＊實驗目的
在先前的研究中，我們發現若取代基有氫氧基的存在，則反應有可能會進行 轉酯反應而非水解反應，那產物不再是 NPP 而是 complex-NPP。另外，吳柏宏 學長利用 UV 光譜學觀察到 EuHEDTA 在 pH11.0 下反應中的產物 NPP 也有進一 步水解成 NP 的現象。因此，我們利用 HPLC 來證實反應為轉酯反應，產物為 complex-NPP 而非 NPP，同時利用積分面積來比較 HPLC 與 UV 光譜學所的的數 據上的差異性，而且觀察是否有進一步的水解反應產生。
＊實驗準備與方法
A.使用藥品
分析樣品：[EuHEDTA]=10mM、[buffer]=100mM、μ=0.1M、pH10.5 的溶液來進 行產物分析。
HPLC 之動相：60% HPLC 級之甲醇／40% 50mM 的磷酸鹽緩衝溶液(NaH2PO4/ Na2HPO4) pH 7.0
HPLC 之固相：C-18 管柱 ( Symmetry ® C18 , 5μm , 4.6mm × 250mm ) 標準品：4-nitrophenolate(NP)、4-nitrophenyl phosphate(NPP)、BNPP
B.實驗儀器
HPLC 系統：Waters Alliance® 2695HPLC 系統 偵測器：Waters 2487 紫外光/可見光偵測器 層析軟體：Waters Empower 色譜管理系統
C.實驗條件
Flow rate：0.5ml/min
Volume of per injection：10μl Running time：20 min
Detected Wavelength : 317nm
＊實驗結果
圖 7-1 EuHEDTA 水解 BNPP 之 HPLC 產物分析圖 peak1: RT 為 5.0min，屬於 NPP；Peak2：RT 為 6.6min，屬於 NP；Peak3：RT 為 13.3min，屬於 BNPP
Time(min)
0 200 400 600 800 1000 1200
Area
0.0 2.0e+5 4.0e+5 6.0e+5 8.0e+5 1.0e+6 1.2e+6 1.4e+6
Area(BNPP) Area(NPP) Area(NP)
圖 7-2 HPLC 產物分析 各個波峰積分面積隨時間的變化圖
從圖 7-1 及 7-2 我們可以看到產物 NPP、NP 的波峰隨著時間持續的增加，受 質 BNPP 隨著時間持續的在減少。同時我們利用波鋒面積來定量，發現在這樣的 時間及條件下 NPP 並不會進一步水解成 NP，由此得知 EuHEDTA 水解磷酸雙酯 鍵的能力遠大於水解磷酸單酯鍵。
接著，我們將積分面積換算成濃度(圖 7-3)，並進一步計算出 BNPP、NPP、
NP 濃度隨時間變化的速率，發現 NP 增加的濃度速率與 BNPP 消耗的速率相同，
但在 NPP 的部份，理應等同於 NP 濃度，但我們意外發現 NPP 的濃度都比 NP 的 濃度高。根據文獻，我們得知某些配位子上的氫氧基會與 BNPP 產生鍵結進行轉 酯反應，造成反應完的產物為 NP 與 complex-NPP，我們推測反應中的 NPP 是接 在我們的錯合物上面，造成其吸收度與單純的 NPP 有所差別，以至於計算出來 的濃度與 NP 的濃度有差距，因此藉由 HPLC 的實驗我們得知 HEDTA 與 BNPP 的反應是進行轉酯反應，進一步我們可以利用 MS 來證實我們的這個推測。另外，
我們觀察到一開始 NP 的濃度為零時，complex-NPP 的濃度卻並不為零，可見一
開始的時候，在３１７nm 有雜訊存在，導致在取面積時有誤差存在，因此在計 算速率常數時，若將一開始的濃度校正後，再次計算速率常數會發現 complex-NPP 與 NP 增加的速率常數與 BNPP 消耗的速率常數大致上相符合，但因為我們無法 精確的對３１７nm 的雜訊校正，導致 complex-NPP 增加的速率常數相對於 NPP 增加的速率常數與 BNPP 消耗的速率常數誤差較大。
Time (Min)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Concentration (M)
0.0 2.0e-5 4.0e-5 6.0e-5 8.0e-5 1.0e-4 1.2e-4 1.4e-4 1.6e-4
[BNPP]
[NPP]
[NP]
圖 7-3 BNPP、NP、NPP 積分面積換算成濃度對時間做圖
Time(min)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
concentration (M)
0.0 2.0e-5 4.0e-5 6.0e-5 8.0e-5 1.0e-4 1.2e-4 1.4e-4
[BNPP]
[NP]
[NPP]
圖 7-4 反應中[BNPP]、[NPP]、[NP]隨時間的變化圖
校正後 BNPP decay rate constant 1.94(±0.01)E-3
NP growth rate constant 1.80(±0.08)E-3
NPP growth rate constant 3.25(±0.20)E-3 1.44(±0.1)E-3
表 7-1 BNPP、NPP、NP 濃度隨時間變化的速率常數
我們也將 HPLC 實驗中 NP 的濃度變化數據計算出 initial rate，進一步的來跟 之前利用 UV 光譜儀的方法來比較，發現使用的儀器不一樣，所求得的 initial rate 偏低(見圖 7-4)，根據 initial rate 的定義是要取反應的前 5%數據來計算，但是 HPLC 的數據點數太少無法取的合適的數據來計算，因此取得的數據為反應的前 10%來 計算，儘管如此，雖然偏低但還是在誤差範圍內，因此水解 BNPP 的動力學實驗，
同樣可以利用 HPLC 來進行，而且利用 HPLC 我們同時可以看見反應中物種的變 化情況，可以更進一步的來推測整個反應機制，了解反應是如何進行的。
雖然，我們在此實驗條件下並沒有辦法將 NPP 與 complex-NPP 的滯留時間分 離開來，但吸收度的差異我們間接證實了產物為 complex-NPP，未來我們可以將 C18 管柱替換成離子交換層析管柱，因為 complex-NPP 與 NPP 所帶的電荷同為負 一價，但是 complex-NPP 的分子量遠大於 NPP 的分子量，離子性的差異性會更顯 著，推測利用離子性交換析管柱來分離可以得到更直接的證據來證實我們的推 論。
EuHEDTA 10mM HPLC experiment
[EuHEDTA] (M)
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
initial rate
0.0 5.0e-9 1.0e-8 1.5e-8 2.0e-8 2.5e-8
圖 7- 4 [EuHEDTA]=10mM HPLC 之 NP 增加 initial rate 計算結果與 UV 光譜實驗結果對照圖