纖維素分解酶複合體-Cellulosome

(1) Cellulosome

1983 年 Lamed 及 Bayer 等人於 Clostridiales 屬的纖維素分解細菌中發現其可 產生高分子量具有 cellulase 活性的蛋白質(16, 75)，並於培養上清液中發現，這些具 高分子量的 cellulase 及 hemicellulase 是由多種酵素組成之多次單元複合體，並稱此 複合體為纖維素分解酶複合體(cellulosome)(74)。Cellulosome 如同核糖體一樣，像 是一個巨分子機器，它能組織、聚集各種次單元體，如 cellulase 和半纖維分解酶，

並能以協同作用(synergism)方式有效地分解纖維基質，此亦是厭氣性纖維利用菌有 別於好氣性微生物所發展出的特有纖維基質分解機制。Cellulosome 直徑約為 18 nm，

其分子量約為 2 ×10⁶至 6 ×10⁶ Da，由 14 至 50 個分子量約 37 kDa 至 210 kDa 的蛋 白質所組成，在某些物種，如 Clostridium thermocellum 及 Acetivibrio cellulolyticus，

其 cellulosomes 可再組成分子量達 5×10⁷ 至 8 ×10⁷ Da 稱為 supercellulosomes (polycellulosomes)的複合體(17, 18, 75)，其在菌體表面像是一突出細胞表面之胞 器。

相較於好氣性微生物所產生的 cellulase 系統，雖然此系統可產生包括 exo-β -1,4-glucanase、endo-β -1,4-glucanase 以及 β –glucosidase 等三大類的 cellulase，並以 協同作用方式有效地分解纖維素，但因這些酵素都以自由游離(free form)的形式(7) 存在於環境中，需靠著各類酵素與基質的碰撞、結合才有機會進行完整的纖維素分 解作用。而在厭氣性細菌的 cellulosome 中，與分解纖維素及半纖維素相關的酵素 藉由其錨固區(docking domain, dockerin)與一稱為支架蛋白質 (scaffolding protein, scaffoldin)的非催化性蛋白質中結合區(cohesive domain, cohesin)結合而成為一 cellulosome，由於這些分解酶藉此結合機制而聚集一起，故能有效率地獲得並分解 各步驟產物。此外，這種複合體藉由支架蛋白質中與纖維基質有強結合力的纖維素 結合區 (cellulose binding domain, CBD) or carbohydrate-binding module, CBM)而與 纖維基質結合，故能在動態的環境中存留更久且更有效地分解纖維素(16)，目前已 知可產生 cellulosomes 之厭氣性微生物如表 1-4 所示。

表 1- 4 產生纖維素分解酵複合體之厭氣性微生物

Table1-4 Cellulosome-producing anaerobic microorganism(14).

Microorganism Source

Anaerobic bacteria

Acetivibrio cellulolyticus Sewage Bacteroides cellulosolvens Sewage Butyrivibrio fibrisolvens Rumen Clostridium acetobutylicum Soil Clostridium cellobioparum Rumen Clostridium cellulolyticu Compost

Clostridium cellulovorans Wood fermenter

Clostridium josui Compost

Clostridium papyrosolvens Paper mill Clostridium thermocellum Sewage soil

Ruminococcus albus Rumen

Ruminococcus flavefaciens Rumen

Anaerobic fungi*

Neocallimastix patriciarum Rumen

Orpinomyces joyonii Rumen

Orpinomyces PC-2 Rumen

Piromyces equi Rumen

Piromyces E2 Faeces

* 厭氣性真菌其纖維分解酶具有非催化活性之重覆序列，

但到目前為止，其支架蛋白質基因尚未被發表。

(2) 支架蛋白質-Scaffoldin

Scaffoldins 是 cellulosomes 中的骨架，其本身不具酵素活性。C. cellulovorans 的 scaffoldin 基因是第一個被定序的支架蛋白質基因，但當時只知此蛋白質對纖維 素具有高吸附能力，而對其蛋白質序列上一些重覆性的片段之性質卻不了解(118)。

