培養之情況下會影響細胞之表型功能(Phenotype function)，故如何建造出含有多種細胞之體外細胞培養微結構便成為一大課題。

不同的技術如圖案化細胞培養環境之表面硬度[11,12]或是圖案化之表面處理[13- 15]皆是利用細胞對於不同材料表面的選擇性貼附來排列細胞，如 S. N. Bhatia 團 隊[13]在 2008 年提出之方法，其先行於晶片上定義出細胞外間質(Extracellular matrix, ECM)的圖案，之後種上肝臟細胞，由於細胞會選擇性地貼附在有 ECM 之 區域，故可間接二維排列肝臟細胞；之後再種上較無貼附選擇性的纖維母細胞，

便完成了兩種細胞的排列以及共培養(如 Fig. 1-2(a))，並在培養數日後進行肝臟 細胞表型分析(如 Fig. 1-2(b)、(c))；該團隊利用肝臟細胞分泌物：白蛋白(Albumin) 以及尿素(Urea)，來檢視此二維圖案化細胞共培養的生長條件，對於細胞的生理 功能是否有明顯的影響。

Fig. 1-2：利用表面處理圖案化細胞並進行共培養與細胞表型分析[13]。(a)利用 圖案化特殊表面塗層使細胞在特定區域貼附。在培養過程中收取培養液並定量

(b)白蛋白及(c)尿素之分泌量。

對於較為複雜的生物組織結構，更需要三維的生物製造技術來產生相對應的 微環境，近年來微流體技術(Microfluidics)發展迅速，已有多個團隊利用微流道 (Microchannel)系統來進行體外細胞培養，利用微流道系統輸送營養物質、生長因 子以及代謝產物，並利用特殊的微結構設產生模擬生物組織之體外培養環境。如 P. J. Lee 團隊[16]模仿人類肝臟小液中的微血管以及肝臟細胞之分布形態，設計 仿生之微流道結構，讓肝臟細胞能在仿生的形態下生長，其概念如Fig. 1-3 所示。

(a)

(b) (c)

Fig. 1-3：利用微流道來排列肝臟細胞並輸送養分進行體外培養[16]。

除了利用微流道系統之外，近年興起的三維列印技術(3D printing)也漸漸發 展出三維生物列印(3D bioprinting)，此類技術使用含有細胞的材料，如同印表機 的作業原理，將含有細胞的材料印出並排列成各種形狀，也可以一層一層地列印、

疊出三維組織結構[17-19]。舉例來說，F. Pati 等人[19]先利用特殊的聚合物材料 建構出一支架，之後再使用由人體組中萃取出的細胞外間質和細胞配製成水膠材 料來當作三維生物列印的墨水，一層一層地建造出三維結構，如Fig. 1-4 所示。

Fig. 1-4：利用聚合物材料構成的支架以及含有細胞的生物材料列印出三維組織 結構[19]。

光顯影技術(Photolithography)亦是三維體外組織之建構方法中的大宗，顧名 思義是利用曝光系統使生物材料產生特定形狀、或是使細胞產生特定形態的分布 之方法。此方法的應用相當廣泛，有許多研究團隊搭配使用微機電系統(MEMS) 製程中常使用到的光罩(Photomask)來定義細胞培養支架的形狀，利用事先設計 好的光罩圖案來排列細胞[5,20]；例如 A. Khademhosseini 團隊[5]利用具光固化性 質、事先已加入細胞的水膠材料，搭配條紋狀的光罩圖案照射紫外光，在去除未

反應的材料後便可得到如同光罩上圖案的水膠結構，以此流程製作出不同寬度與 高度的培養支架，進而分析微環境尺寸以及固定邊界限制對於血管內皮細胞生長 的影響，如Fig. 1-5 所示。

Fig. 1-5：利用光顯影技術搭配具有特殊圖案的光罩，產生各種形態的細胞培養 微環境並分析其對細胞生長的影響[5]。

除了單純利用光作為定義細胞排列形態的機制外，其他團隊也利用電場去 排列在生物材料中的細胞，再透過化學反應或是光顯影技術去固定被電場控制 的細胞，最終實現在生物材料中操控細胞位置以及定義其分布狀態[6,7,21,22]。

以C. H. Liu 團隊[7]於 2013 年提出的論文為例，該研究以人類肝臟小葉(Hepatic lobule)為模型，在微流道系統底部放置具有特殊電極形狀的基板，透過強、弱 電場的分布來排列肝臟以及血管內皮細胞，其分部狀態形成仿生的組織模型，

如Fig. 1-6 所示，便可在三維結構中排列兩種細胞形成仿生組織形態。

Fig. 1-6：C. H. Liu 團隊提出的仿人類肝臟小葉形態之電極圖案，利用不均勻電 場來控制不同細胞的分布[7]。

如 A. R. Wheeler 團隊[23]在 2013 年發表的論文中利用數位微流體技術 (Digital Microfluidics, EMF)操控含有細胞的溫感型水膠材料，配合改變部分表面 的親疏水性，使水膠材料固定在較為親水的區域，最後改變溫度使水膠成形，如 Fig. 1-7 所示，亦是另一種在三維尺度下圖案化細胞的方法；該團隊也利用類似 概念在數位微流體系統上做細胞培養[24]以及探討電訊號對細胞之影響[25]。

Fig. 1-7：A. R. Wheeler 團隊利用電控微流體技術操控含有細胞的水膠，在晶片 上固定、定形水膠並行細胞培養[23]。

縱觀以上研究不難發現，在建構體外三維組織的相關技術中，營養物以及代 謝產物之輸送為一重大課題，許多研究皆是以排列或是組織化血管內皮細胞為研 究目的[5-9]，這些技術的提出對於在三維組織中產生血管的機制與方法有重大貢 獻；如Fig. 1-8 所示，以微流體技術而言，促使血管內皮細胞生成血管的方法包

含利用動態流體產生的剪應力促使細胞方向性地排列生長、在培養環境中產生生 長因子梯度驅使細胞有方向性地延伸擴散、利用細管狀的水膠材料限制細胞生長 範圍等等，皆可讓血管內皮細胞生長成血管的形態[9]。

