本章節將介紹電控微流體平臺之製程、實驗使用的儀器、使用的材料參數以 及實驗系統的架構。
3-1 電控微流體平臺製程
本研究題目中所使用的電控微流體平臺是由兩片表面濺鍍上氧化銦錫(7 Ω/sq, 450 Ω/sq ITO glass, Ruilong)的玻璃基板所構成，其中下板之製程較為複雜，
需經過一連串的半導體光顯影製程方可完成，而上板的製程相對簡易；整個製做 程序皆在黃光室中完成，其中包含了旋轉塗佈(Spin coating)、濕蝕刻(Wet-etching)、
軟烤(Soft bake)、硬烤(Hard bake)等等步驟，使得平臺中的電極形狀可以在微米 尺度下被定義，且基板上得以具有多層功能性材料以利實驗進行。 方式在 ITO 玻璃基板表面覆上一層光阻貼附層 HMDS (Hexamethyldisilazane, Sigma-Aldrich)，如 Fig. 3-1 所示。此過程需在抽風櫃(Fume hood)中進行，為時 10 min。
Fig. 3-1：氣相蒸鍍 HMDS 於 ITO 玻璃基板表面。
3-1.3 旋轉塗佈正光阻
將烘烤後的玻璃基板由電加熱板上取下，放涼後將基板置於旋轉塗佈機 (Spin coater)之載具(Holder)上，滴上適量之正光阻(Positive photoresist, FH-6400L, Fujifilm)，大約為整個玻璃基板面積的一半即可，並以 3000 rpm 之轉速旋轉塗佈 30 s，如 Fig. 3-2 所示；接著將正光阻旋塗完成的玻璃基板置於 95˚C 的電加熱板 上軟烤5 min。
Fig. 3-2：旋塗正光阻於 ITO 玻璃基板上。
3-1.4 曝光、顯影及定影
本實驗室使用之曝光機為接觸式(Contact aligner)，並使用事先經由電腦繪圖 軟體設計的光罩圖形來定義正光阻在顯影後的圖案。將附有一層正光阻的玻璃基 板放置在接觸式曝光機之載台上，使用波長為365 nm 之紫外光進行曝光 3.5 s。
曝光完成後將玻璃基板放入裝有顯影液(Developer, FHD-5, Fujifilm)玻璃口杯中
進行顯影，將未遮光的正光阻區域去除；待顯影完成後將基板取出，接著放入裝 有去離子水之玻璃口杯中靜置20 min，此步驟又稱定影。最後將基板取出，置於 150˚C 的電加熱板上硬烤 30 min，使殘留在基板上光阻更加穩固以利接下來的濕 蝕刻步驟，整個流程如Fig. 3-3 所示。
Fig. 3-3：基板經過曝光後放入顯影劑，定義正光阻圖案，最後放入水中定影。
3-1.5 濕蝕刻
將硬烤後的玻璃基板由電加熱板上取下，並放入裝有溫度維持在 47˚C 之稀 釋王水溶液(Diluted aqua regia, HNO3:HCl:H2O=1:3:6)之玻璃口杯中 4 min 進行濕 蝕刻。配製稀釋王水溶液時須先將鹽酸(HCl)徐徐加入去離子水中，最後再加入 硝酸(HNO3)，順序不可錯置以免發生放熱噴濺等危險。在確認每個電極之間沒有 互相導通之後，即完成蝕刻步驟，接著將基板放入裝有去光阻劑(Stripper, MS-2001, Fujifilm)之玻璃口杯中，待殘留之正光阻被去除後再進行下一步驟，整個流 程如Fig. 3-4 所示。
Fig. 3-4：將基板放入稀釋王水溶液中進行濕蝕刻，以定義 ITO 電極圖案，隨後 將基板放入去光阻劑中，去除殘留之正光阻。
3-1.6 旋轉塗佈介電層
在確認玻璃基板上已無正光阻殘留後，重覆清洗玻璃基板之步驟，將基板依 序利用丙酮與異丙醇清洗乾淨，此時基板上應有如同事先設計之圖案定義過的 ITO 電極，將基板置於旋轉塗佈機之載台上，滴上適量之介電層材料；本實驗所 使用之介電層材料為SU-8 (SU-8 2002, MicroChem)，依續經過 1500 rpm，10 s 及 4500 rpm，60 s 之旋塗參數塗布，如 Fig. 3-5 所示。同先前處理旋塗完成正光阻 的玻璃基板，先經95˚C 軟烤 5 min 再將基板放置於接觸式曝光基之載台上，並 以波長 365 nm 之紫外光曝光 20 s，以確實固化 SU-8，最後依續以 95˚C 軟烤 5 min 以及 150˚C 硬烤 30 min 揮發殘留物質並固定介電層。此功能性塗層的存在 使得在電控微流體平臺上可以產生介電濕潤現象，藉此達到操控液體之目的。
Fig. 3-5：旋塗介電層於已定義 ITO 電極形狀之基板上。
3-1.7 旋轉塗佈疏水層
將硬烤後的玻璃基板由電加熱板上取下，放涼後將基板置於旋轉塗佈機之載 具上，滴上適量之疏水層材料；本實驗所使用之疏水層材料為 Teflon (1% (w/v) AF 1600 in FC-770, DuPont)，旋塗參數為 3000 rpm，30 s，如 Fig. 3-6 所示。疏水 層旋塗完成後將基板置於 150˚C 之電加熱板上硬烤 30 min。此功能性塗層使得 基板表面具疏水性質，利於電控微流體平臺操控各式液體。
