＊研究背景
在生物的生命系統中，眾多的生化反應都需要酵素(enzyme；酶)進行催化，
讓整個生物系統能夠完整的運作，因此酵素在生物體中扮演著非常重要的角色。
人類藉由 DNA(deoxyribonucleic acid)上的基因密碼(genetic code)轉錄成 mRNA (messenger ribonucleic acid)，mRNA 再轉譯產生蛋白質，而蛋白質就是酵素的主要 成分。上述的這些生物聚合體，需要具有顯著的熱力學穩定性。據估計，在中性 pH、25℃的一般條件下，DNA 之磷酸雙酯鍵(phospodiester bond)的半生期高達 13 萬年之久，RNA 的磷酸雙酯鍵水解半生期則約為 4 年，蛋白質的胜肽鍵(peptide bond)水解半生期則為 7 年左右。然而，在某些特定的情況下，生物細胞仍需要 進行分解或是修補 DNA 或 RNA 序列，例如精確修補突變或受損的 DNA、轉譯 過的 mRNA 需被分解再利用以及分解外來入侵者的 DNA。生物體為了進行這些 生化反應就衍生出一連串酵素來催化，這些酵素統稱為核酸水解酶(Nuclease，為 hydrolases 的一種)1。通常這些自然界中的核酸水解酶，其蛋白質的中心都存在著 金屬離子作為輔因子(cofactor)，其中最常做為輔因子的金屬有 Ca2+、Mg2+、Zn2+、 Mn2+、Fe2+等，這些金屬離子在反應中都扮演著關鍵性的角色。
目前在醫學上，仍然存在著一些難以治療的疾病，例如癌症、遺傳性的疾病，
因此，利用具有專一性的藥物或基因療法，是目前最直接也最有效的治療方式。
人造核酸水解酶(artificial nuclease/ribonuclease)即是利用具有專一辨識性的藥物，
搭配上先進的基因定序技術，將致病的 DNA 或 RNA 序列切除或是抑制其製造出 致病的蛋白質，此研究方向在學術價值引起科學家的注意，同時也在科學以及醫 學上有著實際的應用價值2。在分子生物學上，雖然已經有天然限制酶可以使用，
但是天然限制酶的辨識區域常只有 4-6 個鹼基，核醣核酸長鏈會被切割成很多小 片段，而不是只切割在我們說需要的位置上，造成辨識度不足的缺點，再加上要 從生物體內分離純化所需要的成本高。因此，利用人造核酸水解酶，我們可以切 割在特定的位置上，並且透過需要來調整辨識區對標的的親和力以及切割區的切 割活性，達到特定的目的。另外，透過對人造核酸水解酶的研究，我們可以更進 一步的了解天然限制酶的反應機構。
早期有關人造核酸水解酶的研究，主要著重在了解 RNA 水解機制。RNA 在 五碳糖的第二位置上有一氫氧基（2＇-OH），這個氫氧基在反應機制中被認為扮 演極重要的角色；目前較被廣泛接受水解 RNA 的反應機制包含兩個步驟，轉酯 反應（transesterification）和水解反應。在第一個步驟的轉酯反應中，RNA 上五碳 糖的 2＇-OH 會先解離脫掉氫質子 （deprotonation），並形成強親核基（nucleophile）
alkoxide，之後 alkoxide 會攻擊五碳糖 3＇端磷酸酯鍵之磷原子，形成 2＇,3＇-cyclic phosphate；在第二個步驟的水解反應中，2＇,3＇-cyclic phosphate 會水解為 2＇
-phosphate 及 3＇-phosphate，至此完成整個水解反應。然在轉酯反應中，可能會 形成一個雙三角椎（trigonal bipyrimide）之過渡態，如圖 1-1 所示3,4。
圖 1-1 RNA 水解反應之圖解說明
自然界中的 RNA 常無法穩定的存在，因為有其結構上的優勢，形成 alkaline instability3，水解的速率很快。但是與 DNA 來做比較，可以發現 DNA 的水解就困
難了許多，主要是因為 DNA 在五碳糖的第二位置上是氫，所以水解過程中所需 要的親核基就必須由外界提供；再加上，外來的親核基帶負電，而磷酸酯鍵也帶 負電，同性相斥的結果，造成 DNA 水解反應更不容易進行，因此 DNA 在自然界 可以穩定存在萬年以上。