Fig. 1-8：利用不同的培養環境刺激來促使血管生成[9]。

舉例來說，N. L. Jeon 團隊[8]利用多個平行的微流道來建構一個由細胞產生 的生長因子梯度，如Fig. 1-9 所示，最外面的微流道種有纖維母細胞，此細胞會 產生一生長因子的濃度梯度，使得位於中央流道的血管內皮細胞向特定方向生長 而形成一有方向性的血管網絡。

Fig. 1-9：以細胞和微流道系統建構生長因子梯度並驅使血管內皮細胞往特定方 向生長[8]。

1-3 研究方法與目的

縱觀以上各種技術與人體器官晶片之研究進程，為了建立如同生物體內組織 結構的仿生細胞培養微結構，所使用的技術需要具有排列多種細胞且建構出三維 細胞培養結構等能力，並且在組織中生成血管以利營養物以及代謝產物之交換。

本研究將利用電控微流體技術(Electromicrofluidics, EMF)可以同時操控多種液體 的能力，操控並排列含有細胞且具光交聯性質的水膠預聚物溶液(Hydrogel pre- polymer)，如此一來即可控制不同細胞的分布，並且是同時進行不同種類細胞的 排列，與之前敘述的方法相比相對直接，且只需一次曝光使水膠預聚物溶液交聯 以定形，有效降低實驗過程中對細胞造成的傷害；細胞排列完成後利用曝光系統 使水膠預聚物溶液定形，在維持仿生結構形態的狀況下進行細胞培養，如此便可

讓細胞於三維細胞培養微結構中生長，整個實驗方法之概念及流程如Fig. 1-10 所 示。

Fig. 1-10 本研究提出的生物製造技術之概念流程圖。

本研究預計將建構一電控微流體平臺操控水膠預聚物溶液的工作原理，運用 理論計算去探討操液體驅動力與操控液體尺寸大小之間的關係。以此為基礎發展 組織工程上的應用，期望能以不同的電極圖案設計使細胞在圖案化的三維細胞培 養微結構中生長。本研究以人類肝臟小葉為參考模型，並利用包含人類臍帶內皮 細胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)、人類肺臟纖維母細胞(Human ling fibroblast, HFL1)、人類肝癌細胞(Human hepatocellular carcinoma, HepG2)等 細胞，將這些細胞放入水膠預聚物溶液中並利用電控微流體平臺控制這些含有細 胞的液體，圖案化後曝光使之形成具仿生形態的三維細胞培養微結構，最後再進 行多種細胞共培養。以上結合電控微流體以及光顯影技術用於生物製造的方法，

探討仿生培養微結構對細胞以及不同細胞之間的影響，將利用細胞染色以及細胞 分泌物檢測等方式來分析。

本研究預期發展一具有潛力的體外人造組織建造之技術，製造出的仿生細胞 培養微結構得以用來進行藥物篩檢、細胞與細胞間互動模式以及細胞對環境因子 之反應等研究，希望日後能利用此技術所建造出更多樣化的體外組織做基礎的細 胞生理學研究，也得以作為藥物活體試驗的替代方案。

第二章 電控微流體技術簡介

本章節將介紹電控微流體技術中兩個主要的液體驅動力---介電濕潤以及介 電泳的理論基礎，並統整近年來電控微流體技術的發展以及應用。

2-1 介電濕潤理論

將一液滴放在含有介電層以及導電層的基板上，在施加電壓後液滴與基板間 的接觸角會因電壓大小而變化，此現象稱為介電濕潤現象(Electrowetting-on- dielectric, EWOD)。早在 1875 年由 G. Lippmann [26] 首度發現電毛細現象 (Electrocapillarity)，該研究中說明汞在電解液中會因為施加電壓在兩液體介面上 而改變汞原本在毛細管中上升下降的行為，同時提出了Lippmann relation，為當 今電濕潤理論(Electrowetting, EW)的基礎。B. Berge [27] 在 1993 年提出將液體和 導電層之間加入一層介電層之設計，此種設計方法大大降低了液體在施加電壓後 被電解的可能性，這也就是現今介電濕潤的雛形架構。

要解釋電濕潤與介電濕潤現象，要先從液滴在平衡狀態下必須符合的條件說 起；液滴的形狀會受到表面張力的影響而產生改變，由固液介面、液氣介面以及 固氣介面上之表面張力力平衡的條件，可推得Young’s relation [28]：

𝑐𝑜𝑠𝜃₀ = ^𝛾𝑆𝐺_𝛾^{+𝛾𝑆𝐿}

𝐿𝐺 ， (1) 其中θ0是指在平衡狀態之下液滴與固體表面間的接觸角，介面上的表面張力𝛾的

三個下標S、L、G，則分別代表固相、液相、氣相。兩相介面上的表面張力力圖

如同Fig. 2-1 所示。

Fig. 2-1：根據圖中的三個介面上的表面張力在水平方向上的力平衡關係式，可 以導出式(1)，即 Young’s relation [29]。

電濕潤與介電濕潤是利用外加電壓來改變介面上的表面張力，進而改變介面 之間的接觸角。此二者最大的不同，在於施加電壓後電雙層(Electric double layer, EDL)產生的位置以及系統總電容的大小[30,31]。以電濕潤來說，當外加電壓施加 於整個系統時，液滴與導電層之間的介面上會產生一層厚度在奈米等級的電雙層，

如Fig. 2-2(a)、(b)所示。在沒有介電層的架構下，由於液滴會直接接觸到導電層，

液體電解的問題會使得施加電壓大小有所限制；而在介電濕潤的架構之下(如 Fig.