一直到了 C. thermocellum scaffoldin (CipA)的序列及其與各種酵素間的關係被研究 後，研究者們才確定了 scaffoldins 在這個龐大的複合體中是扮演骨架的角色(14)。

之後在其它厭氣性細菌物種中也陸續發現了各類型的 scaffoldin 基因。就目前發表 的 scaffoldins 而言，可依其組成及特性分為兩大群。第一群 scaffoldins 其組成包含 了 5 至 9 個數目不等稱為 cohesin 的結合區(即第一型 cohesin)、一個碳水化合物結 合區 CBM 及數量不等稱為 X domain 的未知功能區。這些 cohesins 的胺基酸序列具 有高同源性(homology)，其可與各類 cellulase 及 hemicellulase 中稱為錨固區的 dockerins (即第一型 dockerin)結合。目前已知產生此類 scaffoldins 的物種包括嗜溫 厭氣性細菌 C. cellulolyticum、C. cellulovorans、C. josui 及 C. acetobutylicum。第二 群 scaffoldins 可再分為三類。第一類 scaffoldins 的組成如同第一群 scaffoldins 的組 成，但多了一個 dockerin (即第二型 dockerin)，一般亦稱此種可結合多個酵素且具 有 dockerins 的 scaffoldins 為 primary scaffoldins，但現已有部份文獻也將第一群之 scaffoldins 稱為 primary scaffoldins。第二類 scaffoldins 稱為 anchoring scaffoldins，

其組成中的 cohesins (即第二型 cohesin)有別於 primary scaffoldins 中的第一型 cohesins，其只能與 primary scaffoldins 上的第二型 dockerins 結合，此外，anchoring scaffoldins 的另一特徵為其具有稱為 SLH (S-layer homology)的區塊，其功能為使 anchoring scaffoldins 與菌體表面結合，而讓 cellulosomes 存在於菌體表面(77, 87)。

第三類 scaffoldins 稱為 adaptor scaffoldins，其組成份如同 anchoring scaffoldins，但 缺乏 SLH domains，亦即就能產生第二群 scaffoldins 的物種而言，各類纖維素及半 cellulase 組合至 primary scaffoldins 後，這些 primary scaffoldins 會再接至 adaptor scaffoldins ， 最 後 再 由 這 些 adaptor scaffoldins 與 連 接 於 菌 體 表 面 的 anchoring scaffoldins 結合而成為 polycellulosomes。能同時產生 primary 和 anchoring scaffoldins 的物種包括嗜熱厭氣性細菌 C. thermocellum、瘤胃厭氣性細菌 R. flavefaciens、B.

cellulosolvens 及 A. cellulolyticus，而目前已知物種中，只有 A. cellulolyticus 可同時 產生三種 scaffoldins(140)。相對於可產生 anchoring scaffolds 而藉由其 SLH domains

作為與菌體表面結合的媒介，嗜溫厭氣性細菌目前為止尚未發現 anchoring scaffolds 的存在，其所產生的 cellulosomes 與菌體間的結合媒介為何，目前仍為此類研究的 重點之一，但近年有關 C. cellulovorans 的 cellulosome 系統研究發現，其所產生的 cellulosomes 主要藉由 primary scaffoldins 上的 HLD (hydrophilic domain，一種 X domain)及主要酵素 EngE (endoglucanase E)上的 SLH domains 與菌體表面結合(72, 128)。

大部分的糖苷水解酶(glycosyl hydrolase)都含有 CBM，研究顯示，CBMs 的存 在能使這些水解酶增加對不可溶性基質的分解能力。CBMs 與糖苷水解酶一樣，依 其 胺 基 酸 序 列 相 似 度 可 分 為 64 個 族 群 (families)(23) ( http://www.cazy.org/fam/acc_CBM.html)，若依其構型摺疊的相似性，則其可分為 7 個 superfamilies;然而就其功能性而言，CBMs 可分為三大類型。Type A CBMs 以位 於同一平面上的芳香族胺基酸(Trp, Tyr, His)專一性地與結晶性纖維基質表面結合;

type B CBMs 則只與單一條多醣鏈(polysaccharide chain)結合;而 CBMs 中與其相連 的催化區具有相同碳水化合物結合專一性者皆稱為 type C CBMs，而此類 CBMs 只 能與可溶性的基質結合。就目前已知的各類型 scaffoldins 而言，其組成中的 CBM 則屬於 CBM family-3 或為 type A。Scaffoldins 藉由此種 CBMs 與結晶性纖維基質結 合以及其與菌體表面的連結而將菌體帶至基質並分解之(14)。

