大環配位子DO2PA之熱力學研究與HEDTA鑭系金屬錯合物水解磷酸酯鍵之動力學研究

國

立

交

通

大

學

生物科技所

碩

士

論

文

大環配位子 DO2PA 之熱力學研究與 HEDTA 鑭

系金屬錯合物水解磷酸酯鍵之動力學研究

The Stability Constants of Lanthanide Complexes of

DO2PA and the Promotion of BNPP Hydrolysis by

Lanthanide Complexes of HEDTA

研究生：陳郁頻

指導教授：張 正 教授

大環配位子 DO2PA 之熱力學研究與 HEDTA 鑭系金屬錯合物水解磷酸酯鍵之動 力學研究 學生：陳郁頻 指導教授：張正 博士 國立交通大學生物科技學系﹙研究所﹚碩士班 摘要 鑭系金屬離子(Ln3+ )與其金屬錯合物具有良好的路易士酸特性、高配位數與 高電子密度與熱力學穩定度，且相關研究也已經證實其對於 DNA、RNA 與磷酸 酯鍵的水解有效力，非常適合做為人造水解酶，因此合成設計一個能促進磷酸酯 鍵水解的金屬錯合物，一直是我們實驗室很感興趣的領域。實驗室之前已成功的

合成 LnDO2A+_、LnODO2A+_、LnNO2A+_、LnPhNO2A+_、LnONO2A+_{，且經由實}

驗證實其具有極高水解 BNPP 的效力，同時也了解錯合物配位水數目、位向及其 電性對於水解磷酸酯鍵的影響。 在此，我們合成了 DO2PA(四氮十二元環二丙酸基)大環，並利用電位滴定法 計算出其相關金屬錯合物的穩定常數，發現 DO2PA 的錯合效果不好，在取得足 夠數據前就已經產生金屬氫氧化物沉澱。在 HEDTA 鑭系金屬錯合物水解磷酸酯 鍵 pH 6.96.-10.89 的實驗中，我們發現反應速率大致隨著原子序的增加而減小， 隨著 pH 值的增加而增加；另外，藉由改變 LnHEDTA 錯合物的濃度，同時將相 關數據帶入簡單的飽和動力學反應機構，得到水解 BNPP 時的水解常數 k(first order rate constant)及 LnHEDTA-BNPP 的鍵結常數 K(LnHEDTA-BNPP binding constant)。

The Stability Constants of Lanthanide Complexes of DO2PA and the Promotion of BNPP Hydrolysis by Lanthanide Complexes of HEDTA

Student：Yu-Pin Chen Adviser : Dr. C. Allen Chang

Department﹙Institute﹚of Biological Science and Technology National Chiao Tung University

ABSTRACT

The cationic trivalent lanthanide (Ln3+) ions and complexes have good Lewis

acids ability, high thermodynamics stability, low kinetics lability, high coordination numbers, and charge density. It has been demonstrated to be effective DNA, RNA, and phosphodiester compounds’ cleavage agents. So macrocyclic lanthanide

complexes will be suitable as artificial nucleases. We have been interested in design and synthesis of macrocyclic lanthanide complexes which are capable of catalytically

hydrolyzing phosphodiester bonds. Our lab had synthesized a few ligands LnDO2A+、

LnODO2A+、LnNO2A+_、LnPhNO2A+_、LnONO2A+

and verified they would promote effectively hydrolysis of BNPP by experiment. We also verified more coordinated water would make metal complexes more effectively in hydrolyzing phosphodiester bonds. And metal complexes carry positive charge would enhance its ability in hydrolyzing BNPP.

In this thesis, we report the synthesis of DO2PA (1,7-dicarboxyethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododecane) and their metals complex stability constant determined by potentiometric method. We oberserved that DO2PA is too weak a ligand for the pH titration method to be useful for the determination of the stability constants for most metal ions. Because the metal ions hydrolyze and form hydroxide precipitates before

anymeasurable complexation takes place. In the BNPP hydrolysis by lanthanide complexes of HEDTA at pH 6.96.-10.89 experiment, the reaction rate increases as atomic number decreases and as pH increases. Further, in the [LnHEDTA] = 10 -50 mM experiment, we fit the data into simple-saturation kinetic mechanism and obtain the BNPP hydrolysis first order rate constant and the LnHEDTA-BNPP binding constant.

誌謝

研究生的生活結束了，也代表著我即將踏入人生的另一個階段。 首先要謝謝我的指導教授張正老師讓我學習到對於學術研究該有的態度和 堅持，同時讓我了解到這樣的態度並不是侷限在學術上的，更是對於自己負責的 一種要求。 接著要感謝實驗室的學長姊和學弟：志誠學長、志祥學長、政憲學長、翊帆 學長、幸怡學姊、業琳學姊、玉淳學姊、健葒學姊、麟強學弟，還有我的好朋友 們，謝謝你們在這兩年中的教導與陪伴，讓我的研究生生活不孤單。 最後，我要謝謝我的家人，謝謝你們在我最脆弱的時候，支持我、鼓勵我， 陪著我走過那段我覺得是目前遇到最難熬的時期。有了你們，我就有了勇氣。 兩年的歷練，讓我更了解自己，最重要的是領悟到了不要自我設限。很多時 候自己是可以做的更好的，只是被自己的想法限制住了，而駐足在原地不肯也不 能往前邁進。要相信自己可以變的更好，而不是限制自己變好。

目錄

中文摘要……….i 英文摘要………ii 謝誌………...iv 目錄………v 第一章 緒論………1 研究背景………1 文獻回顧………7 研究目的………..20 第二章 配位子 DO2PA 的合成………21 O,N,O’-Tritosyldiethanoamine 的製備………21 N,N’,N’’-Tritosyldiethylenetriamine 的製備………...21

Disodium salt of N,N’,N’’-Tritosyldiethylenetriamine 的製備………22

Tetratosylcyclen 的製備………...23 1,4,7,10-tetraazacyclododecane 的製備………...24 1,7-bis(benzylcarboxyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane 的製備………25 1,7-bis(benzylcarboxyl)-4,10-bis(3-ethoxy-3-oxopropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane 的製備………..26 1,7-dicarboxyethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane (DO2PA)的製備……….27 第三章 金屬陽離子的準備與標定………..29 金屬陽離子濃度之標定方法………..29 金屬陽離子濃度之標定原理………..30 金屬陽離子濃度之標定………..32 第四章 配位子 DO2PA 質子化常數之研究………..36 配位子 DO2PA 水溶液的配製………36

配位子 DO2PA 溶液濃度標定………36 配位子質子化常數之滴定原理………..40 配位子 DO2PA 之質子化常數………42 第五章 配位子 DO2PA 與金屬陽離子穩定常數之研究………..44 配位子與金屬陽離子之穩定常數計算原理………..44 配位子 DO2PA 與金屬陽離子之穩定常數………45 第六章 LnHEDTA 之動力學研究………...49 反應動力學之實驗原理………..49 LnHEDTA 反應動力學之實驗方法………50 動力學實驗步驟………..51 LnHEDTA 動力學實驗結果………52 LnHEDTA 在不同 pH 值下水解 BNPP………...52 LnHEDTA(Ln=Ce,Nd,Eu,Dy,Er) 水解 BNPP 之 BNPP 濃度效應…………..61 LnHEDTA 水解 BNPP 之 LnHEDTA 濃度效應………63 第七章 LnHEDTA 水解 BNPP 之產物分析………..68 實驗準備與方法………..69 實驗結果………..70 第八章 結論與未來展望………..76 參考文獻………..79 附錄………..84

第一章 緒論

＊研究背景

在生物的生命系統中，眾多的生化反應都需要酵素(enzyme；酶)進行催化， 讓整個生物系統能夠完整的運作，因此酵素在生物體中扮演著非常重要的角色。 人類藉由 DNA(deoxyribonucleic acid)上的基因密碼(genetic code)轉錄成 mRNA (messenger ribonucleic acid)，mRNA 再轉譯產生蛋白質，而蛋白質就是酵素的主要 成分。上述的這些生物聚合體，需要具有顯著的熱力學穩定性。據估計，在中性 pH、25℃的一般條件下，DNA 之磷酸雙酯鍵(phospodiester bond)的半生期高達 13 萬年之久，RNA 的磷酸雙酯鍵水解半生期則約為 4 年，蛋白質的胜肽鍵(peptide bond)水解半生期則為 7 年左右。然而，在某些特定的情況下，生物細胞仍需要 進行分解或是修補 DNA 或 RNA 序列，例如精確修補突變或受損的 DNA、轉譯 過的 mRNA 需被分解再利用以及分解外來入侵者的 DNA。生物體為了進行這些 生化反應就衍生出一連串酵素來催化，這些酵素統稱為核酸水解酶(Nuclease，為 hydrolases 的一種)1 。通常這些自然界中的核酸水解酶，其蛋白質的中心都存在著 金屬離子作為輔因子(cofactor)，其中最常做為輔因子的金屬有 Ca2+ 、Mg2+ 、Zn2+ 、 Mn2+ 、Fe2+ 等，這些金屬離子在反應中都扮演著關鍵性的角色。 目前在醫學上，仍然存在著一些難以治療的疾病，例如癌症、遺傳性的疾病， 因此，利用具有專一性的藥物或基因療法，是目前最直接也最有效的治療方式。 人造核酸水解酶(artificial nuclease/ribonuclease)即是利用具有專一辨識性的藥物， 搭配上先進的基因定序技術，將致病的 DNA 或 RNA 序列切除或是抑制其製造出 致病的蛋白質，此研究方向在學術價值引起科學家的注意，同時也在科學以及醫 學上有著實際的應用價值2 。在分子生物學上，雖然已經有天然限制酶可以使用，