2-2(c)、(d))，液滴和導電層之間隔了一層介電層，電雙層會位於液滴和介電層之 間的以及介電層和導電層之間的介面上，可以有效解決電解的問題，而相較於電 濕潤中幾奈米厚的薄電容，介電層的厚度相對厚了許多，大大降低了整個系統的 總電容。

Fig. 2-2：在施加電壓後電荷累積於電濕潤結構以及介電濕潤結構之情形[30]。

在電濕潤架構下(a)未施加電壓與(b)施加電壓之接觸角變化以及電雙層分布情 形。在介電濕潤架構下(c)未施加電壓與(d) 施加電壓之接觸角變化以及電雙層

分布情形。

根據 G. Lippman 的實驗結果，介面上若有電荷累積可以改變液體與毛細管 介面上的力，將式(1)結合以上所謂 Lippmann relation，可以導出接觸角與施加電 壓之間的關係式，即Young-Lippmann equation [32]：

𝑐𝑜𝑠𝜃(𝑉) = 𝑐𝑜𝑠𝜃₀ +_2𝛾^𝐶

𝐿𝐺𝑉²， (2)

其中C 為整個系統的總電容。在介電濕潤的架構之下，會有兩個電雙層產生，也

就相當於有兩個電容串聯，而若是將液滴視為一個完美的導體，系統的總電容C 可以寫成(ε0εd)/t，其中 ε0為真空狀態下的電容率(Permittivity)，大小為 8.854×10^-

12 F/m，εd為介電層的相對電容率，t 為介電層的厚度，如 Fig. 2-3 所示，則 Young- Lippmann equation 可改寫成[33,34]：

𝑐𝑜𝑠𝜃(𝑉) = 𝑐𝑜𝑠𝜃₀ +_2𝛾^{𝜀0𝜀𝑑}

𝐿𝐺𝑡𝑉² (3)

(a) (b)

(c) (d)

Fig. 2-3：介電濕潤的實驗架構以及接觸角隨施加電壓改變的情形[35]。

在處理導電液體時，可以利用式(3)來推測外加電壓與接觸角之間的關係。

2-2 液體介電泳理論

液體介電泳(Liquid dielectrophoresis, LDEP)現象是在描述介電液體在一不均 勻電場中的的運動情形，介電液體會趨向往電場強度較高的區域移動。早在1894 年，H. Pellat [36]就利用兩個平行板電極垂直插入液體中後施加電壓，發現液體 會被兩板之間所產生的電場所吸引而往上移動，如Fig. 2-4 所示。

Fig. 2-4：Pellat 實驗示意圖，介電液體沿施加電壓的兩平行板向上爬升[37]。

為了探討介電泳現象在兩相介面上所產生的作用力大小，G. Quincke [38]以 及W. F. Pickard [39]利用 Fig. 2-5 中之實驗架設，測定氣泡和液體之間的壓力差 來得到電場與壓力差之間的關係。

Fig. 2-5：Quincke 氣泡實驗架設圖[40]，可利用此架設測量由平行板電極產生之 電場E 造成的液氣介面壓力差 ΔP。

而J. R. Melcher 團隊[41,42]在 1970 年左右發表了有關液體介電泳的研究，

利用馬克斯威爾應力張量(Maxwell stress tensor)來說明液體在不均勻電場中的運 動趨勢。根據該團隊提出的液體介電泳理論模型，電場施加在液體上的力可以由 Korteweg-Helmholtz 體積力密度方程(K-H body force density)來表示：

𝑓^𝑒 = 𝜌_𝑓𝐸 −¹₂𝐸²𝛻𝜀 + 𝛻 [¹₂𝐸^{2 𝜕𝜀}_𝜕𝜌𝜌]， (4) 其中E 代表電場，ρf代表體電荷密度(Volume charge density)，ρ 代表液體的質量 密度，ε 代表電容率。根據(4)式代入馬克斯威爾應力張量可寫成：

𝑇_𝑚𝑛^𝑒 = 𝜀𝐸_𝑚𝐸_𝑛 −¹₂𝛿_𝑚𝑛[𝜀 −^𝜕𝜀_𝜕𝜌𝜌] 𝐸_𝑘𝐸_𝑘， (5) 其中𝑇_𝑚𝑛^𝑒 為電場中的馬克斯威爾應力張量，Em、En、Ek代表電場在不同方向上的 分量，δmn則代表克羅奈克函數(Kronecker delta function)，可以利用此方程式去計 算液體在各方向上的受力情形。考慮在一般狀況下，大部分的液體皆為不可壓縮 (Incompressible)，式(4)中的∂ε/∂ρ 項可被忽略，假設其體電荷密度 ρf = 0，可以利 用伯努利方程式(Bernoulli equation)來近似其流體力平衡之狀態[43]：

∇[𝑝 + 𝜌𝑔𝑧] −¹₂𝐸²∇𝜀 = 0， (6)

其中p 代表流體靜壓力(Hydrostatic pressure)而 z 則是垂直高度。在液體中，式(6)

的p + ρgz = 0，但在兩相介面上，介電泳所產生的力會去平衡馬克斯威爾應力張

量在兩相中所產生的差值，也就是平衡兩相之間的壓力差，若外加電場的方向與 兩相介面相切，則式(6)可以改寫成：

∆𝑝 = ∆𝑇 =¹₂(𝜀 − 𝜀₀)𝐸²， (7) 其中∆p 是兩相之間的壓力差，∆T 代表兩相之馬克斯威爾應力張量的差值，方向 由液體指向外界。以平行板電極的實驗為例，如Fig. 2-6 所示，若電極的寬度為 w，兩電極間的距離為 d，可以利用式(7)中導出的外加電場與壓力差關係式，算

出液體介電泳力(FLDEP)的大小[44]：

𝐹_{𝐿𝐷𝐸𝑃}= ^(𝜀−𝜀_2𝑑^0)𝑤𝑉²。 (8)

Fig. 2-6：施加電壓於平行板電極，利用介電泳機制移動介電液體[44]。

在處理介電液體時，可利用式(8)去計算外加電壓與介電泳力之間的關係。

2-3 電控微流體技術與應用

利用電訊號來控制流體的形態和移動等技術，其可控制之流體體積可以小至 數個皮升(Picoliter, pL)，這些技術稱之為電控微流體。在現今電控微流體的領域 中，主要用來驅動液體的機制便是以上所介紹的兩個現象：介電濕潤以及介電泳。