(3) 結合區-Cohesin

根據 C. thermocellum 的 cohesins 胺基酸序列同源性及其與 dockerins 的結合專 一性研究顯示，位於 primary scaffoldins 和 anchoring scaffoldins 上的 cohesins 是具 有差異性的(76, 113)，並將其分別分類為第一型(type I)和第二型(type II)。然而，當 瘤胃細菌 R. flavefaciens 的 cohesins 序列及結合特性被研究後，由於其與已知的 cohesin 系統差異大，故將其 primary scaffoldins 以及 anchoring scaffoldins 上的 cohesins 歸類為第三型(type III)。另一個特殊例子為 B. cellulosolvens，其 primary scaffoldins 上的 cohesins 與其它物種 anchoring scaffoldins 上的 cohesins 在胺基酸序 列上相似度較高，故其 cohesins 的分類上與其它物種相反(43)。C. thermocellum 的 scaffoldin CipA 含有九個 cohesins，由胺基端(N-terminal)開始的第 3 至第 8 個位置 的 cohesins (cohesin-3 至 cohesin-8)彼此間具有較大的序列相同度，約為 95％。第 2 和第 9 個位置的 cohesins (cohesin-2、 cohesion-9)其與第 3 至第 8 個位置的 cohesins 序列相同度較低，只具有 75％相同度，而第 1 個位置(cohesin-1)與第 3 至第 8 個位 置的差異度則更大，約只有 63％相同度。這樣的序列差異性普遍存在於同一 scaffoldin 上的 cohesins，如 C. cellulovorans 的 scaffoldin CbpA，其 cohesins 間的相 同度約介於 42-90％間。就不同菌種間的差異而言，其 cohesins 序列相同度約在 30-50

％間;而各物種中，第一型與第二型 cohesins 間的差異更大，只有 15-26％相同度。

有關 cohesins 的蛋白質立體結構研究中，目前已有第一型及第二型 cohesins 的立體 結構被發表。第一型的例子包括 C. thermocellum scaffoldin CipA 上的 cohesin-2 (PDB code 1ANU)(117)和 cohesin-7 (PDB code 1aoh)(129)以及 C. Cellulolyticum scaffoldin CipC 上的 cohesin-1 (PDB code 1G1K)(120)，其立體結構構型相似，為一似捲心蛋 糕(jelly-roll)構形。以 C. thermocellum scaffoldin CipA 上的 cohesin-2 為例，其包含 138 個胺基酸，而由 9 個 β-strands 形成的 β-sandwich 結構;此結構可分為兩部份，

其一為由 4 個 strands 形成的 antiparallel β-sheet (β-strand 8,3,6,5)，另一個為由 5 個 strands 形成的 mixed β-sheet (β-strand 9,1,2,7,4)，在結構的中心位置則是由以苯 丙胺酸(phenylalnine)為主要組成的疏水性中心。

第二型 cohesin 立體結構研究亦顯示其彼此間具有相似的 jelly-roll 構形，此結 果和第一型結構相似，但其間仍存有幾個明顯的差異處。以 B. cellulosolvens Bc-cohesin-II (PDB code 1TYJ)(97)為例，這些結構上的差異包括(Ⅰ) 第二型 cohesin

