第三章 結果
3.1 N. patriciarum J11 之纖維素分解酶複合體生成
此部分實驗以不同類型的糖類為N. patriciarum J11之培養碳源探討其外泌 纖維素分解酶系統之差異性，並以聚丙烯醯胺膠片及酵素活性染色分析方法進 一步證明N. patriciarum J11 可生成胞外cellulosome。
(1) 菌體生長與酵素誘導生成
本研究改良自Fedorak等人以針筒測定菌體產氣之方法(47)，以針筒及三向 閥組裝的簡單器具測定厭氣性真菌生長所產生之總氣體體積。培養菌體時以濃 度0.5% (w/v)的三種單糖、雙糖及四種多醣為碳源，於39±1oC下靜置培養N.
patriciarum J11，並以其生長時所產生的總氣體量為生長速率指標進行生長狀況 評估。
當以三種單糖為碳源培養時，N. patriciarum J11對於葡萄糖利用率較其它兩 者高，且於接種96小時後可達到生長停止期(stationary phase)，而以木糖及果糖 為碳源時，於接種144小時後才達到，圖3-1A。另外，結果也顯示N. patriciarum J11生長較偏好六碳糖做為碳源，此結果與Neocallimastix sp. L2相似(41)。然而，
以葡萄糖為碳源時，其誘導產生的胞外cellulases對於基質CMC的活性(CMCase) 卻低於其它兩者，圖3-1B。
以蔗糖、麥芽糖以及纖維雙糖為碳源時，N. patriciarum J11對纖維雙糖與蔗 糖的利用率較高，生長較快，於接種96小時後可至stationary phase，而對麥芽糖 的利用率相對較差，在接種144小時達到stationary phase，且培養的前48小時生 長速率明顯比前兩者差，此現象可能是N. patriciarum J11對於麥芽糖使用的適應 性較為不理想所致，如圖3-1C。纖維雙糖與蔗糖所誘導產生的CMCase隨著菌體 生長而增加且較麥芽糖所誘導者高(圖3-1D)。當以纖維雙糖為碳源時，在其生
長48小時所測的CMCase活性確明顯低於其它兩者。推測這結果可能是由於測定 活性時酵素樣本(培養上清液)內仍含有較高濃度的纖維雙糖，而纖維雙糖對 cellulase系統中的cellobiohydrolase及endoglucanase具有產物迴饋抑制作用所造 成(119, 139)。
N. patriciarum J11對四種多醣類的利用實驗結果顯示，Avicel、稻桿及木聚 醣對N. patriciarum J11的生長及CMCase產生都明顯高於CMC (圖3-1E、F)。由 於多醣類不能像單糖及雙糖可直接被菌體吸收利用，因此N. patriciarum J11對這 三種基質的利用上，在前48小時的生長速率較單糖及雙糖來源者差，其可能需 要一段適應期以合成其它相關分解酶進行後續分解反應。
(2) N. patriciarum J11 cellulosome 生成
從培養五天的N. patriciarum J11培養上清液中分離cellulosmes，所採行之純 推測N. patriciarum J11應具有類似厭氣性細菌系統之cellulosome。
圖 3- 1 不同碳源培養及 CMCase 活性比較
(A)以葡萄糖、木糖及果糖為碳源的生長比較及不同時期誘導產生之CMCase 活性(B)。(C)以蔗糖、麥芽糖及纖維雙糖為碳源的生長比較及不同時期誘導 產生之CMCase活性(D)。(E)以Avicel、稻桿、木聚醣及CMC為碳源的生長 比較及不同時期誘導產生之CMCase活性(F)。G:葡萄糖; F:果糖; Xo:木糖; B:
纖維雙糖; S:蔗糖; M:麥芽糖; A: Avicel; R:稻桿; X:木聚醣; C: CMC。
Figure 3-1 Growth and CMCase activity of N. patriciarum J11 with various carbon sources.
(A) Growth of N. patriciarum J11 with monosaccharide and CMCase activity (B). (C) Growth of N. patriciarum J11 ith disaccharide and CMCase activity (D). (E) Growth of N. patriciarum J11 with polysaccharide and CMCase activity (F). G: glucose, F: fructose, Xo: xylose, B: cellobiose, S: sucrose, M:
maltose, A: Avicel, R: rice straw, X: xylan, C: CMC.
圖 3- 2 培養上清液純化之纖維素分解酶複合體分析
(A)原態聚丙烯醯胺膠體電泳圖(1)與酵素活性染色(2)(基質為 β-glucan); (B) 變性聚丙烯醯胺膠體電泳圖(1)與酵素活性染色(2)(基質為 β-glucan)、(3)基質 為 xylan)。
Figure 3-2 Analysis of cellulosome purified from culture supernatant. (A) Native-PAGE (lane 1) and zymogram using β-glucan as substrate (lane 2); (B) SDS-PAGE (lane 1), zymogram using β-glucan (lane 2) and xylan (lane 3) as substrates.