在B. Berge [27]提出了在液體和導電層之間加入一層介電層的設計前，電濕潤現 象已被用來當作顯示器的元件以及驅動液體的方法；例如G. Beni 團隊[45]在 1980 年代初期利用電解液和導電基板之間在施加電壓後產生電雙層，進而改變介面上 的表面張力來移動液體，稱為連續介電濕潤(Continuous electrowetting)；該團隊也

提出利用電濕潤的機制來當作被動顯示器或是光閘(Optical switch)的技術[46,47]，

可說是最初期的電濕潤應用，其概念如Fig. 2-7 所示。

Fig. 2-7：利用電濕潤機制驅動液體，決定光線通過像素與否，是最初期電濕潤 顯示技術的概念[47]。

這些應用方向也被後人證實且持續發揚光大；以連續電濕潤來說，1990 年 由E. D. Colgate 與 H. Matsumoto [29]首度提出了利用電濕潤機制在一封閉流道內 驅動微小體積液體的實驗架設，而J. Lee [48]利用電解液以及汞之間的介面上產 生的電雙層改變表面張力，使得汞可以被電訊號給操控，如Fig. 2-8 所示。

Fig. 2-8：利用連續電濕潤現象來操控汞[48]。

在介電濕潤的實驗設計被提出後[27]，介電層隔絕了導電層以及液體，解決 了電濕潤應用上容易將液體電解的問題，因此以介電濕潤當作液體驅動機制的相

關研究得以有所進展。在1998 年 M. Washizu [49]首度提出了開放式的液體操控 平台，利用電極陣列操控液滴，電極與液體之間除了介電層之外還有一層疏水材 料，讓液體的移動更加順暢，也提出了電控微流體平臺可以做為微型化反應器的 概念，如Fig. 2-9 所示。

Fig. 2-9：M. Washizu 利用開放式電控微流體平臺以及電極陣列操控液滴[49]。

M. G. Pollack 團隊也在 2000 年接著提出同樣是開放式、但是有接地電極在 上方的三明治結構(Sandwich structure)之電控微流體平臺[50,51]，其架構如 Fig.

2-10 所示，更提出了在操控液體外圍加入油浴環境的作法，大大降低了微小液滴 的揮發速率，也更加拓展了電控微流體的應用領域，其操控之液體體積小、反應 速度快、可程式化控制等特性也逐漸被重視。

Fig. 2-10：M. G. Pollack 團隊提出的三明治結構介電濕潤晶片[50]。

搭配以上概念，利用介電濕潤來做顯示器的應用隨之發展得相當成熟，多半 採用透光的導電層與介電層，且使用兩種互不相溶、透光率不同的液體來改變像 素的透光率。如Fig. 2-11 所示，藉由施加電壓後液滴形態的改變來影響光路行經 的路線，進而改變透光率而影響像素的顏色[52]。有別於傳統的顯示器，電濕潤 顯示器運用電訊號改變液面鏡片的焦距[53]，其較低之操作電壓以及快速的透光 變化反應等條件是電濕潤顯示器的優勢；更多樣化的應用包含採用不同顏色的液 體或是利用電子紙當基材[54-56]，以及利用非平板形狀的電極來最佳化設計光路 [57]。

Fig. 2-11：介電濕潤顯示器的運作示意圖[56]。

而電控微流體技術也在實驗室晶片(Lab-on-a-chip)的領域上逐漸受到重視，

2003 年 C. J. Kim 團隊[58]展示了電控微流體平臺在操控微小液滴上的基本運作 方式，包含產出、運送、結合、分裂液滴等功能，如Fig. 2-12 所示，這種可程式 化的操控液滴之技術便被稱為數位微流體。

Fig. 2-12：以數位微流體平臺操控液滴，展示以電訊號混合、分裂、產出以及 運送液滴的技術[58]。

數位微流體結合實驗室晶片相關的研究發展得相當迅速，其優勢在於所需樣 品量相對少，也因為液體體積小使得反應時間較傳統方法快速，加上可以將電訊 號程式化達到自動化液滴控制，而且是在同一片晶片上同時操控多種液體樣品 [59,60]，如 Fig. 2-13 與 Fig. 2-14 所示。近年來包含微型化可攜帶式的晶片設計 [61,62]、生醫檢測晶片[58,63-67]、結合微機電元件實現多功能化的實驗平臺[68]

等等，應用層面非常廣泛[69,70]。

Fig. 2-13：實驗室晶片的概念在電控微流體平臺上實現[58]。

Fig. 2-14：搭配磁珠以及傳統醫檢的檢測方式，在電控微流體平臺上實現快速 且可程式化之免疫檢測[67]。

除了利用介電濕潤機制來操控液體之外，介電泳亦是一重要的液體驅動力，

T. B. Jones 團隊利用兩個平行的共平面電極，使液體受電場影響被拉進兩電極之 間，達到操控液體的目的，如Fig. 2-15 所示[37,71]。

Fig. 2-15：共平面電極架構圖以及利用介電泳現象驅動液體[15,71]。

此外，介電泳不但可以用來驅動介電濕潤難以控制的介電液體(Dielectric liquid)[44]，亦可以用來驅動液體中的固體顆粒、細胞等等[52,72]，又稱為顆粒介 電泳(Particle dielectrophoresis, PDEP)，又更加擴大了其應用範圍。S. K. Fan 團隊 [44,73]藉由改變電控微流體平臺輸入之電訊號的頻率，可以切換使用介電濕潤以 及介電泳做為主要驅動液體的機制，得以在同一實驗平臺上做跨尺度的操作，如 Fig. 2-16 與 Fig. 2-17 所示。