但是天然限制酶的辨識區域常只有 4-6 個鹼基，核醣核酸長鏈會被切割成很多小 片段，而不是只切割在我們說需要的位置上，造成辨識度不足的缺點，再加上要 從生物體內分離純化所需要的成本高。因此，利用人造核酸水解酶，我們可以切 割在特定的位置上，並且透過需要來調整辨識區對標的的親和力以及切割區的切 割活性，達到特定的目的。另外，透過對人造核酸水解酶的研究，我們可以更進 一步的了解天然限制酶的反應機構。 早期有關人造核酸水解酶的研究，主要著重在了解 RNA 水解機制。RNA 在 五碳糖的第二位置上有一氫氧基（2＇-OH），這個氫氧基在反應機制中被認為扮 演極重要的角色；目前較被廣泛接受水解 RNA 的反應機制包含兩個步驟，轉酯 反應（transesterification）和水解反應。在第一個步驟的轉酯反應中，RNA 上五碳

糖的 2＇-OH 會先解離脫掉氫質子 （deprotonation），並形成強親核基（nucleophile）

alkoxide，之後 alkoxide 會攻擊五碳糖 3＇端磷酸酯鍵之磷原子，形成 2＇,3＇-cyclic phosphate；在第二個步驟的水解反應中，2＇,3＇-cyclic phosphate 會水解為 2＇ -phosphate 及 3＇-phosphate，至此完成整個水解反應。然在轉酯反應中，可能會 形成一個雙三角椎（trigonal bipyrimide）之過渡態，如圖 1-1 所示3,4 。 圖 1-1 RNA 水解反應之圖解說明 自然界中的 RNA 常無法穩定的存在，因為有其結構上的優勢，形成 alkaline instability3 ，水解的速率很快。但是與 DNA 來做比較，可以發現 DNA 的水解就困

難了許多，主要是因為 DNA 在五碳糖的第二位置上是氫，所以水解過程中所需 要的親核基就必須由外界提供；再加上，外來的親核基帶負電，而磷酸酯鍵也帶 負電，同性相斥的結果，造成 DNA 水解反應更不容易進行，因此 DNA 在自然界 可以穩定存在萬年以上。 DNA 的酵素水解通常是依照下列兩步驟，如圖 1-2 所示： 圖 1-2 DNA 水解可能之反應途徑 （1）藉由外來的親核基攻擊在磷原子上，例如：外來的 OH- ，形成五配位的中 間物（pentacoordinated intermediate）。

（2）移除 2＇-deoxyribonucleotide 位置上的 5＇-OH ，且 P-O 鍵斷裂。

此步驟是反應的速率決定步驟。而在非酵素水解反應中，在 3＇端 P-O 鍵的分裂

也會發生5

。

天然的核酸酶和限制酶是非常具有專一性，但是卻有鍵結過強的缺點，加上

DNA 水解不易，RNA 水解速率是比 DNA 快 105

～106

倍。因此除了參考 RNA 水 解的反應特性外，觀察自然界中的水解 DNA 酵素也是一項很好的選擇。最有名 的兩個例子：alkaline phosphatase、purple acid phosphatase。以 E. coli. alkaline phosphatase 為例，如圖 1-3 所示，就是兩個含有鋅離子的酵素，利用 Ser102 在鹼

圖 1-3 E. coli. alkaline phosphatase 催化磷酸化的轉酯反應過程圖解

因此許多科學家便藉由觀察天然的水解磷酸酯鍵類酵素的結構，發現水解過 程中若有金屬離子的參與，將會使得轉酯和水解兩個步驟更容易進行。據研究指

出，金屬離子在水解過程中可能扮演了下列四種角色，如圖 1-4 所示6

：

（a）和水配位後並解離形成金屬氫氧根離子（metal-bound hydroxy anion），金屬

氫氧根離子當作是一個路易士鹼（Lewis base）來拔除 2＇-OH 上的氫，使 其成為 2＇-O-強親核基，攻擊五碳糖 3＇端磷酸酯鍵之磷原子；

（b）配位在 2＇-OH 的氧原子上，吸引氧原子上電子雲，使 2＇-OH 的氫更容易

解離，以形成 2＇-O-親核基（metal stabilized oxyanion）；

（c）轉酯過程中所形成的五配位中間物或過渡態，會由於金屬靜電相吸而提供 其穩定性；

（d）配位在離去基（leaving group）上，穩定離去基，使反應朝向水解方向進行。 圖 1-4 金屬離子在催化水解反應可能扮演的角色 在親核基攻擊的反應部分，可用來幫助加速水解反應的金屬離子包括鎂離子 (Mg2+ )、鈣離子(Ca2+ )、鐵離子(Fe3+ )、鎳離子(Ni2+ )、銅離子(Cu2+ )、鋅離子(Zn2+ )、 鉛離子(Pb2+ )、鑭系金屬離子(Ln3+ )、二氧化鈾離子(UO2+ )和釷鹽(Th salts)等；非金 屬離子的則有 H+ 、OH -、amines（氨類）和其他含氮化合物8 。 由過去的文獻可以得知，由過渡金屬離子和鑭系金屬離子所形成之錯合物的 人造切割試劑中，以三價的鑭系金屬離子對於 RNA 的水解是最有效率的9 ，且 RNA 水解反應速率會隨著鑭系金屬的原子序增加而遞增；雖然 Ce4+ 被認知是最有 效率的 DNA 水解促進劑，但是在 RNA 水解促進劑中，卻發現 Tm3+ 、Yb3+ 和 Lu3+ 等離子是較有效率的10,11 。 雖然鑭系金屬離子在水溶液下是很有效率的 DNA 切割試劑，但其在高 pH 值的水溶液下會產生沈澱12 ，且會對生物體產生毒性；因此設計出一種錯合物是 可保有鑭系金屬的水解切割能力，且不具有生物毒性及安全性，是科學家努力的 方向。為設計出對鑭系金屬有較高親和力的配位子，我們參照 MRI（magnetic resonance imaging） 核磁共振造影試劑的設計13 ，發現大環配位子遠比線性配位 子對鑭系金屬所形成的錯合物較穩定，更發現到當配位子中在氮原子上有 carboxylate group (乙酸基) 的鍵結，可提供一個帶中性或正電的錯合物之設計方 法。

在 MRI 試劑中被廣泛研究且穩定的配位子是多胺多酸基大環配位子，其中 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid(DOTA)及 1,4,8,11- tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetraacetic acid(TETA)，由於對三價的鑭系金屬離子 有著高親和力，並在動力學以及熱力學穩定性也都其他配位子較高，所以可以作 為人造 DNA/RNA 切割試劑的配位子基本架構。 至今，已經有不少研究團隊投入在人造 DNA/RNA 切割試劑的研究領域中， 也有重大的研究結果已經發表，我們將根據這些研究結果作為基礎更進一步的來 了解不同配位子及不同鑭系金屬離子錯合物做為人造切割劑的特性以及其應用。

＊文獻回顧

【Breslow et al.】

1986-1990 年， Breslow 等人仿照 alkaline phosphate ，錯合出含有鋅離子(Zn2+

) 的含氮大環金屬錯合物，並且進行水解磷酸酯鍵 (DPPNPP) 的相關實驗，實驗結

果指出在 pH=8.7 CH3CN（aq）的環境下，人造水解酶的反應速率會大大提升，他

們推測在這個 pH 值環境下，有一活性物種 (Zinc hydroxide complex) 產生，即金 屬離子上的配位水解離成氫氧根離子形成有效的攻擊基。另外，進一步比較三種 大環錯合物對 DPPNPP 的反應速率可得知，接有官能基之金屬錯合物 1 及 2 ，其水解速率比錯合物 3 分別提升了九及二十倍，顯示這些輔助官能基具有 一般鹼基的功能，可促進催化反應14 。 圖 1-5 Breslow 團隊所合成的金屬錯合物

【Hendry 與 Sargeson et al.】

1989-1990 年， Hendry 與 Sargeson 發表含有 Co3+ 及 Ir3+ 的大環錯合物， 並研究其催化水解磷酸雙酯鍵的反應機制，發現 Ir3+ 比 Co3+ 之體積大，反應過程 中大環的包覆性（closure）會較差，因此催化速率比 Co3+ 的錯合物慢。另外，此 金屬錯合物上的金屬離子除了可與磷酸雙酯鍵配位外，還可活化金屬離子的配位 水或胺基，使解離的配位水或胺基可攻擊磷酸雙酯鍵。進一步探討發現大環的開 闔與否，並不是那麼重要，但是在生物體酵素催化傾向於開放性的結構，且生物 中常用來催化的金屬 Mg2+ 、Zn2+ 都是比 Ir3+ 還大的金屬。因此，此研究團隊所提出 的結論較不符合一般生物體內酵素的催化機制15 。