DNA 的酵素水解通常是依照下列兩步驟，如圖 1-2 所示：
圖 1-2 DNA 水解可能之反應途徑
（1）藉由外來的親核基攻擊在磷原子上，例如：外來的 OH- ，形成五配位的中 間物（pentacoordinated intermediate）。
（2）移除 2＇-deoxyribonucleotide 位置上的 5＇-OH ，且 P-O 鍵斷裂。
此步驟是反應的速率決定步驟。而在非酵素水解反應中，在 3＇端 P-O 鍵的分裂 也會發生5。
天然的核酸酶和限制酶是非常具有專一性，但是卻有鍵結過強的缺點，加上 DNA 水解不易，RNA 水解速率是比 DNA 快 105～106倍。因此除了參考 RNA 水 解的反應特性外，觀察自然界中的水解 DNA 酵素也是一項很好的選擇。最有名 的兩個例子：alkaline phosphatase、purple acid phosphatase。以 E. coli. alkaline phosphatase 為例，如圖 1-3 所示，就是兩個含有鋅離子的酵素，利用 Ser102 在鹼 性環境下無選擇性的水解磷酸單酯鍵(ROPO32-)1,6,7。
圖 1-3 E. coli. alkaline phosphatase 催化磷酸化的轉酯反應過程圖解
因此許多科學家便藉由觀察天然的水解磷酸酯鍵類酵素的結構，發現水解過 程中若有金屬離子的參與，將會使得轉酯和水解兩個步驟更容易進行。據研究指 出，金屬離子在水解過程中可能扮演了下列四種角色，如圖 1-4 所示6：
（a）和水配位後並解離形成金屬氫氧根離子（metal-bound hydroxy anion），金屬 氫氧根離子當作是一個路易士鹼（Lewis base）來拔除 2＇-OH 上的氫，使 其成為 2＇-O-強親核基，攻擊五碳糖 3＇端磷酸酯鍵之磷原子；
（b）配位在 2＇-OH 的氧原子上，吸引氧原子上電子雲，使 2＇-OH 的氫更容易 解離，以形成 2＇-O-親核基（metal stabilized oxyanion）；
（c）轉酯過程中所形成的五配位中間物或過渡態，會由於金屬靜電相吸而提供 其穩定性；
（d）配位在離去基（leaving group）上，穩定離去基，使反應朝向水解方向進行。
圖 1-4 金屬離子在催化水解反應可能扮演的角色
在親核基攻擊的反應部分，可用來幫助加速水解反應的金屬離子包括鎂離子 (Mg2+)、鈣離子(Ca2+)、鐵離子(Fe3+)、鎳離子(Ni2+)、銅離子(Cu2+)、鋅離子(Zn2+)、
鉛離子(Pb2+)、鑭系金屬離子(Ln3+)、二氧化鈾離子(UO2+)和釷鹽(Th salts)等；非金 屬離子的則有 H+、OH-、amines（氨類）和其他含氮化合物8。
由過去的文獻可以得知，由過渡金屬離子和鑭系金屬離子所形成之錯合物的 人造切割試劑中，以三價的鑭系金屬離子對於 RNA 的水解是最有效率的9，且 RNA 水解反應速率會隨著鑭系金屬的原子序增加而遞增；雖然 Ce4+被認知是最有 效率的 DNA 水解促進劑，但是在 RNA 水解促進劑中，卻發現 Tm3+、Yb3+和 Lu3+
等離子是較有效率的10,11。
雖然鑭系金屬離子在水溶液下是很有效率的 DNA 切割試劑，但其在高 pH 值的水溶液下會產生沈澱12，且會對生物體產生毒性；因此設計出一種錯合物是 可保有鑭系金屬的水解切割能力，且不具有生物毒性及安全性，是科學家努力的 方向。為設計出對鑭系金屬有較高親和力的配位子，我們參照 MRI（magnetic resonance imaging） 核磁共振造影試劑的設計13，發現大環配位子遠比線性配位 子對鑭系金屬所形成的錯合物較穩定，更發現到當配位子中在氮原子上有 carboxylate group (乙酸基) 的鍵結，可提供一個帶中性或正電的錯合物之設計方 法。
在 MRI 試劑中被廣泛研究且穩定的配位子是多胺多酸基大環配位子，其中 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid(DOTA)及 1,4,8,11-
tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid(TETA)，由於對三價的鑭系金屬離子 有著高親和力，並在動力學以及熱力學穩定性也都其他配位子較高，所以可以作 為人造 DNA/RNA 切割試劑的配位子基本架構。
至今，已經有不少研究團隊投入在人造 DNA/RNA 切割試劑的研究領域中，
也有重大的研究結果已經發表，我們將根據這些研究結果作為基礎更進一步的來 了解不同配位子及不同鑭系金屬離子錯合物做為人造切割劑的特性以及其應用。
＊文獻回顧
【Breslow et al.】
1986-1990 年， Breslow 等人仿照 alkaline phosphate ，錯合出含有鋅離子(Zn2+) 的含氮大環金屬錯合物，並且進行水解磷酸酯鍵 (DPPNPP) 的相關實驗，實驗結 果指出在 pH=8.7 CH3CN（aq）的環境下，人造水解酶的反應速率會大大提升，他 們推測在這個 pH 值環境下，有一活性物種 (Zinc hydroxide complex) 產生，即金 屬離子上的配位水解離成氫氧根離子形成有效的攻擊基。另外，進一步比較三種 大環錯合物對 DPPNPP 的反應速率可得知，接有官能基之金屬錯合物 1 及 2 ，其水解速率比錯合物 3 分別提升了九及二十倍，顯示這些輔助官能基具有 一般鹼基的功能，可促進催化反應14。
圖 1-5 Breslow 團隊所合成的金屬錯合物
【Hendry 與 Sargeson et al.】
1989-1990 年， Hendry 與 Sargeson 發表含有 Co3+ 及 Ir3+ 的大環錯合物，
並研究其催化水解磷酸雙酯鍵的反應機制，發現 Ir3+比 Co3+之體積大，反應過程 中大環的包覆性（closure）會較差，因此催化速率比 Co3+的錯合物慢。另外，此 金屬錯合物上的金屬離子除了可與磷酸雙酯鍵配位外，還可活化金屬離子的配位 水或胺基，使解離的配位水或胺基可攻擊磷酸雙酯鍵。進一步探討發現大環的開 闔與否，並不是那麼重要，但是在生物體酵素催化傾向於開放性的結構，且生物 中常用來催化的金屬 Mg2+、Zn2+都是比 Ir3+還大的金屬。因此，此研究團隊所提出 的結論較不符合一般生物體內酵素的催化機制15。
圖 1-6 Hendry 與 Sargeson 推測 Co3+ 及 Ir3+ 的大環錯合物水解磷酸雙酯鍵可能之機制
【Krämer et al.】
1996 年，Krämer 的研究團隊以雙官能基催化反應為目的設計出其配位子，
此系列配位子的結構以 2,2-bipyridine (bpy)為主體，並在 pyridine 環上 2 的位置接 上烷基胺(alkylamine)作為一個胺基酸的類似物。三種配位子，一個為胺基上接有 氫，另外兩個分別以乙基及甲基取代，作為立體預先結構化(steric Preorganization) 的對照組，三者皆與 Cu2+錯合形成 L1Cu、L2Cu、L3Cu 16,17。
其中，L1Cu、L3Cu 水解 BNPP(bis(p-nitrophenyl)phosphate)的實驗結果，發現 L1Cu 的反應速率約為 L3Cu 的 1000 倍，推測其主要原因可能是 BNPP 的磷酸雙酯鍵與 金屬離子產生配位作用同時利用氫鍵與其中一個胺基鍵結，經由這樣的雙重活 化，加上受質 BNPP 被帶到合適的位向，再由銅離子活化後的配位水進行親核基 攻擊，完成整個水解反應。
圖 1-7 Krämer 團隊所設計之配位子及其推測的水解反應機制
【Burstyn et al】
自 1993 年開始，Burstyn 以三氮九元環和二價銅離子形成的錯合物為研究主 題，進一步的了解此類金屬錯合物水解 BNPP 的反應機構以及特性。首先利用
自 1993 年開始，Burstyn 以三氮九元環和二價銅離子形成的錯合物為研究主 題，進一步的了解此類金屬錯合物水解 BNPP 的反應機構以及特性。首先利用