Fig. 2-16：利用高低頻率的電訊號產生介電泳及介電濕潤現象，在同一平臺上 操控導電與介電液體[44]。

Fig. 2-17：使用適當的電訊號頻率，利用顆粒介電泳分離液體中的顆粒[73]。

第三章 製程、儀器與實驗系統介紹

本章節將介紹電控微流體平臺之製程、實驗使用的儀器、使用的材料參數以 及實驗系統的架構。

3-1 電控微流體平臺製程

本研究題目中所使用的電控微流體平臺是由兩片表面濺鍍上氧化銦錫(7 Ω/sq, 450 Ω/sq ITO glass, Ruilong)的玻璃基板所構成，其中下板之製程較為複雜，

需經過一連串的半導體光顯影製程方可完成，而上板的製程相對簡易；整個製做 程序皆在黃光室中完成，其中包含了旋轉塗佈(Spin coating)、濕蝕刻(Wet-etching)、

軟烤(Soft bake)、硬烤(Hard bake)等等步驟，使得平臺中的電極形狀可以在微米 尺度下被定義，且基板上得以具有多層功能性材料以利實驗進行。

3-1.1 清洗玻璃基板

先使用玻璃切割機將表面鍍有 ITO 的玻璃基板裁切成適當大小，先後放入 裝有丙酮(Acetone)以及異丙醇(Isopropanol)的玻璃口杯中並使用超音波震盪機各 清洗5 min。清洗步驟完成後，使用去離子水(D.I. water)沖洗玻璃基板，用氣槍將 殘留在基板表面的水珠吹掉後，將玻璃基板置於 150˚C 的電加熱板(Hot plate)上 烘烤5 min 使之乾燥。

3-1.2 蒸鍍光阻貼附層

為了增加光阻與 ITO 玻璃基板間的貼附性，在旋塗光阻前利用氣相蒸鍍的 方式在 ITO 玻璃基板表面覆上一層光阻貼附層 HMDS (Hexamethyldisilazane, Sigma-Aldrich)，如 Fig. 3-1 所示。此過程需在抽風櫃(Fume hood)中進行，為時 10 min。

Fig. 3-1：氣相蒸鍍 HMDS 於 ITO 玻璃基板表面。

3-1.3 旋轉塗佈正光阻

將烘烤後的玻璃基板由電加熱板上取下，放涼後將基板置於旋轉塗佈機 (Spin coater)之載具(Holder)上，滴上適量之正光阻(Positive photoresist, FH-6400L, Fujifilm)，大約為整個玻璃基板面積的一半即可，並以 3000 rpm 之轉速旋轉塗佈 30 s，如 Fig. 3-2 所示；接著將正光阻旋塗完成的玻璃基板置於 95˚C 的電加熱板 上軟烤5 min。

Fig. 3-2：旋塗正光阻於 ITO 玻璃基板上。

3-1.4 曝光、顯影及定影

本實驗室使用之曝光機為接觸式(Contact aligner)，並使用事先經由電腦繪圖 軟體設計的光罩圖形來定義正光阻在顯影後的圖案。將附有一層正光阻的玻璃基 板放置在接觸式曝光機之載台上，使用波長為365 nm 之紫外光進行曝光 3.5 s。

曝光完成後將玻璃基板放入裝有顯影液(Developer, FHD-5, Fujifilm)玻璃口杯中

進行顯影，將未遮光的正光阻區域去除；待顯影完成後將基板取出，接著放入裝 有去離子水之玻璃口杯中靜置20 min，此步驟又稱定影。最後將基板取出，置於 150˚C 的電加熱板上硬烤 30 min，使殘留在基板上光阻更加穩固以利接下來的濕 蝕刻步驟，整個流程如Fig. 3-3 所示。

Fig. 3-3：基板經過曝光後放入顯影劑，定義正光阻圖案，最後放入水中定影。

3-1.5 濕蝕刻

將硬烤後的玻璃基板由電加熱板上取下，並放入裝有溫度維持在 47˚C 之稀 釋王水溶液(Diluted aqua regia, HNO3:HCl:H2O=1:3:6)之玻璃口杯中 4 min 進行濕 蝕刻。配製稀釋王水溶液時須先將鹽酸(HCl)徐徐加入去離子水中，最後再加入 硝酸(HNO3)，順序不可錯置以免發生放熱噴濺等危險。在確認每個電極之間沒有 互相導通之後，即完成蝕刻步驟，接著將基板放入裝有去光阻劑(Stripper, MS- 2001, Fujifilm)之玻璃口杯中，待殘留之正光阻被去除後再進行下一步驟，整個流 程如Fig. 3-4 所示。

Fig. 3-4：將基板放入稀釋王水溶液中進行濕蝕刻，以定義 ITO 電極圖案，隨後 將基板放入去光阻劑中，去除殘留之正光阻。

3-1.6 旋轉塗佈介電層

在確認玻璃基板上已無正光阻殘留後，重覆清洗玻璃基板之步驟，將基板依 序利用丙酮與異丙醇清洗乾淨，此時基板上應有如同事先設計之圖案定義過的 ITO 電極，將基板置於旋轉塗佈機之載台上，滴上適量之介電層材料；本實驗所 使用之介電層材料為SU-8 (SU-8 2002, MicroChem)，依續經過 1500 rpm，10 s 及 4500 rpm，60 s 之旋塗參數塗布，如 Fig. 3-5 所示。同先前處理旋塗完成正光阻 的玻璃基板，先經95˚C 軟烤 5 min 再將基板放置於接觸式曝光基之載台上，並 以波長 365 nm 之紫外光曝光 20 s，以確實固化 SU-8，最後依續以 95˚C 軟烤 5 min 以及 150˚C 硬烤 30 min 揮發殘留物質並固定介電層。此功能性塗層的存在 使得在電控微流體平臺上可以產生介電濕潤現象，藉此達到操控液體之目的。

Fig. 3-5：旋塗介電層於已定義 ITO 電極形狀之基板上。

3-1.7 旋轉塗佈疏水層

將硬烤後的玻璃基板由電加熱板上取下，放涼後將基板置於旋轉塗佈機之載 具上，滴上適量之疏水層材料；本實驗所使用之疏水層材料為 Teflon (1% (w/v) AF 1600 in FC-770, DuPont)，旋塗參數為 3000 rpm，30 s，如 Fig. 3-6 所示。疏水 層旋塗完成後將基板置於 150˚C 之電加熱板上硬烤 30 min。此功能性塗層使得 基板表面具疏水性質，利於電控微流體平臺操控各式液體。