圖 1-6 Hendry 與 Sargeson 推測 Co3+

及 Ir3+

的大環錯合物水解磷酸雙酯鍵可能之機制

【Krämer et al.】

1996 年，Krämer 的研究團隊以雙官能基催化反應為目的設計出其配位子， 此系列配位子的結構以 2,2-bipyridine (bpy)為主體，並在 pyridine 環上 2 的位置接 上烷基胺(alkylamine)作為一個胺基酸的類似物。三種配位子，一個為胺基上接有 氫，另外兩個分別以乙基及甲基取代，作為立體預先結構化(steric Preorganization) 的對照組，三者皆與 Cu2+ 錯合形成 L1 Cu、L2 Cu、L3 Cu 16,17 。 其中，L1 Cu、L3 Cu 水解 BNPP(bis(p-nitrophenyl)phosphate)的實驗結果，發現 L1 Cu 的反應速率約為 L3 Cu 的 1000 倍，推測其主要原因可能是 BNPP 的磷酸雙酯鍵與 金屬離子產生配位作用同時利用氫鍵與其中一個胺基鍵結，經由這樣的雙重活 化，加上受質 BNPP 被帶到合適的位向，再由銅離子活化後的配位水進行親核基 攻擊，完成整個水解反應。

圖 1-7 Krämer 團隊所設計之配位子及其推測的水解反應機制

【Burstyn et al】

自 1993 年開始，Burstyn 以三氮九元環和二價銅離子形成的錯合物為研究主 題，進一步的了解此類金屬錯合物水解 BNPP 的反應機構以及特性。首先利用 HPLC 來分析 BNPP 水解完的產物為 p-nitrophenyl phosphate 及 p-nitrophenolate，並 進一步證實此金屬錯合物具有高度的選擇性，可與磷酸雙酯鍵反應，而且水解 BNPP 的反應速率約是水解 NPP 的 50 倍18 。除此之外，其水解速率和金屬錯合物 的濃度呈現 1/2 次的關係，顯示其中有不具活性的物種產生，他利用動力學的數 據計算出此雙體的形成常數 Kf為 1220M-1，再根據前人的研究，進一步推測溶液 中活性物種為單體，而雙體為不具活性的物種18,19,20.21 。另外，在不同濃度受質的 實驗中，其切割速率呈現飽和動力學(saturation kinetics)，顯示金屬錯合物和受質 在水解過程中，有中間物的產生；在不同 pH 值環境下，發現水解速率在 pH7.3 有明顯的反曲點，即會有一配位水解離，產生水解 BNPP 的活性物種。綜合這些 結論，他提出下列的反應機制19 ：

圖 1-8 Burstyn 推測 Cu[9]aneN3 水解 BNPP 的反應機制 之後 Burstyn 選取三氮九-十一元環(Cu[9-11]aneN3)與二價銅離子錯合，進行水 解 BNPP 的相關研究，發現水解速率隨著環穴的增大而增加，從九元環到十一元 環增加了一個數量級；從金屬的錯合物的晶體結構來分析，環穴越大，銅離子越 接近三個氮所構成的平面，即越深入環穴中心，造成 N-Cu-N 的鍵角越大，則其 銅離子上的兩個配位水其鍵角越小，使得大環錯合物形成雙體時的立體張力 (steric constraint)增加，因此計算出來的雙體形成常數 Kf隨之下降，相對的水溶液 中的單體活性物種量就較多，所以水解速率得以提升20 。 表 1-1 三氮九-十一元環(Cu[9-11]aneN3)銅金屬錯合物水解 BNPP 之相關常數

2002 年，Burstyn 為了進一步了解立體障礙對於大環金屬錯合物水解 BNPP 的影響，他在三氮九元環的三個氮上都接了異丙基21 ，此大環金屬錯合物 Cu(i-Pr3[9] aneN3)2+其水解速率足足比九元環的銅金屬錯合物快了 60 倍以上。顯示三氮九-十一元環(Cu[9-11]aneN3)這一類的金屬錯合物，其環穴中心金屬鍵角越大越能阻 止不具活性的雙體形成，達到增加水解速率的目的。 圖 1-9 Burstyn 三氮九元環衍生物之結構 表 1-2 三氮九-十一元環及三氮九元環衍生物其水解磷酸酯鍵反應速率之比較 【Morrow et al.】 1992 年，Morrow 發表第一篇關於鑭系金屬錯合物具有催化水解的例子；在 過渡金屬、鑭系金屬與六配位的配位子水解 RNA，發現錯合後的大環鑭系金屬 錯合物具有非常高的熱力學穩定性。22 Morrow 進一步將單純鑭系金屬來進行 RNA 的轉酯催化反應，發現鑭系金屬的催化能力比一般過渡金屬還來的好，推測是因 為鑭系金屬具有更高的路易士酸的特性，但是後來的研究結果指出，鑭系金屬錯 合物的催化效果並非單純遵循路易士酸強度增強而增加，這暗示還有其他因素影

響著催化效果。除此之外， Morrow 推測鑭系金屬的催化機制與一般過渡金屬催 化機制是相類似的。

圖 1-10 Morrow 鑭系金屬形成錯合物之配位子結構式

1996 年，Morrow 將八配位的 TCMC(TCMC = 1,4,7,10-tetrakis- (carbamoylmethyl)

-1,4,7,10-tetraazacyclododecane)與具有十配位的 La3+ 錯合後，發現 TCMC 與 La3+ 之 錯合物具有切割 RNA 的效果，但是若將其與只有九配位的 Eu3+ 錯合後，發現 此錯合物就失去了催化效力。另外，將 Eu3+ 與七配位的 NBAC 錯合，結果發 現此錯合物具有切割能力，因而推測金屬錯合物必須具有兩個配位水，才會具有 切割磷酸雙酯鍵的功效23 。

圖 1-11 Morrow 之 cyclen 衍生物八配位的 TCMC 與七配位的 NBAC 配位子結構式

1998 年，Morrow 延續之前以 cyclen 為主體的研究主題，合成酸基、胺基及 醇基等混合式四取代基衍生物(見圖 1-12)，進行了許多鑭系金屬錯合物切割磷酸 雙酯鍵的研究，發現當取代基中存在有胺基時，可以有效的減少金屬離子的解 離，他推測可能是胺基使的整個大環金屬錯合物更加的勁固(rigid)，造成金屬離

子不容易解離出來，進一步證實這些金屬錯合物不僅具有高穩定性，同時對於催 化水解反應也有相當好的效果24 。 圖 1-12 Morrow 所合成醯胺基及醇基等混合式四取代基衍生物 在此同時，Morrow 的研究由單核金屬錯合物，轉移到多核金屬錯合物上 25,26,27 。根據之前的研究發現人造水解酶如同天然酵素一樣，多官能基的催化是必 須的，而天然的酵素多半有兩個以上的金屬參與催化反應，例如 alkaline phosphate 就是雙金屬活化中心的限制酶。依據這個概念，Morrow 發表了一系列以三氮九 元環為主體的雙核人造水解酶。Morrow 利用 meta 或 para-xylene 將兩個三氮九 元環連接起來，經由滴定得知，在 pH 7.3 的環境下，具有活性的物種會形成，此 活性物種為活化兩個配位水的 Cu2L(OH)22+，雙體錯合物的水解 GpppG 的速率是 單體的 100 倍。而在雙體錯合物濃度與反應速率實驗中，發現高濃度的時候有 飽和的現象，因此推論金屬錯合物可以與 GpppG 以 1:1 及 2:1 的比例進行反應， 根據此推論，他推測出反應機制(圖 1-13)，並將相關的數據套入，計算出金屬錯 合物以二比一進行反應的一次速率常數為 1.1×10-4 s-1 ，而一比一比例反應的一次 速率常數為 4.3×10-5 s-1 ，二比一比例的反應速率是一比一的 20 倍。

圖 1-12 Morrow 合成的兩種雙體，mXTD、pXTD 圖 1-13 Morrow 推測的反應機制 2003 年，Morrow 利用 1, 3-dibromo-2-propanol 作為架橋，將兩個三氮九元環 連結起來形成一新的雙核配位子 L2OH(見圖 1-14)。此配位子，在中性的環境下， 可以與兩當量的 Zn2+ 錯合形成穩定的錯合物 Zn2(L2O)。在 pH=7.6、25℃ 下， Zn2(L2O)水解 HPNP 的動力學實驗結果顯示，Zn2(L2O)的二級反應常數是 Zn(L1) 的 120 倍。從這結果我們可以知道，Zn2(L2O)的兩個 Zn2+可以透過協同作用來穩 定 HPNP 的中間過渡態(見圖 1-15)，達到增加水解速率的效果26 。 圖 1-14 Morrow 三氮九元環雙核配位子之結構式

圖 1-15 Morrow 提出的 Zn2(L2O)，水解 HPNP 的反應中間結構式 2004 年，延續前一年的研究，Morrow 將配位子 L2OH 與其他過渡金屬元素 (Cd2+ 、Cu2+ 、Zn2+ )錯合，發現在 pH 9.3、25℃的環境下，Cd2(L2O) 的水解 HPNP 的 速率，遠比 Cu2(L2O) 增加了三個級數。此外， Cd2(L2O) 也展現不同另外兩個 金屬錯合物的特性， Cd2+ 要與配位子形成穩定的雙核配位子必須在高 pH 值環 境下 (pH=10.4) ，而 Cu2+ 及 Zn2+ 卻只要在中性環境下就可形成穩定的雙核配位 子。而進一步 Cd2(L2O) 水解 HPNP 研究指出，雙金屬核物種是比單金屬核物種 更有效的催化物種。 2006 年28 ，利用雙金屬核錯合物 Zn2(L2O)為研究主題，探討雙核金屬錯合物 對於受質選擇性的問題，選用了三種不同的受質 HpPNP、UpPNP、UpU，其中 HpPNP、UpPNP 在整個反應中的離去基是屬於弱鹼性的，而 UpU 在反應中的離 去基是和 RNA 在反應中的離去基相同的，是屬於強鹼性的。假設在水解反應機 制是先形成中間過渡態，中間過渡態再進一步水解形成產物，那麼穩定中間過渡 態和離去基就扮演著重要的角色。實驗結果發現 Zn2(L2O)提供給 UpU 切割過渡