Fig. 3-6：旋塗疏水層於表層。
3-1.8 上板表面處理
以上為電控微流體平臺中的下板完整製程，而上板之製程依實驗需求而有不 同的表面處理，以下將依使用之材料分類介紹。在此也量測體積為4 μL 之去離 子水於各式材料表面之接觸角，如Table 1 所示，來展示各表面塗層之親疏水性。
3-1.8.1 1% Teflon
同下板製程一開始須先清洗ITO 玻璃基板，去水烘烤後旋轉塗佈塗 1% (w/v) Teflon，旋轉參數為 3000 rpm，30 s，並以 150˚C 之電加熱板上硬烤 30 min。在 以不含細胞之水膠預聚物溶液為操控液體時，皆使用此疏水塗層以利液體的移動。
3-1.8.2 5% GelMA with F127
同下板製程一開始須先清洗 ITO 玻璃基板，去水烘烤後旋轉塗佈塗 5%
GelMA 水膠預聚物溶液；此溶液以等張溶液 PBS (Phosphate-buffered saline，Gibco) 為溶劑，另外加入 0.5% (w/v)之光起始劑(Photo initiator, Irgacure 2959, Pufong Enterprise CO; Ltd)、5% (w/v)之 GelMA 以及 0.08% (w/v)之 F127 (Pluronic F127, Sigma-Aldrich)，旋塗參數為 3000 rpm，30 s，並在實驗前照射 UV 光至少 30 min。
使用此塗層之原因將在章節4-4 作探討。
Table 1：量測一體積為 4 μL 之去離子水於各式材料表面之接觸角。
(比例尺：1 mm)
Surface Image Contact angle
Blank glass 68.44˚
ITO glass 74.30˚
1% Teflon 109.87˚
5% GelMA with F127 30.18˚
3-2 實驗系統
傳統之體外細胞培養(Cell culture)，其操作皆在無菌操作台(Biosafety hood)中進 行，細胞培養所需之環境由可控制溫度與氣體濃度的細胞培養箱(Incubator)來提 供。以下依照購買細胞株後之操作順序介紹：3-2.2.1 細胞來源以及儲存方式
本實驗使用到的細胞株購自食品工業研究所之生物資源保存及研究中心 (BCRC)，也有一部份是來自國立清華大學劉承賢教授實驗室的慷慨饋贈，以下
無菌操作方法皆參考BCRC 所提供的線上資訊以及教學影片[74]。
細胞在停止進行體外細胞培養時，會以高於 1×106 cell/mL 之細胞濃度將細 胞儲存在冷凍小管(Cryotube, Thermo Scientific)中[74]，一般會加入 1 mL 含有細 胞之溶液，並將冷凍小管存放於溫度約為-195˚C 之液態氮桶中，待欲使用時再將 細胞解凍進行體外細胞培養。
3-2.2.2 細胞解凍
事先準備好已回溫至37˚C 之細胞培養液(Cell culture medium)，並抽取 6 至 7 mL 之細胞培養液加入一 T25 細胞培養角瓶(T25 flask, Thermo Scientific)。待一 切準備就緒，將含有細胞的冷凍小管自液態氮桶中取出，放入水溫為 37˚C 之溫 水槽回溫，回溫過程中輕輕搖晃小管，並避免瓶口接觸到溫水槽中的水。待冷凍 小管中之物質完全變為液體之後，使用75%酒精(75% (v/v) ethanol in D.I. water, Fullin)擦拭小管並移入無菌操作台。先利用手指輕輕拍打冷凍小管底部使液體中 的細胞分散均勻，之後使用移液器(Pipette, Eppendorf Research Plus®)將管內 1 mL 含有細胞的液體完全抽出，並將該液體徐徐加入事先準備好的 T25 細胞培養角 瓶中，此加入步驟約耗時1 min。將含有細胞的 T25 細胞培養角瓶放入可維持溫 度在37˚C、二氧化碳濃度在 5%之細胞培養箱中，進行細胞培養。解凍細胞隔天 去除細胞培養角瓶中的培養液，加入6 至 7 mL 新鮮的細胞培養液，此步驟之目 的在於去除原本在冷凍小管中之溶液內含有的 DMSO (Dimethyl sulfoxide，
Sigma-Aldrich)；此成分為進行細胞冷凍時需添加之抗凍分子，其原理是縮小細胞
中，並稍微晃動角瓶使 PBS 潤濕整個瓶底，再將瓶中溶液去除。隨後加入已回 溫酵素(0.5% trypsin-EDTA, Gibco)至瓶中，加入之酵素量視細胞種類與角瓶大小 而定，一樣稍微晃動角瓶使酵素潤濕整個瓶底，接著將角瓶放入細胞培養箱中約
最後再加入4 mL 之 FBS (Fetal bovine serum, Gibco)，抗凍液配製完成，可依相 同比例、不同體積配成。準備好已回溫至37˚C 之細胞培養液以及 PBS，依照細 胞繼代步驟操作，直到將含有細胞之溶液拿去離心；離心前先用移液器取約 50 μL 含有細胞之溶液，注入血球計數器(Hemocytometer, Marienfeld-Superior)中計 算細胞濃度，一般來說每一管冷凍小管中的細胞數量需大於1×106個，每個小管