具有一個 α-helix 插入 β-strand 6 和 7 間; (Ⅱ) 第二型 cohesin 具有兩個稱為 β-flap 的二級結構，其分別插入 β-strand 4 和 8 中間部份，但這兩個 β-flaps 並不會改變 β-strand 原本在空間中延伸的方向。這兩種差異性也成為胺基酸序列差異外，第一 型與第二型 cohesins 最大的鑑別處。另外，在這些結構研究中亦發現 cohesins 在結 晶過程中會形成二元體(dimer)。研究顯示，這些二元體間存在著互補性界面 (complementary interface)關係，靠著其間的作用力，包括鹽橋作用(salt bridge)、氫 鍵(hydrogen bond)以及疏水性作用力(hydrophobic interaction)，使其二者結合，而這 些作用力主要是發生在 β-strand 8,3,6,5 界面中較保守的胺基酸上。此種二元體在 生理功能上的角色仍需進一步探討，目前研究者推測其可能是和 cellulosomes 組裝 調節有關。尚未有適當的酵素至結合位置時，scaffoldins 可藉由 cohesins 形成二元 體的機制關閉 scaffoldins 與其它酵素的非專一性結合(97, 117)。

(4) 錨固區-Dockerin

參與 cellulosome 的各種 cellulase 及 hemicellulase 都具有一段稱為 dockerin 的 錨固區，這些酵素藉由 dockerins 與 scaffoldins 上的 cohesins 結合而組合至 cellulosomes 中。Dockerin 由約 70 胺基酸組成， 通常出現在酵素的羧基端(carboxyl terminal)，目前研究亦顯示有些 scaffoldins 也具有 dockerins，而此種 dockerins 的出 現也使得不同類型的 scaffoldins 能再組合成 multicellulosome(14)。如同 cohesins 依 胺基酸序列同源性及結合專一性所作的分類，dockerins 依胺基酸序列同源性及相對 應的 cohesins 結合類型，其亦可分為三型。第一型 dockerins 通常位於各種參與 cellulosome 組合的 cellulase 及 hemicellulase 之羧基端;第二型 dockerins 則是位於 scaffoldins 上;第三型則屬於 R. flavefaciens 系統。Dockerins 的胺基酸序列分析及生 化特性研究顯示，一個 dockerin 序列中存在兩個高相似度約由 22 胺基酸組成的重 覆序列(duplicated sequence)，而在這兩個重覆序列中間的是一段約 9-16 個胺基酸組 成的連結區(linker)(101)。經由截切形式的 dockerins 結合實驗結果顯示，只有單一 個重覆序列時，重組 dockerins 會失去與 cohesins 結合的能力，若將這兩個序列的 順序調換或以同樣序列之重覆式出現，則其與 cohesins 間的親和力並未受到影，由 此可知 dockerins 中的兩個重覆序列在與 cohesins 結合作用中扮演著關鍵性的角色 (50)。有關 dockerins 序列方面的研究指出，dockerins 每個重覆序列中的前 12 胺基 酸，其在序列上與已知的 EF-hand motif 中鈣離子結合環(calcium-binding loop)構形 相似，但是其缺少了 E-helix 構形，立體結構與 EF-hand motif 相異(85, 101)。經與 cohesins 胞外(in vitro)的結合實驗證實，cohesin-dockerin 的結合作用需有鈣離子的 參與(34, 142)，鈣離子的作用為誘使 dockerins 在結合過程改變構形以利與 coehsins 的結合，並穩定此結合複合物的立體結構(6, 86)。

(5) 結合區與錨固區結合作用-Cohesin-dockerin interaction

以 C. thermocellum xylanase 10B (Xyn 10B)之 dockerin 與其 CipA cohesion-2 之 結合作用為例，Xyn 10B 的 dockerin 由 3 個 α-helix 組成，這 3 個 helix 以 loop-helix motif 及 helix-loop-helix motif 出現在立體結構中，而 helix-1 和 helix-3 為一般

以 C. thermocellum xylanase 10B (Xyn 10B)之 dockerin 與其 CipA cohesion-2 之 結合作用為例，Xyn 10B 的 dockerin 由 3 個 α-helix 組成，這 3 個 helix 以 loop-helix motif 及 helix-loop-helix motif 出現在立體結構中，而 helix-1 和 helix-3 為一般