態的穩定度比 UpPNP 多了 2.1 kcal/mol，這證明了 Zn2(L2O)可以成功的穩定帶著

負電的離去基，進一步了解水解反應機制確實有經過一個中間過渡態，且加速反 應速率的其中一個條件就是有效的穩定中間過渡態。另外，HpPNP 切割過渡態 的穩定度比 UpPNP 多了 2.4 kcal/mol。Morrow 推測其可以穩定中間過渡態的原因

(2) Zn2(L2O)穩定切割 UpU 中 C-5＇離去基的 oxyanion 之效果比穩定切割 UpPNP

的好。

圖 1-16 Morrow 在 2006 年研究的雙核金屬錯合物和受質的結構式

【Yatsimirsky et al.】

自 1998 年起，Yatsimirsky 發表鑭系金屬與 BTP(Bis-Tri propane) 錯合後切割

BNPP 、 NPP 及 NPA 的研究29,30

。

圖 1-17 BTP(Bis-Tri propane) 與 BNPP、NPP 及 NPA 之結構式

在 25℃、pH=7-9 的環境下，利用電位滴定法決定水溶液中的物種組成，水 溶液中一共有四種雙核物種，分別各帶有 2、4、5、6 個 hydroxides 。根據動力

學研究的推導，可決定岀其速率定律式，並配合物種分配圖，以多重回歸計算出 各物種的速率常數，其結果顯示隨著物種的 hydroxides 越多，其反應速率就越 快，而在相同的 hydroxides 數目下， La3+ >Pr3+ >Nd3+ >Eu3+ >Gd3+ >Dy3+ 。 2005 年， 更進一步研究以 Ce4+ 為主的鑭系金屬離子錯合物，發現在不同 pH 值條件下， 溶液中會有不同物種組成，而主要有效的催化物種也會跟著變動，例如當溶液 pH 由 7 降到 5 時，則溶液內的物種就會由 Ce4(OH)15+ →Ce4(OH)142+ → Ce4(OH)133+ ，物種催化能力隨著帶電性而增強31 。 【Thorfinnur et al.】 2005 年發表以 cyclen 為主體的人造核酸水解酶，他將新合成的配位子(見圖 1-18)與 La3+ 及 Eu3+ 錯合後，在 37℃ 、中性環境進行催化 HPNP 水解的動力 學實驗，結果發現 La3+ 錯合物的催化速率會隨著 pH 值上升，之後又在 pH=8.5 又下降， Eu3+ 的錯合物並不會隨著 pH 改變而水解速率有明顯的變化。他推測 可能是 La3+ 有兩個配位水，比 Eu3+ 多了一個配位水，在 pH 上升後 La3+ 兩個配 位水皆解離而失去反應活性，因此 La3+ 的錯合物水解 HPNP 會隨 pH 值改變，而 Eu3+ 錯合物的水解反應則無關 pH 值，以下為其所推論的 La3+ 水解模型32 。 圖 1-18 Thorfinnur 所合成之配位子 圖 1-19 Thorfinnur 推測 La3+ 錯合物之水解反應機制

【Chang et al.】—Our lab

要研究方向，並將這些大環配位子與鑭系金屬錯合來進行人工水解酶的研究。選 擇酸基為取代基是因為接上酸基的大環配位子與鑭系金屬錯合後，會形成電中性 或帶正電，與帶負電的磷酸酯鍵才能進行有效的反應。 根據前人的研究，我們得知 LnDO2A+ 有著良好的熱力學穩定性以及動力學 鈍性的錯合物，接著進行了一連串 LnDO2A+ 與其它鑭系金屬配位子的動力學實 驗。首先進行不同鑭系金屬與 DO2A 錯合後水解 BNPP 的效率比較，發現 EuDO2A+ 具有最好的水解效力；再藉由 EuDO2A+ 、 EuK21DA+ 及 EuEDDA 水 解 BNPP 的實驗得知，配位水越多，其金屬錯合物的水解效力就越好；藉由 EuDO2A+ 與 EuHEDTA 的水解 BNPP 實驗，可得知錯合物的帶電性會影響金屬 錯合物對磷酸雙酯鍵的水解效果33,34 。 接著選擇 NO2A 為研究主題，探討減少配位數對金屬錯合物的影響；另外， 為了防止多體錯合物的形成，我們合成了 PhNO2A，預期以增加立體障礙來抑制 雙體生成。EuNO2A+ 比 EuDO2A+ 多一個配位水理應水解效果會比較好，但是實 驗結果卻發現與預期的不合。由林玉淳學姊的分子模擬資料顯示35 ，DO2A 因為 環穴比較大，因此 Eu3+ 能深入環穴中心，金屬錯合物上的配位水也因為金屬離子 深入的原因，使得配位水鍵角及間距較為 EuNO2A+ 來的小。當金屬錯合物的配位 水拉近，則會使得金屬錯合物親核攻擊 BNPP 的速率大為增加36 。在 PhNO2A 的 部份，卻因為取代基的立體障礙太大，導致鑭系金屬錯合物的穩定常數很低，不 適合進一步做水解 BNPP 的實驗。 另外，在大環配位子的研究中，除了常用的氮原子做為供電子基（donor） 以外，也有人研究用氧原子替換氮原子的大環配位子，發現對於金屬離子的選擇 性增強，也就是比起替換前的大環配位子對於不同的金屬離子穩定常數增加或減 少，而大環錯合物的構型也會有所改變37,38,39 。所以實驗室就分別合成了 ODO2A

和 ONO2A。LnODO2A+ 比起 LnDO2A+ (Ln=Eu、Yb)形成雙體的速度快 ；在 ONO2A 的部份，我們發現 ONO2A 不論在錯合物的穩定度或是在水解 BNPP 的效力上都 比 NO2A 差，推測其原因可能為將氮原子換成了氧原子，使得整個大環變得比較 具有彈性，所以金屬離子容易游離出來，另外雖然 LnONO2A+ 比 LnNO2A+ 多了一 個配位水，但也許是因為這個原因，ONO2A 形成多核沉澱物的情形比 NO2A 容 易，使得水解的能力不佳。 N N H N HOOC COOH NO2A N N O HOOC COOH ONO2A N N N HOOC COOH Ph-NO2A N O N NH COOH HOOC ODO2A 圖 1-20 本實驗室目前所合成的配位子

＊研究目的 在大環配位子的研究中，除了常用的乙酸基、胺基、醇基做為取代基外，也 有人研究用丙酸基或者更長碳鏈的酸基取代基之大環衍生物，發現這類的大環金 屬錯合物其穩定度上隨著碳鏈的長短而有差別，同時在水解 BNPP 的效果上也觀 察到明顯的變化，可見取代基碳鏈之長短對於大環錯合物在結構上有明顯的影 響，而導致這樣的結果。因此，希望藉由合成四氮十二元環的衍生物 DO2PA (1,7- dicarboxyethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane)與鑭系金屬錯合，以期達到下列之目 的 ： 1.研究 DO2PA 的熱力學以及與鑭系金屬之配位化學 2.研究 LnDO2PA+ 水解 BNPP 的動力學 3.比較 DO2PA 與 DO2A 在錯合物穩定度和水解效力的差異性 另外，在先前實驗室的研究中也發現隨著錯合金屬的不同，其水解 BNPP 的 效率也會有所差異，而且也出現了許多不甚了解的結果，為了更進一步了解鑭系 金屬在這一方面的影響，選擇 HEDTA 為配位子，因為這類的線型配位子與金屬 錯合後反應不似大環配位子複雜，藉由這樣較單純的反應，進而建立鑭系金屬錯 合物水解 BNPP 之模式，為了達到此目的，預計完成下列的實驗： 1.在不同的 pH 值下，進行 LnHEDTA 水解 BNPP 之動力學實驗 2.在不同的 LnHEDTA 濃度下，進行 LnHEDTA 水解 BNPP 之動力學實驗 3.利用 HPLC(高效液相層析儀)來進行產物分析 NH N N HN CH₂CH₂COOH HOOCH2CH2C DO2PA

第二章 配位子 DO2PA 的合成

1.O,N,O’-Tritosyldiethanoamine 的製備： 合成圖： HO N H OH N Ts OTs OTs S O O Cl

diethanoamine p-toluene sulfonyl chloride O,N,O'-Tritosyldiathanoamine

將 21.1 克(0.2 莫耳)二乙醇胺(diethanoamine)加入約 200 毫升三乙基胺 (triethylamine)，使其攪拌並置於冰浴中。將大於三個的當量的對苯硫醯氯 (p-toluene sulfonyl chloride)約 133.3 克(0.7 莫耳)溶於 600 毫升的乙醚(diethylether) 中，並置於加料漏斗中，逐滴將之加入上述溶液中，會漸漸產生大量白色的粉末 狀固體。加完後，移除冰浴，使其繼續攪拌 10 小時以上。將固體過濾，用乙醇、 水、乙醚各約 500 毫升清洗，得白色粉末固體。用乙醇作再結晶，得白色針狀晶 體 97 克，熔點為 90~92℃，產率約為 85%。 2.N,N’,N’’-Tritosyldiethylenetriamine 的製備： 合成圖： H2N N H NH2 HTsN NTs NTsH S O O Cl

p-toluene sulfonyl chloride

diethylenetriamine N,N',N''-Tritosyldiethylenetriamine

將 20.6 克(0.2 莫耳)的二乙基三胺(diethenylenetriamine)加入氫氧化鈉水溶液 (28 克氫氧化鈉溶於 200 毫升水)中，使其攪拌並置於冰浴中。將大於三個的當量 的對苯硫醯氯(p-toluene sulfonyl chloride)約 133.3 克(0.7 莫耳)溶於 600 毫升的乙 醚(diethylether)中，並置於加料漏斗中，逐滴將之加入上述溶液中，會漸漸產生