Fig. 3-6：旋塗疏水層於表層。

3-1.8 上板表面處理

以上為電控微流體平臺中的下板完整製程，而上板之製程依實驗需求而有不 同的表面處理，以下將依使用之材料分類介紹。在此也量測體積為4 μL 之去離 子水於各式材料表面之接觸角，如Table 1 所示，來展示各表面塗層之親疏水性。

3-1.8.1 1% Teflon

同下板製程一開始須先清洗ITO 玻璃基板，去水烘烤後旋轉塗佈塗 1% (w/v) Teflon，旋轉參數為 3000 rpm，30 s，並以 150˚C 之電加熱板上硬烤 30 min。在 以不含細胞之水膠預聚物溶液為操控液體時，皆使用此疏水塗層以利液體的移動。

3-1.8.2 5% GelMA with F127

同下板製程一開始須先清洗 ITO 玻璃基板，去水烘烤後旋轉塗佈塗 5%

GelMA 水膠預聚物溶液；此溶液以等張溶液 PBS (Phosphate-buffered saline，Gibco) 為溶劑，另外加入 0.5% (w/v)之光起始劑(Photo initiator, Irgacure 2959, Pufong Enterprise CO; Ltd)、5% (w/v)之 GelMA 以及 0.08% (w/v)之 F127 (Pluronic F127, Sigma-Aldrich)，旋塗參數為 3000 rpm，30 s，並在實驗前照射 UV 光至少 30 min。

使用此塗層之原因將在章節4-4 作探討。

Table 1：量測一體積為 4 μL 之去離子水於各式材料表面之接觸角。

(比例尺：1 mm)

Surface Image Contact angle

Blank glass 68.44˚

ITO glass 74.30˚

1% Teflon 109.87˚

5% GelMA with F127 30.18˚

3-2 實驗系統

3-2.1 電控微流體平臺系統

電控微流體平臺的系統架設主要可以分為控制端、電訊號輸入端以及觀察端，

整個系統架設上的簡易圖示如Fig. 3-6：

Fig. 3-7：電控微流體平臺系統架構示意圖。

在控制端方面，利用電腦軟體 LabVIEW 透過 DAQ 介面卡來控制繼電器的 開關與否，換句話說可以透過電腦操作來控制電控微流體平臺上的各個電極的電 位狀態；而電訊號輸入端是由訊號產生器以及電壓放大器所組成，透過調整訊號 產生器之訊號電壓、頻率等參數，得以利用最適合的電訊號去操控液體；最後是 觀察端，將電控微流體平臺架設在顯微鏡載物臺上，使用彩色攝影機搭配電腦軟 體在電腦上觀察液體操控之狀況，並記錄實驗。

3-2.2 細胞培養系統

本實驗使用到不同種類之細胞株，將細胞取出進行實驗之前，其培養方式即 傳統之體外細胞培養(Cell culture)，其操作皆在無菌操作台(Biosafety hood)中進 行，細胞培養所需之環境由可控制溫度與氣體濃度的細胞培養箱(Incubator)來提 供。以下依照購買細胞株後之操作順序介紹：

3-2.2.1 細胞來源以及儲存方式

本實驗使用到的細胞株購自食品工業研究所之生物資源保存及研究中心 (BCRC)，也有一部份是來自國立清華大學劉承賢教授實驗室的慷慨饋贈，以下

無菌操作方法皆參考BCRC 所提供的線上資訊以及教學影片[74]。

細胞在停止進行體外細胞培養時，會以高於 1×10⁶ cell/mL 之細胞濃度將細 胞儲存在冷凍小管(Cryotube, Thermo Scientific)中[74]，一般會加入 1 mL 含有細 胞之溶液，並將冷凍小管存放於溫度約為-195˚C 之液態氮桶中，待欲使用時再將 細胞解凍進行體外細胞培養。

3-2.2.2 細胞解凍

事先準備好已回溫至37˚C 之細胞培養液(Cell culture medium)，並抽取 6 至 7 mL 之細胞培養液加入一 T25 細胞培養角瓶(T25 flask, Thermo Scientific)。待一 切準備就緒，將含有細胞的冷凍小管自液態氮桶中取出，放入水溫為 37˚C 之溫 水槽回溫，回溫過程中輕輕搖晃小管，並避免瓶口接觸到溫水槽中的水。待冷凍 小管中之物質完全變為液體之後，使用75%酒精(75% (v/v) ethanol in D.I. water, Fullin)擦拭小管並移入無菌操作台。先利用手指輕輕拍打冷凍小管底部使液體中 的細胞分散均勻，之後使用移液器(Pipette, Eppendorf Research Plus^®)將管內 1 mL 含有細胞的液體完全抽出，並將該液體徐徐加入事先準備好的 T25 細胞培養角 瓶中，此加入步驟約耗時1 min。將含有細胞的 T25 細胞培養角瓶放入可維持溫 度在37˚C、二氧化碳濃度在 5%之細胞培養箱中，進行細胞培養。解凍細胞隔天 去除細胞培養角瓶中的培養液，加入6 至 7 mL 新鮮的細胞培養液，此步驟之目 的在於去除原本在冷凍小管中之溶液內含有的 DMSO (Dimethyl sulfoxide，

Sigma-Aldrich)；此成分為進行細胞冷凍時需添加之抗凍分子，其原理是縮小細胞 外液體凝固時產生的冰晶體積，避免其傷害到細胞，但其在常溫時對細胞有害，

故應去除之。

3-2.2.3 細胞繼代

在細胞培養角瓶中的細胞貼滿瓶底時，須進行細胞繼代，方可確保貼於瓶底 之細胞得以繼續存活。將角瓶自細胞培養箱中取出，去除瓶中之培養液，接著利 用滴管加入已回溫至37˚C 之 PBS (Phosphate-buffered saline，Gibco) 3 mL 至瓶