中之溶液體積均為1 mL，故在計算完細胞濃度後便可確定可以冷凍之細胞管數；
隨後將冷凍小管上寫上細胞株相關資訊，包含日期、細胞種類、保存者、代數等 等。離心完成後去除上清液，利用移液器抽取足量之抗凍液加入離心管中沖散細 胞，並接著將含有細胞的抗凍溶液以每管1 mL 的量分裝至冷凍小管中。隨後將 小管放入漸凍盒(Cryo freezing container, Nalgene)、再放入-80˚C 之冰箱中，將降 溫速率維持在-1˚C/min，避免細胞在降溫過程中受損。隔天再將冷凍小管放入液 態氮桶中保存。在每批冷凍小管被放入液態氮桶後，應取出其中一管進行細胞解 凍，確定該批冷凍之細胞是否存活。
3-2.2.5 小鼠胚胎纖維母細胞(Mouse embryonic fibroblast, NIH-3T3)
此細胞株購自BCRC (Derived from ATCC; ATCC number: CRL-1658)，在組 織工程相關研究中廣為使用，其繼代次數沒有限制，故作為本研究中預實驗所使 用的細胞，其生長形態為紡錘狀，細胞直徑約為5 μm，Fig. 3-8 為該細胞生長狀 況。此細胞之培養液由培養基DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium, Corning) 配 置 而 成 ， 其 中 含 有 1% (v/v)之抗 生素 (100X antibiotic-antimycotic solution, Corning)、1% (v/v)丙酮酸鈉(100X sodium pyruvate, Gibco)以及 10% (v/v) FBS。
Fig. 3-8：NIH-3T3 生長形態。(比例尺：100 µm)
3-2.2.6 人類臍帶靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)
此細胞株由國立清華大學劉承賢教授實驗室慷慨分讓而來，本研究採用此細 胞株來做為生成血管的細胞，為初代細胞(Primary cell)，故其繼代次數有限，約 在體外培養7 至 8 代以後便無法作為研究使用，其生長形態如 Fig. 3-9 所示。本 細胞株之細胞培養液由培養基EGM-2 (Endothelial cell growth medium, Lonza)配 置而成，並另外加入10% (v/v) FBS 以及內皮細胞生長激素組 EBM-2 (Endothelial growth basal medium, Lonza)。
Fig. 3-9：HUVEC 生長形態。(比例尺：100 µm)
3-2.2.7 人類肺臟纖維母細胞(Human lung fibroblast, HFL1)
此細胞株購自BCRC (Derived from ATCC; ATCC number: CCL-153)，本研究 採用此細胞與 HUVEC 進行共培養，已有許多相關研究指出此細胞會增進 HUVEC 的分化與生長[8,75]，此細胞株至少可繼代至 57 代，其生長形態如 Fig.
3-10 所示。本細胞株採用之細胞培養液由培養基 Ham’s F12K (Ham’s F12K medium, Corning)配置而成，其中包含 10% (v/v) FBS 與 1% (v/v)抗生素。
Fig. 3-10：HFL1 生長形態。(比例尺：100 µm)
3-2.2.8 人類肝癌細胞(Human hepatocellular carcinoma, HepG2)
此細胞株由國立清華大學劉承賢教授實驗室慷慨分讓而來，本研究將此細胞 用來模擬人類肝臟小葉中的肝臟細胞，此細胞株無繼代次數限制，其生長形態如 Fig. 3-11 所示。本細胞採用之細胞培養液由培養基 DMEM 配置而成，其中包含 1% (v/v)抗生素、1% (v/v) MNEA (MEM non-essential amino acids, Corning)以及 10% (v/v) FBS。
Fig. 3-11：HepG2 生長形態。(比例尺：100 µm)
3-2.3 水膠材料
本實驗使用之水膠材料皆具光交聯性質，在加入了一定濃度的光起始劑 (Photo initiator, Irgacure 2959, Pufong Enterprise CO; Ltd)之後，此種水膠預聚物溶 液在照射到具足夠能量與照射時間之紫外光時，形態會由原本的液態轉變成固態
本實驗使用之水膠材料皆具光交聯性質，在加入了一定濃度的光起始劑 (Photo initiator, Irgacure 2959, Pufong Enterprise CO; Ltd)之後，此種水膠預聚物溶 液在照射到具足夠能量與照射時間之紫外光時，形態會由原本的液態轉變成固態