大量白色的粉末狀固體。加完後，移除冰浴，使其繼續攪拌 10 小時以上。將固 體過濾，用乙醇、水、乙醚各約 500 毫升清洗，得白色粉末固體。用乙醇作再結 晶，得白色顆粒狀晶體 81 克，熔點為 167~169℃，產率約為 70%。

3.Solution of disodium salt of N,N’,N’’-Tritosyldiethylenetriamine 的製備： 合成圖： HTsN N Ts NTsH N,N',N''-Tritosyldiethylenetriamine NaTsN N Ts NTsNa

Disodium salt of N,N',N''-Tritosyldiethylenetriamine

NaH DMF

將 28.3 克(0.05 莫耳)的 N,N’,N’’-Tritosyldiethylenetriamine 溶於 250 毫升 DMF 中，接著緩慢加入 10 克的 NaH 於上述溶液中。加完後，再使其攪拌 30 分鐘。 過濾去掉反應完的 NaH，得到淡黃色 disodium salt of N,N’,N’’-Tritosyldiethylene- triamine 的溶液。 討論： (1)本反應非常劇烈，NaH 要慢慢的加入。另外要小心處理過濾後多餘的 NaH， 不要碰到水，不然會有著火的疑慮。 (2)本反應可以用鈉金屬，溶劑使用無水酒精，一定要使用無水酒精，因為鈉金 屬跟水的反應很劇烈。另外，鈉金屬塊在空氣中暴露太久，會被氧化發熱，有 著火的危險。

4.Tetratosylcyclen 的製備： 合成圖： NaTsN N Ts NTsNa Disodium salt of N,N',N''-Tritosyldiethylenetriamine N Ts OTs OTs O,N,O'-Tritosyldiathanoamine NTs TsN TsN NTs Trtratosylcyclen DMF 將上述 3.利用油浴加熱至 100~110℃。將 29.9 克的 O,N,O’-Tritosyldiethano- amine 溶於約 200 毫升的 DMF 中，接著將其用分液漏斗逐滴加入以加熱至 100~ 110℃的 3.。滴加完成後，繼續在 100~110℃下反應 10 小時以上，得到澄清的橙 色液體。接著將橙色液體減壓濃縮至約 200 毫升，此時會有大量的固體產生。將 濃縮完含有固體的溶液緩慢加入攪拌中的大量清水中(約 1 公升)，會有大量的米 白色粉狀固體產生。過濾取的粉末狀固體，並用水和乙醇清洗固體。接著將已乾 燥的粉末狀固體溶於約 350 毫升的氯仿(chloroform)中，然後用相同體積已沸騰的 酒精加入其中作再結晶，得到白色的粉狀固體 25.6 克，熔點為 294~296℃，產率 約為 65%。 討論：

(1)Solution of disodium salt of N,N’,N’’-Tritosyldiethylenetriamine 與 O,N,O’-Tri- tosyldiethanoamine 的濃度約為 0.1M 與 0.2M 時，產率較高。

(2)再結晶時，是將粗產物溶於氯仿中，再加酒精逼出固體。先濾掉少量析出的 固體，取中間析出的部分較純。

5.Cyclen(1,4,7,10-tetraazacyclododecane)的製備： 合成圖： NTs TsN TsN NTs Trtratosylcyclen NH HN NH HN

sulfate salt of cyclen

conc. H₂SO₄ 將 24 克(約 0.03 莫耳)的 Tetratosylcyclen 溶於 120 毫升的濃硫酸中，在 120~130 ℃下反應 56 小時以上，得到黑褐色的濃稠液體。等卻後，慢慢加入約 700 毫升 的乙醚清洗，並劇烈攪拌，會有固體產生，停止攪拌待固體沉澱置燒杯底部，再 將乙醚慢慢倒出，留下固體；如此進行四次，接著風乾，得到易潮解的灰色固體。 將上述的灰色固體溶於約 300 毫升的二次水中，加熱至約 60℃移除殘留的乙醚， 接著加入活性炭及碳酸鋇在 80℃下反應 30 分鐘。過濾移除活性炭及碳酸鋇，並 用 12N 的氫氧化鈉將溶液的 pH 值調至大於 12。接著減壓濃縮，將體積濃縮成約 150 毫升，接著用相同體積的氯仿(chloroform)萃取三次，收集氯仿層，抽乾氯仿 得到白色的固體 4.38 克，產率約為 84%。 討論： (1)如果溫度超過 150℃，反應時間要縮短，不然會導致溶液變的非常黏稠，無法 用乙醚清洗。

6. 1,7-bis(benzylcarboxyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane 的製備48 ： 合成圖： NH HN NH HN NH N N HN COOCH2Ph PhH2COOC Benzyl chloroformate pH2~3 Cyclen 1,7-bis(benzylcarboxyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane 將上述萃取之大環 5 克(約 29 毫莫耳)，溶於 85 毫升的二次水中，並用 2M 的 HCl 將 pH 值調整至 2-3，再加入 60 豪升的對二氧六圜(p-dioxane)，在冰浴中攪 拌。將約 13.75 克(80.6 毫莫耳)的 benzylchloroformate(2 當量，約 30%的過量)溶於 40 毫升的對二氧六圜中，並用約 8~10 小時的時間緩慢將 benzylchloroformate 加入 上述的溶液中。在滴加過程中用 2M 的 NaOH 維持 pH 值在 2~3，待加完 benzylchloroformate 且 pH 值不再變化後，減壓濃縮抽乾，會得到黃色帶有白色固 體的油狀物。抽乾產生的油狀物用 200 毫升的乙醚清洗四次，接著加入約 80 毫 升 20%(w/v)氫氧化鈉水溶液溶解之。用 150 毫升 x4 的乙醚萃取，收集乙醚層並 用 5%(w/v)40 毫升 x2 清洗，接著加入硫酸鈉乾燥之，減壓濃縮抽乾乙醚，得油 狀物 10.5 克，產率約為 78%。 討論： (1)此反應溶劑若用 THF，產率相對的降低很多。 (2)水和對二氧六圜可形成沸點較兩者低的共沸物，使得反應物可以在同一相中反 應，提高反應的效率。 (3)根據參考文獻，粗產物第一次用乙醚清洗，可以洗去四取代的副產物。

7. 1,7-bis(benzylcarboxyl)-4,10-bis(3-ethoxy-3-oxopropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane 的製備48 ： 合成圖： NH N N HN COOCH₂Ph PhH₂COOC N N N N CH₂CH₂COOC₂H₅ C₂H₅OOCH₂CH₂C COOCH₂Ph PhH₂COOC Ethyl-3-bromopropionate 1,7-bis(benzylcarboxyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane 1,7-bis(benzylcarboxyl)-4,10-bis(3-ethoxy-3-oxopropyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane 將上述油狀物(1,7-bis(benzylcarboxyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane )11.4 克 (25.9 毫莫耳)溶於乾燥過的乙腈(Acetonitrile)100 毫升中，再加入 8.04 克的 N,N- diisopropylethylamine，並加熱至 50℃。將 12.45 克(68.8 毫莫耳)的 Ethyl-3-bromo- propionate 緩慢加入上述的溶液中，在 75℃下持續反應 72 小時。減壓濃縮抽乾得 黃色油狀物。加入 200 毫升乙醚溶解此油狀物，並加入 80 毫升的二次水，進行 萃取，收集乙醚層。接著依序用二次水 80 毫升 x2、5%氫氧化鈉水溶液 50 毫升 x2、二次水 80 毫升 x2 清洗乙醚層，並用無水硫酸鈉乾燥之。減壓濃縮抽乾乙醚， 得黃色油狀物 4.8 克，產率約為 29%。

8. 1,7-dicarboxyethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane (DO2PA)的製備： 合成圖47 ： N N N N CH2CH2COOC2H5 C2H5OOCH2CH2C COOCH2Ph PhH2COOC 1,7-bis(benzylcarboxyl)-4,10-bis( 3-ethoxy-3-oxopropyl)- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane NH N N HN CH2CH2COOH HOOCH2CH2C 1,7-dicarboxyethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane (DO2PA) HCl_(aq) 取上述油狀物(1,7-bis(benzylcarboxyl)-4,10-bis(3-ethoxy-3-oxopropyl)-1,4,7,10- tetraaza- cyclododecane) 8. 2 克加入 200 毫升 1N 的鹽酸水解之，加熱迴流 24 小時。 減壓濃縮抽乾鹽酸，用極少量的水溶解之，進行陽離子交換樹脂的純化，去除雜 質。得到米色的固體 0.85 克，產率約為 20%。 9.DO2PA 的鑑定： NH N N HN CH2CH2COOH HOOCH₂CH₂C DO2PA

(1)元素分析儀 EA：anal. Calcd for C14H28N4O4．3HCl．1.5H2O

C%，36.99； H%，7.72； N%，12.33 Found： C%，36.88；H%，7.72；N%，12.48 (2)核磁共振儀13 C NMR、1 H NMR、2D NMR：見附錄 (3)電灑法質譜儀 MS(ESI)：M/Z 317.1([M+H+ ])