中，並稍微晃動角瓶使 PBS 潤濕整個瓶底，再將瓶中溶液去除。隨後加入已回 溫酵素(0.5% trypsin-EDTA, Gibco)至瓶中，加入之酵素量視細胞種類與角瓶大小 而定，一樣稍微晃動角瓶使酵素潤濕整個瓶底，接著將角瓶放入細胞培養箱中約 5 min，此時酵素會作用使細胞與瓶底分離。此過程中準備好新的細胞培養角瓶，

並利用移液器加入新鮮的細胞培養液於角瓶中；以T25 角瓶來說，應加入 7 mL 之細胞培養液，而T75 角瓶則應加入約 13-14 mL 之細胞培養液，以蓋滿整個瓶 底。待酵素將細胞全數切下後，自細胞培養箱中取出含有酵素與細胞之角瓶，並 利用移液器加入三倍酵素體積量的細胞培養液，利用培養液中的蛋白質來終止酵 素之作用。接著將含有細胞的溶液倒入15 mL 之離心管並離心，參數為 1000 rpm，

5 min。離心完成後除去上清液，利用移液器加入 1 mL 細胞培養液並柔和地沖散 細胞，爾後根據欲分裝之盤數抽取適量溶液，最後將其加入已含有新鮮培養液的 角瓶中並放入細胞培養箱。

3-2.2.4 細胞冷凍

為了防止細胞株因培養過程中之汙染而斷絕細胞源、以及在非實驗階段節省 細胞培養相關耗材等等，細胞將會被冷凍起來保存。首先須確定欲冷凍之細胞培 養狀況良好，最好是處於成長曲線中的對數階段(Log phase)，且在進行細胞冷凍 前一天更換培養液，以增加細胞冷凍之成功率。首先需配製抗凍液，利用移液器 在15 mL 離心管中加入 3 mL 之細胞培養基(不同細胞需加入不同培養基，見 3- 3.2.5 至 3-3.2.8)，再於冰水浴中徐徐加入 1 mL DMSO 至該離心管中；由於上述 溶液混合過程為放熱反應，為了避免溶液中之蛋白質受熱變質故須在低溫中操作。

最後再加入4 mL 之 FBS (Fetal bovine serum, Gibco)，抗凍液配製完成，可依相 同比例、不同體積配成。準備好已回溫至37˚C 之細胞培養液以及 PBS，依照細 胞繼代步驟操作，直到將含有細胞之溶液拿去離心；離心前先用移液器取約 50 μL 含有細胞之溶液，注入血球計數器(Hemocytometer, Marienfeld-Superior)中計 算細胞濃度，一般來說每一管冷凍小管中的細胞數量需大於1×10⁶個，每個小管

中之溶液體積均為1 mL，故在計算完細胞濃度後便可確定可以冷凍之細胞管數；

隨後將冷凍小管上寫上細胞株相關資訊，包含日期、細胞種類、保存者、代數等 等。離心完成後去除上清液，利用移液器抽取足量之抗凍液加入離心管中沖散細 胞，並接著將含有細胞的抗凍溶液以每管1 mL 的量分裝至冷凍小管中。隨後將 小管放入漸凍盒(Cryo freezing container, Nalgene)、再放入-80˚C 之冰箱中，將降 溫速率維持在-1˚C/min，避免細胞在降溫過程中受損。隔天再將冷凍小管放入液 態氮桶中保存。在每批冷凍小管被放入液態氮桶後，應取出其中一管進行細胞解 凍，確定該批冷凍之細胞是否存活。

3-2.2.5 小鼠胚胎纖維母細胞(Mouse embryonic fibroblast, NIH-3T3)

此細胞株購自BCRC (Derived from ATCC; ATCC number: CRL-1658)，在組 織工程相關研究中廣為使用，其繼代次數沒有限制，故作為本研究中預實驗所使 用的細胞，其生長形態為紡錘狀，細胞直徑約為5 μm，Fig. 3-8 為該細胞生長狀 況。此細胞之培養液由培養基DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium, Corning) 配 置 而 成 ， 其 中 含 有 1% (v/v)之抗 生素 (100X antibiotic-antimycotic solution, Corning)、1% (v/v)丙酮酸鈉(100X sodium pyruvate, Gibco)以及 10% (v/v) FBS。

Fig. 3-8：NIH-3T3 生長形態。(比例尺：100 µm)

3-2.2.6 人類臍帶靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)

此細胞株由國立清華大學劉承賢教授實驗室慷慨分讓而來，本研究採用此細 胞株來做為生成血管的細胞，為初代細胞(Primary cell)，故其繼代次數有限，約 在體外培養7 至 8 代以後便無法作為研究使用，其生長形態如 Fig. 3-9 所示。本 細胞株之細胞培養液由培養基EGM-2 (Endothelial cell growth medium, Lonza)配 置而成，並另外加入10% (v/v) FBS 以及內皮細胞生長激素組 EBM-2 (Endothelial growth basal medium, Lonza)。

Fig. 3-9：HUVEC 生長形態。(比例尺：100 µm)

3-2.2.7 人類肺臟纖維母細胞(Human lung fibroblast, HFL1)

此細胞株購自BCRC (Derived from ATCC; ATCC number: CCL-153)，本研究 採用此細胞與 HUVEC 進行共培養，已有許多相關研究指出此細胞會增進 HUVEC 的分化與生長[8,75]，此細胞株至少可繼代至 57 代，其生長形態如 Fig.