討論：

從13

C NMR 看來，似乎少了一個 peak。根據 1996 年 Guilard 團隊在 Synthetic

communication 發表了一篇論文40 ，其團隊合成了一系列含氮大環的衍生物，其中 的衍生物 2a 即是以 cyclen 為主體並且在四個氮上都接上了丙酸基，與我們所合 成的 DO2PA 相似，在此衍生物的13 C NMR 分析可以觀察到也是有減少一個 peak 現象；另外，同時參考 2D 的 NMR 圖譜，可以發現在δ(ppm)：41.44 的這根 peak 有重疊的現象發生，再將元素分析與 ESI-MS 的結果一起整合，所以我們合理的 斷定產物的確是 DO2PA。 N N N N COOH COOH HOOC HOOC

圖 2-1 Guilard 在 Synthetic communication 團隊所合成的 2a(1,4,7,10-(tetra-2-carboxyethyl)-1,4,7,10 -tetraazacyclododecane)

第三章 金屬陽離子的準備與標定

＊金屬陽離子濃度之標定方法

為了精確求得配位子對金屬離子的穩定常數，兩者的濃度都必須仔細標定， 建立在配位子與金屬陽離子濃度都準確的基礎上，所得的穩定常數才具有意義。 配位子的標定我們利用電位滴定(Potentiometric Titration)來確定，而金屬離子則用 標準的配位子試劑EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)配合適當的指示劑 直接滴定來確定濃度，EDTA有四個酸基及兩個氮原子具有電子供給團，可以與 金屬離子形成穩定的六配位錯合物(圖3-1)，當所有金屬陽離子皆與配位子反應 後，即達滴定終點(end point)，其莫耳比率為 1：1。

標定金屬離子濃度的實驗，除了配位子試劑及金屬離子外，尚需金屬離子指

示劑（indicator）及緩衝溶液（buffer）。例如Eriochrome Black T在pH 10.0的金屬離

子水溶液中為酒紅色，而當足量的EDTA與金屬離子螯合反應後，溶液會由酒紅 色轉為藍色，此時即達滴定終點。

利用Na2H2EDTA來標定金屬離子時，以下三種方法是較常被使用的：

1. 直接滴定法（direct titration method）：

大約有四十種的金屬陽離子可利用以知濃度的Na2H2EDTA（aq）及適合的指

示劑來直接滴定未知金屬離子溶液濃度。

2. 反滴定法（back titration method）：

先加過量的Na2H2EDTA（aq）到金屬溶液中，再利用標準的其他金屬溶液（Zn2+、

Mg2+

）滴定過量的Na2H2EDTA（aq）達滴定終點。此方法適合以下幾

種情況：（A）金屬離子與Na2H2EDTA（aq）反應速率遲緩；（B）無適合的金屬離子

指示劑；（C）金屬離子容易產生沉澱。

3.交換反應滴定法（exchange reaction titration method）：

過量的Zn-EDTA或Mg-EDTA加入金屬溶液中，若欲分析的金屬與EDTA

形成更穩定的錯合物，則Zn2+

或Mg2+

會游離，再以標準的Na2H2EDTA（aq）

標定其濃度。此法適用於無適合指示劑可用時。 實驗中，所有用來與配位子DO2PA錯合的金屬溶液，濃度都是以Na2H2EDTA直接 滴定法標定而得。 ＊金屬陽離子濃度之標定原理64 當金屬陽離子與配位子試劑莫耳數以1：1的比例混合之後，通常會有下列的 反應發生： b a b a MY Y M+ + − ↔ −

例如，Na2H2EDTA（H2Y）與金屬陽離子在不同的pH值中有下列主要的反應

平衡，式中a值決定pH值大小： 在pH 7～9時，M+a +HY−3 ↔MYa−4 +H+ 在pH 9～10時， +a + −4 ↔ a−4 MY Y M 寫成平衡通式如下：

+ − − + _{+ ↔ +} cH MY Y H M a _c c b a b 平衡常數K可寫成下式：

[ ][ ]

[ ][

M H Y

]

H MY K c c = 式（a.） 而金屬陽離子與配位子所形成的錯合物之反應平衡式可寫成： MY Y M + ↔ 其中金屬離子錯合物的穩定常數為KMY：

[ ]

[ ][ ]

M Y MY K_MY = 式（b.） 實驗過程中，為避免氫離子對金屬離子指示劑造成干擾，在標定金屬離子 時，pH值必須要維持一定的值。例如以Na2H2EDTA標定Ca+2時，pH值要保持在9.0 ～10.0左右，其主要反應平衡式如下： 4 4 − − +a _{+ ↔} a MY Y M

[

]

[ ][ ]

4 4 − + − = Y M MY K _a a MY 式（c.）

[ ]

−4 Y 值會隨著pH值的不同而改變，但在標定過程中，pH值是維持不變的。而

[ ]

−4 Y 與CT的關係式如下： T C ：未形成錯合物之配位子總濃度 4 α ： −4 Y 在未形成錯合物的配位子之相對濃度 i K ：配位子的質子解離常數

(

H_nY ↔H_n−1Y +H+

)

[ ]

Y 4CT 4 =α − _式（d.）

[ ] [

Y HY

] [

H Y

] [

H Y

]

[

H Y

]

CT 4 1 3 2 2 3 4 + + + + = − − − − _式（e.）

[ ]

T C Y 4 4 − = α

[ ]

[ ]

[ ] [ ]

3 4 1 2 2 1 3 2 1 4 3 2 1 4 3 2 1 + + + + _{+ + +} + = H H K H K K H K K K K K K K K K K K 式（f.） 根據式（c.）、式（d.）可得：

[

]

[ ]

MY T a a MY K C M MY K × = ₊ = − 4 4 α 式（g.） MY

K 為條件形成常數（conditional formation constant），會隨著pH值不同而有所不

同。

＊金屬陽離子濃度之標定

1.藥品的準備：

Lanthanide(Ⅲ) nitrate hydrate (Ln(NO3)3‧xH2O) 皆為Aldrich 99.5%以上等級試

藥，過渡金屬Nickel(Ⅱ)-nitrate hexahydrate(Ni(NO3)2‧6H2O)、Copper(Ⅱ) nitrate

trihydrate (Cu(NO3)2‧3H2O)、Zinc(Ⅱ) nitrate hexahydrate (Zn(NO3)2‧6H2O)皆為Merck

G.R 級 試 藥 ， Calcium carbonate (CaCO3) 為 Merck G.R 級 試 藥 ， disodium

ethylenediamine tetraacetic acid (Na2H2EDTA)為Merck G.R級試藥。Buffer材料及指示

劑皆為Aldrich A.C.S及Riedel-de Haën A.C.S級試藥。

2.金屬陽離子與緩衝溶液的配製： A. 0.10 M Ca2+ 溶液的配製： 將過量CaCO3（s）放置在100 ℃的烘箱2～3小時，烘乾後秤取1.009 g，溶於少 量的二次水中，小心地滴入12.0 N HCl（aq）將CaCO3（s）慢慢溶解，最後以100 ml的定量瓶加二次水稀釋成0.10 M的Ca2+

（aq），此為標準濃度的Ca2+（aq）。

B. 0.25M Na2H2EDTA溶液的配製：

秤取9.306克Na2H2EDTA(s)(M=372.24 g/mol)，將之溶解後用100ml的定量瓶稀釋成約

0.25M的溶液。 C.指示劑的配製：

◎取Erichrome black T (EBT)粉末0.2g，用20ml定量瓶將之加水稀釋成1% 的溶液。

◎取Murexide粉末0.02g，用10ml定量瓶將之加水稀釋成0.2%的溶液。 ◎取Xylenol Orange Tetrasodium Salt粉末0.2g，用20ml定量瓶將之加水 稀釋成1%的溶液。 D.緩衝溶液的配製： 緩衝溶液的配製根據Henderson-Hasselbalch equation，

[

+

]

_{=− −}

[ ]

_{[ ]}

₋ − A HA K O H log a log log 3 即，

[ ]

[ ]

HA A pK pH _a − + = log 由所需緩衝溶液的pH值及Ka值，可以求得共軛酸鹼的比例。 ◎ NH3/NH4+（aq） 0.10 M pH 10.0：（Ka=5.70×10-10）

[

]

[

+

]

+ = 4 3 log 24 . 9 0 . 10 NH NH ，

_[

[

]

_]

5.75 4 3 = + NH NH 取 g mole g L M 0.50 53.49 0.40 10 . 0 75 . 6 1 = × × × 的NH4Cl（s），溶於少量二次水， 以 ml ml g mole g L M 0.50 35.05 0.894 29% 5.76 10 . 0 75 . 6 75 . 5 = ÷ ÷ × × × 的NH4OH（aq） （29%）調整pH值至10.0，補水至500ml。 ◎NH3/NH4+（aq） 0.10 M pH 7.0～8.0：（Ka=5.70×10-10）

[

]

[

+

]

+ = 4 3 log 24 . 9 5 . 7 NH NH ，

_[

[

]

_]

0.018 4 3 = + NH NH 取 ml ml g mole g L M 0.50 35.05 0.894 29% 6.76 10 . 0 × × ÷ ÷ = 的NH4OH（aq），以 ml ml g mole g L M 0.50 36.64 1.18 37% 4.12 10 . 0 018 . 1 1 = ÷ ÷ × × × 的HCl（aq）（37%） 調整pH值至7.0~8.0，補水至500 ml。

◎CH3COONa/CH3COOH（aq） 0.10M pH5.0～6.0：（Ka=1.75×10-5）

[

]

[

CH COOH

]

COO CH 3 3 log 76 . 4 5 . 5 − + = ，

_[

[

]

_]

5.50 3 3 = − COOH CH COO CH 取 g mole g L M 0.50 82.03 3.47 10 . 0 50 . 6 50 . 5 = × × × 的CH3COONa（s），溶於少量二次水 中，再以 g ml ml mole g L M 0.50 60.05 1.049 / 0.44 10 . 0 50 . 6 1 = ÷ × × × 的CH3COOH（aq） 調整pH值到約5.0~6.0，再補水至500 ml。

E.金屬陽離子溶液的配製： ◎過渡金屬離子Ni2+ 、Cu2+ 、Zn2+ 、Cd2+ 溶液的配製：

稱取足量的Ni(NO3)2．XH2O（s）、Cu(NO3)2．XH2O（s）、Zn(NO3)2．XH2O（s）、Cd(NO3)2．

XH2O（s），加二次水配製成100 mM的100 ml水溶液。 ◎鑭系金屬離子La3+ 、Ce3+ 、Pr3+ 、Nd3+ 、Sm3+ 、Eu3+ 、Gd3+ 、Tb3+ 、Dy3+ 、Ho3+ 、Er3+ 、 Tm3+ 、Yb3+ 、Lu3+ 溶液的配製： 稱取足量的Ln(NO3)3．XH2O（s），加二次水配製成20 mM鑭系金屬離子20 ml水溶液。 3.標定金屬陽離子 A.EDTA的標定 取5ml Ca2+ 溶液以及10ml NH3/NH4+0.10 M pH 10.0緩衝液，混合於小燒杯中，加入 兩滴0.2% Murexide指示劑，將EDTA溶液滴定至燒杯裡，到達當量點時，溶液由 粉紅變紫。EDTA與Ca2+ 為一比一當量錯合，而由多次滴定的當量點平均值推算出 精確的EDTA濃度。 B.過渡金屬離子的標定 ◎Cu2+ ：取1ml EDTA溶液及5ml NH3/NH4+0.10 M pH 7.0～8.0緩衝液，混合於小燒 杯中，加入兩滴0.2% Murexide指示劑，將Cu2+ 溶液滴定至燒杯中，到達當量點時， 溶液由粉紅色變為藍色，以一比一當量去計算Cu2+ 的濃度。 ◎Ni2+ ：取1ml EDTA溶液及5ml NH3/NH4+0.10 M pH 7.0～8.0緩衝液，混合於小燒杯 中，加入兩滴0.2% Murexide指示劑，將Ni2+ 溶液滴定至燒杯中，到達當量點時， 溶液由粉紅色變為藍紫色，以一比一當量去計算Ni2+ 的濃度。 ◎Zn2+ ：取1ml EDTA溶液及5ml NH3/NH4+0.10 M pH 7.0～8.0緩衝液，混合於小燒杯 中，加入兩滴0.2% Murexide指示劑，將Zn2+ 溶液滴定至燒杯中，到達當量點時， 溶液由粉紅色變為黃色，以一比一當量去計算Zn2+ 的濃度。 ◎Cd2+ ：取1ml EDTA溶液及5ml NH3/NH4+0.10 M pH 7.0～8.0緩衝液，混合於小燒 杯中，加入兩滴Murexide指示劑，將Cd2+ 溶液滴定至燒杯中，到達當量點時，溶

液由粉紅色變為橙色，以一比一當量去計算Cd2+ 的濃度。 C.鑭系金屬離子的標定 因為鑭系金屬在高pH值的水溶液環境下會產生Ln(OH)3的沉澱，故標定其濃度的 時候用低pH值的緩衝液。取2ml Ln3+ 溶液及8ml CH3COONa/ CH3COOH0.10 M pH

5.0～6.0緩衝液，混合於小燒杯中，加入兩滴1.0% Xylenol Orange Tetrasodium Salt 指示劑，將EDTA溶液滴定至燒杯中，到達當量點時，溶液由橙色變亮黃色，以

一比一當量去計算Ln3+

第四章 配位子DO2PA質子化常數之研究

＊ 配位子 DO2PA 水溶液的配製

根據送測元素分析儀Heraeus CHN-O Rapid的結果，N％，12.48；C％，36.88； H％，7.72。在考慮合成DO2PA鹽類的過程，可以合理推測合成後DO2PA鹽類應

該有HCl及結晶水。經過多種的可能組合推算，鹽類應為DO2PA‧3HCl‧1.5H2O，

計算得分子量為452.8。

稱取0.1705 g的DO2PA‧3HCl‧1.5H2O，溶於少量二次水，加入定量瓶中，

補二次水達20 ml，為約20 mM的DO2PA(aq)母液。再取10 ml的DO2PA (aq)母液，定量

瓶稀釋達20 ml，為約10 mM之DO2PA (aq)。 ＊ 配位子DO2PA溶液濃度標定 為了要精確的標定配位子的濃度，我們使用電位滴定法，直接滴定配位子可 決定濃度以及質子化常數；再與金屬離子一起滴定以確定配位子濃度及金屬的錯 合穩定常數。實驗環境保持在0.10M的離子強度下(使用TMACl調整)，而配位子的 濃度為1-2mM，金屬離子則輕微過量2%~5%。在這實驗環境下配位子會與金屬離 子產生1:1的錯合。 1.TiNet 2.4軟體設定： 主要設定參數為Vstep(每滴體積)、Signal Drift(訊號變動上限值)、equilibrium time(每滴最大平衡時間)、Vstop(滴定終止體積)。 2. TMAOH 溶液的標定：

A.配製一級標準酸KHP（potassium hydrogen phthalate）溶液：

次水溶解，加入100 ml定量瓶，配成0.10 M的KHP(aq)標準液。

B. 配製TMAOH（tetramethylammonium hydroxide，(CH3)4NOH）溶液：

取22.73 ml的TMAOH(aq)（～1.1 M）母液，加入50 ml的定量瓶，以二次水稀釋， 得約0.50 M的TMAOH(aq)，為滴定用之鹼液。 配好的鹼液裝置到702 SM Titrino，Metrohm中，鹼液瓶的蓋子除了流通的管 線外，還要再接上一瓶的鹼石灰（eg., Sodalime，Merck），以除去空氣中過多的 水氣及二氧化碳，維持鹼液的濃度。另外，滴定槽接循環水流，控制溫度在25±0.1 ℃。滴定槽內加入0.50 ml的KHP(aq)標準液，在補二次水達5.0 ml，攪拌子攪拌平衡，

以Metrodata TiNet 2.4，Metrohm軟體為滴定計量。TMAOH(aq)與KHP(aq)之滴定為一般

的酸鹼平衡，設定值為 Vstep = 0.004 ml

signal drift = 5 mv/min equilibrium time = 100 s

重複3-5次滴定，由軟體所定出的反曲點平均。再由0.50 ml的0.10 M KHP(aq)

所需的TMAOH(aq)體積計算標定TMAOH(aq)的濃度。

3. 配製 TMACl（tetramethylammonium chloride，(CH3)4NCl）溶液： 取多量的TMACl (s)，置於70 ℃烘箱中3小時，乾燥。稱取4.38 g之TMACl (s)， 二次水溶解，加入20 ml定量瓶，配成2.0 M的TMACl (aq) ，為所需之離子強度劑。 離子強度的計算方法：

[ ]

[ ]

[ ]

{

+ + +L

}

= 2 2 2 2 1 _{Aa Bb Cc} μ [A]、[B]、[C] …代表該A、B、C…離子的莫耳濃度； a、b、c…則代表A、B、C…離子的電荷 以CuDO2PA為例：

DO2PA‧3HCl + CuSO4→Cu DO2PA + 3Cl- + SO42- + 5H+

μ=1/2 [ 3(-1)2

+(-2)2

+5(+1)2

如配5.0 ml，配位子濃度2.0 mM，μ=0.10 M之滴定溶液

需補2 M TMACl (aq)：[(0.10 – 6 × 0.002) × 5.0] ÷ 2 = 0.22 (ml)

4. 以 TMAOH(aq)標定配位子 DO2PA 溶液：

在滴定槽中加入 1000 μl DO2PA(~10mM) (aq)；250 μl TMACl (aq)(2M)；

3750 μl 二次水，配成體積 5 ml，配位子濃度 2.0 mM，μ=0.10 M 之滴定溶液， 控制溫度在 25.0±0.1 ℃，攪拌子攪拌平衡。 滴定前，電極先以pH 7.00；pH 4.01；pH 9.95三個標準液做校正， pH(as)=7.0±0.10；slope=0.999～0.985。 TiNet設定為 Vstep = 0.001ml Vstop = 0.13ml(先估算超過配位子6.5倍的當量)

signal Drift = 1 mv/min equilibrium time = 200 s

滴定超過5個DO2PA當量的TMAOH(aq)，會在約3個當量TMAOH(aq) 體積，產生一個反曲點。

5. 以 TMAOH(aq)標定配位子 CuDO2PA 溶液：

因為合成的過程中，生成配位子鹽酸鹽，一個DO2PA不一定有整數個HCl。

為求精確，還要再以Cu2+

錯合標定，以交叉確定DO2PA (aq)的濃度。

配製體積5 ml，配位子濃度2.0 mM，μ=0.10 M之滴定溶液：

取1000μl DO2PA (aq)、已標定濃度的CuSO4(aq)，過量5%，即10.50 mmole、220.0 μl TMACl (aq)，補足二次水達5 ml，控制溫度在25.0±0.1 ℃，攪拌子攪拌平衡。 TiNet設定為