3-10 所示。本細胞株採用之細胞培養液由培養基 Ham’s F12K (Ham’s F12K medium, Corning)配置而成，其中包含 10% (v/v) FBS 與 1% (v/v)抗生素。

Fig. 3-10：HFL1 生長形態。(比例尺：100 µm)

3-2.2.8 人類肝癌細胞(Human hepatocellular carcinoma, HepG2)

此細胞株由國立清華大學劉承賢教授實驗室慷慨分讓而來，本研究將此細胞 用來模擬人類肝臟小葉中的肝臟細胞，此細胞株無繼代次數限制，其生長形態如 Fig. 3-11 所示。本細胞採用之細胞培養液由培養基 DMEM 配置而成，其中包含 1% (v/v)抗生素、1% (v/v) MNEA (MEM non-essential amino acids, Corning)以及 10% (v/v) FBS。

Fig. 3-11：HepG2 生長形態。(比例尺：100 µm)

3-2.3 水膠材料

本實驗使用之水膠材料皆具光交聯性質，在加入了一定濃度的光起始劑 (Photo initiator, Irgacure 2959, Pufong Enterprise CO; Ltd)之後，此種水膠預聚物溶 液在照射到具足夠能量與照射時間之紫外光時，形態會由原本的液態轉變成固態 或是膠態；本研究使用兩種光交聯的水膠材料，包括gelatin methacrylate (GelMA) 以及具不同平均分子量的 poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA, Mn=250/575 Da, Sigma-Aldrich)，以下將分別做介紹。

3-2.3.1 Gelatin methacrylate (GelMA)

GelMA 是一種具有生物相容性的水膠材料，在加入了光起始劑之後，便可 利用波長為365 nm 之紫外光照射使之聚合。

本實驗使用之 GelMA 是自行合成製作，原料包含 gelatin from procine skin (G2500, Sigma-Aldrich)以及 methacrylic anhydride (Sigma-Aldrich)。首先秤取 10 g 之gelatin from procine skin，與 100 mL 之 PBS 混合均勻後於 50˚C 隔水加熱直至 完全溶解，所需時間約為1 hr；接著利用移液器抽取 8 mL 之 methacrylic anhydride，

加入上述溶液中，並在溶液中放入磁棒攪拌以加速其化學反應，一樣於 50˚C 隔 水加熱約3 hr，如 Fig. 3-12 所示。

Fig. 3-12：在 50˚C 環境下使 gelatin 與 methacrylic anhydride 反應形成鍵結[10]。

在此過程同時須預熱400 mL 之 PBS 至 50˚C，在 3 hr 時間到後加入上述溶 液中，持續使用磁棒攪拌15 min，使其混合均勻。在此過程同時，準備好透析膜 (Spectra/por molecular porous membrane tubing, MWCO 12-14 kDa, Fisher Scientific) 將其裁減至適當長短，將上述混合完成之溶液分裝至透析膜之中，將其兩端開口

密封後，將含有溶液之透析膜管放入去離子水中進行透析，水溫需維持在50˚C，

此步驟為的是去除溶液中殘留之methacrylic anhydride，此透析過程需持續 7 天。

在第 8 天將透析膜管內的溶液利用移液器分裝到 50 mL 之離心管中，並放入- 80˚C 冰箱中保存至少 2 天，在確認管內物質全部變成固體之後，冷凍乾燥管內 物質7 天，最終可得到 GelMA 固體。

3-2.3.2 Poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA)

PEGDA 與 GelMA 皆是光交聯的水膠材料，本實驗使用之材料為具不同鏈 長的PEGDA (Sigma-Aldrich)，故具有不同的平均分子量，包含平均分子量為 250 Da 之 PEGDA (PEGDA 250)以及 575 Da 之 PEGDA (PEGDA 575)。

3-2.3.3 水膠預聚物溶液之交聯反應

在上述光交聯的水膠材料中加入了光起始劑之後便成了水膠預聚物溶液，在 接受到特定波長之紫外光時會產生聚合反應，水膠預聚物溶液也會由液體轉為類 似固體的膠狀物。在水膠預聚物溶液交聯的過程中，由於光起始劑在照射到特定 波長之紫外光後，自身會產生自由基去破壞水膠分子中的雙鍵，在雙鍵被破壞後 分子與分子間產生連鎖效應，最後形成一個網絡，形態也因此轉變。本實驗在 GelMA 與 PEGDA 中添加一定濃度的光起始劑，其在照射到波長低於 400 nm 之 紫外光會分別產生如Fig. 3-13 與 Fig. 3-14 之交聯反應。

Fig. 3-13：GelMA 加入光起始劑並照射紫外光後交聯[10]。

Fig. 3-14：PEGDA 加入光起始劑並照射紫外光後交聯[76]。

3-2.3.4 實驗用水膠預聚物溶液配製

以GelMA 為例，由於要放入細胞，本實驗以等張溶液 PBS 為溶劑，先加入 0.5% (w/v)之光起始劑，避光並加溫至 75˚C 加速其溶解。確認光起始劑完全溶解 後，加入 5% (w/v)之 GelMA，同樣避光並加溫至 75˚C 加速其溶解，待 GelMA 完全溶解後將水膠預聚物溶液放涼，再加入 0.08% (w/v)之 F127 (Pluronic F127, Sigma-Aldrich)以降低生物汙損、蛋白質沾黏的問題(Biofouling)[77-80]。

待水膠預聚物溶液配置完成後，重複細胞培養中的細胞繼代程序，在貼附足 夠細胞的細胞培養角瓶中加入酵素將細胞切下後離心，離心前取出一部分含有細 胞之液體，利用血球計數器計算切下之細胞數量，以控制在水膠預聚物溶液中的 細胞濃度在2.5×10⁶ cell/mL 至 5×10⁶ cell/mL。離心後去除上清液，拍散集中於管 底之細胞，並加入上述配置完成之水膠預聚物溶液，以移液器輕輕吸抽水膠預聚 物溶液使細胞均勻分散，含有細胞之水膠預聚物溶液即配置完成。

以PEGDA 為例，由於平均分子量為 250 Da 與 575 Da 之 PEGDA 在室溫即 為液態，故直接在水膠預聚物溶液中加入1% (w/v)之光起始劑；若需調整 PEGDA 之機械性質，可加入去離子水或是以不同平均分子量的PEGDA 混合調配。加入 光起始劑後避光並加溫至75˚C 加速其溶解。待光起始劑完全溶解後水膠預聚物 溶液即配置完成。