Vstep = 0.001ml

Vstop = 0.13ml(先估算超過配位子6.5倍的當量)

signal Drift = 1 mv/min equilibrium time = 200 s

會在大約第五個當量處出現反曲點。

moles of TMAOH / moles of ligand

0 1 2 3 4 5 6 7 pH 2 4 6 8 10 12 CuDO2PA DO2PA 圖 4-1 DO2PA 以及 CuDO2PA 之酸鹼滴定圖 將滴定 CuDO2PA 的第二個反曲點減去滴定 DO2PA 的第二個反曲點，也就 是五當量減去三當量，再乘以鹼液的濃度，即為較正確的 DO2PA 濃度。 （例）DO2PA (aq)濃度計算： DO2PA 在滴定了 0.0573 ml TMAOH，產生反曲點。CuDO2PA 則在滴定了 0.0983 ml TMAOH，產生反曲點。 根據錯合的原理，推測兩者反曲點之間相差 2 個當量的 H+ 。 標定之 TMAOH(aq)=0.5013 M ( 0.0983 - 0.0573 ) ×0.5013=2 × [ DO2PA (aq)] [ DO2PA (aq)] =10.2767 mM

將此濃度乘以五減去滴定 CuDO2PA 的反曲點處所需的鹼毫莫耳數，即為不 足的鹽酸毫莫耳數。因為再結晶時不一定會有剛好三當量的鹽酸一起結進去，透 過這裡計算出來的實際鹽酸當量約為 2.8 左右，重新推算 DO2PA 的組成，也與 元素分析的結果有一致性。 ＊ 配位子質子化常數之滴定原理65 化學反應中，當中心離子A開始與反應物B進行反應，一連串的平衡反應就 會接著進行，而形成物種ABi（i=1,2,3…）。 其平衡反應式如下： i AB iB A+ ↔

[ ]

[ ][ ]

i i B AB B A AB

K

i = 式（1.） 假如A為配位子（L），B為氫離子（H），則反應平衡為： HL H L+ ↔

_{[ ][ ]}

[ ]

H L HL

K

HHL = 式（2.） L H H L H_n−1 + ↔ _n

_[

[

_{][ ]}

]

H L H L H n n H L H

K

n 1 − = 式（3.） 因為

_K

H

(

i n

)

L Hi L 3 , 2 , 1

= 為每一步的質子化常數（stepwise protonation constant），而

K

HHnL'為總質子化常數（overall protonation constant），其關係式為：

K

K

K

K

K

HH L H L H H L H H HL H L Hn '= × 2 × 3 ×L n 式（4.） 若平均質子化數為h，配位子所能解離的氫離子濃度為已知，則平均質子化 數可定義為：

(

)

(

totalligandconcentration

)

species ligand to bound ion concentrat ion hydrogen dissociate total = h

[ ] [

] [

]

[

]

[ ] [ ] [

L HL H L

]

[

H L

]

L H n L H L H HL n n + + + + + + + + = L L 2 3 2 3 2

[

]

[

]

∑

∑

= = = _n i i n i i L H L H i 0 1

[ ]

[ ]

∑

∑

= = = _n i i H L H n i i H L H H K H iK i i 0 1 _{where 1} 0 =

K

HHL 式（5.）

溶液中總氫離子濃度

[ ]

H

t，包含未鍵結與鍵結（free and bound）的部份，因此在

溶液中的質量平衡式為：

[ ]

₌

∑

[

]

₊

[ ] [ ]

+ ₋ − OH H L H i H _{t i} 式（6.）

[

]

∑

i H_iL ：與配位子鍵結的氫離子濃度（the total bound hydrogen ion concentration）

[ ]

+

H ：從配位子解離出的自由氫離子濃度（the total free hydrogen ion concentration）

[ ]

−

OH ： 氫離子濃度的校正因子（the correction term for hydrogen ion concentration

formed by the dissociation of water）

在滴定的過程中，持續將強鹼加入溶液中，所以氫離子的總濃度會下降，此時

[ ]

H t 也可以寫成：

[ ]

[ ]

V b L n H t t − = 式（7.）

n：配位子質子化總數（number of protonation sites on the ligand）

[ ]

Lt：配位子總濃度（total ligand concentration）

[ ]

H t：溶液中氫離子總濃度（total hydrogen ion concentration in the solution）

V ：體積校正因子（a volume concentration factor for dilution）

b：滴定過程中所加鹼的量 根據式（6.）、式（7.）可得：

[

] [ ]

_{= −}

[ ] [ ]

+ ₊ − ₌

[ ]

− ₋

[ ] [ ]

+ ₊ −

∑

H OH V b L n OH H H L H i t t i 式（8.） 將式（8.）除上配位子總濃度後，得到平均質子數h：

[ ]

[ ] [ ]

[ ]

[ ]

_{[ ] [ ]}

[ ]

t t t t erimental L OH H V b L n L OH H H h − + − + − − + = + − = exp 式（9.）

若取half-integral a值（mole of base / mole of ligand）為

_K

H_HL n 值，代入式（5.）便可 以得到

[

]

[

]

∑

∑

= = = _n i i n i i l theoretica L H L H i h 0 1 _{，且與實驗值所得到的h} theoretical存在一個標準偏差值，利 用電腦反覆取點運算後可找出最小偏差，同時也可找出正確的

_K

H_{H L} n （質子化常 數）。 ＊ 配位子 DO2PA 之質子化常數 使用的計算軟體是 1988 年 A. E. Martell 發表的 PKAS 程式65 。將 DO2PA 與 TMAOH 的酸鹼滴定資料輸出，用 MS Excel 處理成 PKAS 所需要的格式去運算。 因為 DO2PA 經過與金屬的滴定後確定有五個質子可以解離，所以我們取的點必 須包含五個當量的資料，即為滴定的鹼液體積與 pH 值。再輸入鹼液與配位子溶 液的濃度，以及鹽酸量的修正，即可得到配位子的質子化常數 (LogKi)。 表 4-1 不同配位子之質子化常數 DOTA49 DO3A49 DO2A49 DO2PA ODO2A51 Cyclen50 LogK1 11.34 10.72 10.94 11.09±0.26 10.88 10.6 LogK2 9.90 9.51 9.55 9.29±0.13 5.96 9.6 LogK3 4.60 4.40 3.85 4.60±0.08 2.85 1.5 LogK4 4.00 3.39 2.55 3.31±0.08 1.86 0.7 LogK5 1.73±0.28 1.24 根據實驗室之前對於 DO2A 的研究49 ，推測前兩個質子化的位置為大環上的 二級氮，最後兩個是在乙酸基上。因此推測 DO2PA 前兩個質子化位置在大環上

二級氮上的位置，主要是因為二級氮的鹼度高於三級氮，除此之外，二級氮不似 三級氮上還有丙酸根的立體障礙效應。但是進一步的質子化順序還是需要利用1 H NMR 來鑑定，藉由觀察不同 pH 值下，各個氫原子的波峰的漂移來定出質子化的 順序。 由表 4-1 可得知不同配位子的質子化常數的比較，可以發現 LogK1的變化由 cyclen 的 10.6 提升至 10.72-11.34 可見羧酸基對於 LogK1的提升有影響，但是官能 基的數目及官能基碳鏈的長短對於 LogK2事實上沒有顯著的影響。此外，DO2PA

與 DO2A 最大的差異在 LogK3、LogK4，發現 DO2PA 之值＞DO2A 之值；在總鹼

第五章 配位子 DO2PA 與金屬陽離子穩定常數之研究

＊配位子與金屬陽離子之穩定常數計算原理 當一金屬離子M與一配位子L鍵結，其穩定常數的平衡式為： ML L M + ↔

[ ]

[ ][ ]

M L ML

K

ML= 式（A.） MHL H ML+ ↔

[

]

[ ][ ]

ML H MHL

K

HMHL= 式（B.）

K

ML：金屬離子錯合物的穩定常數（stability constant）

K

HMHL：金屬離子錯合物的質子化常數 H MHL LogK 可利用取a值為0.5，0.15…附近幾點加以運算，若求出其間的標準差小 於0.05便可作為正確的 H MHL LogK 。 H MHL

LogK 由上述的方法求得後，K_ML便可利用電荷平衡（charge balance）與質量

平衡（mass balance）求得：

[ ]

Lt：配位子總濃度（total ligand concentration）

n K ：配位子質子化常數（protonation constant）

[ ] [ ] [ ] [

L_t = L + HL + H₂L

]

+_L+

[

H_nL

] [

+ MHL

] [ ]

+ ML

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]

(

1+K₁ H +K₁K₂ H 2 +K₁K₂K₃ H 3 + +K₁K₂K₃ K_n H n

)

[ ]

L +

(

K_MHLH

[ ]

H +1

)

[ ]

ML = _{L L}

[ ]

L X

[ ]

ML A1 + 1 = 式（C.） 令，

(

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]

n

)

n H K K K K H K K K H K K H K A _L 1 2 3_L 3 3 2 1 2 2 1 1 1 = 1+ + + + +

[ ]

(

1

)

1 = K H + X _MHLH

[ ]

M t：金屬離子總濃度（total metal ion concentration）

[ ] [ ] [

M t = ML + MHL

] [ ] [ ]

+ M = MLX1 +

[ ]

M 式（D.）