(3) N. patricirum J11 scaffoldin 偵測
此 方 法 利 用 N. patriciarum J11 之 cellulase 或 hemicellulase 所 具 有 的 dockerins與glutathione S-transferase (GST)融合之重組蛋白質dockerin-GST能 與scaffoldins中的cohesin結合的特性，之後再以GST的一次抗體與其二次抗體 進行西方氏雜合分析。西方雜合分析所產生的訊號代表cellulosome製備液中含 有可與dockerin結合的蛋白質即推測中的厭氣性真菌支架蛋白質scaffoldin。
(A) Dockerin-GST與scaffoldin之結合:
本研究方法以西方雜合分析為基礎，根據基因資料庫 (NCBI, National Center for Biotechnology Information)中，厭氣性真菌cellulase及hemicellulase 之基因序列 (N. frontalis celA, AAC63094; N. patriciarum bna3, AAB69092; N.
patriciarum engB, CAA83238)設計三組專一性引子選殖出包含連接催化區與 錨固區的連結區(linker)及兩錨固區在內的片段(雙錨固區，double dockerin)，
此種dockerins為厭氣性真菌最常被發現之形式，其片段大小分別為DD-A 363 bp (celA); DD-b 336 bp (bna3); DD-e 408 bp (engB)。此種double dockerin分子量 約為12 kDa，與GST融合後之重組融合蛋白質分子量約為41 kDa，如圖3-3所 所示。這些結果顯示在N. patriciarum J11系統中，其dockerin與scaffoldin結合 時不需要鈣離子參與。以蛋白質分子製作蛋白質泳動及分子量標準曲線可得 知，其結合訊號之蛋白質分子量約為79 kDa，如圖3-5所示。西方雜合分析方 法除了證實重組double dockerin與cellulosome的結合現象外，其訊號亦代表著 N. patriciarum J11 cellulosome組成份中scaffoldin所處的位置。
圖 3- 3 重組融合蛋白質 DD-b-GST 純化圖
M:蛋白質分子量標準品(kDa); S:粗酵液; F:樣品流出液; W:緩衝液洗出液; E:
洗提液。
Figure 3-3. SDS-PAGE of recombinant fusion protein DD-b-GST. M: protein marker (kDa); S: sample; F: sample flow; W: washing fraction; E: elution fraction.
圖 3- 4 重組融合蛋白質 DD-b-GST 與纖維素分解酶複合體結合作用
西方雜合分析，結合反應溶液未含 10 mM CaCl2且樣本含 10 mM EDTA (A);結 合反應溶液含 10 mM CaCl2 (B)。Cs:濃縮之培養上清液; F:經膠體過濾所得具 cellulase 活性部分。箭頭所指為厭氣性真菌支架蛋白質。
Figure 3-4 Analysis of the interaction between DD-b-GST and cellulosome.The buffer used in Western blotting does not contain 10 mM CaCl2 and the sample contains 10 mM EDTA (A). The buffer contains 10 mM CaCl2 (B). M:
protein marker; Cs: concentrated culture supernatant; F: fraction with
cellulase activity from gel filtration. Arrow indicates the anaerobic scaffoldin.
圖 3- 5 重組融合蛋白質 DD-b-GST、GST 與纖維素分解酶複合體支架蛋白質之結合 (1)變性聚丙烯醯胺膠體電泳圖。(2)西方雜合分析，GST 與纖維素分解酶複 合體結合反應。(3)西方雜合分析，DD-b-GST 與纖維素分解酶複合體結合反 應。M: 質分子量標準品(kDa)。箭頭所指為推測之真菌支架蛋白質。
Figure 3-5 Docking of the DD-b-GST and GST with the fungal scaffoldin of the
cellulosome from N.patriciarum J11. Lane 1, SDS-PAGE. Western blots were probed with the DD-b-GST fusion protein(lane 3) or with GST alone (lane 2).
M, protein marker (kDa). Arrow indicates the fungal scaffoldin.
(B) 重組融合蛋白質dockerin-GST之結合作用:
為了進一步證明來自厭氣性真菌的dockerin可與cellulosome製備液中的 cohesin結合並且了解厭氣性真菌dockerin與cohesin在結合過程，影響其結合及 親和力之胺基酸為何，本研究採取蛋白質結合滴定法(protein binding titration) 分析其結合性質。經由比較野生型(wild type, D-b)與各突變型(mutant)結合圖 譜的差異，除了可證明dockerin確實扮演與cellulosome製備液中的支架蛋白質 結合的角色外，也可驗證其與結合作用相關之胺基酸是否同為含芳香族基團 的胺基酸。其基本原理為在同一反應條件下，野生型dockerin中某一胺基酸若 與結合作用有關，則該突變型與野生型dockerin的結合能力經酵素連結免疫吸 附分析(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)後，其吸光值的差異即可 反應出結合作用增強、減弱或消失的現象。本研究所選殖、建構及表現之重 組融合單一錨固蛋白質分子量約37 kDa，如圖3-6所示。
經由N. patriciarum Bna3與EngB、N. frontalis CelA、P. equi Cel5A與Cel45A 以及Orpinomyces sp. PC-2 XynA與ManA之dockerins胺基酸序列比對，本實驗 選 出 四 個 高 保 守 性 之 胺 基 酸 ， 酪 胺 酸 (tyrosine) Tyr-5 、 Tyr-16 及 色 胺 酸 (tryptophan, Trp) Trp-23、Trp-30，將其以具有芳香環之苯丙胺酸(phenylalanine, Phe)取代，其結合滴定結果如圖3-7所示。當Tyr-16與Trp-23以Phe取代時，其 與與cellulosome親和能力增加，而Trp-30以Phe取代時則呈現降低現象。此四 種突變單一錨固蛋白質與cellulosome結合之親和能力如表3-1所列。此結果指 出Trp-30可能是N. patriciarum J11錨固蛋白質與cellulosome結合之關鍵位置。
其它兩個位置Tyr-16與Trp-23改變成Phe時，能提高其結合能力。此結果可能 代 表 Phe 在 第 16 號 及 第 23 號 位 置 時 其 芳 香 環 能 提 供 更 有 利 之 疏 水 中 心 (hydrophobic core)參與蛋白質的結合。關於此點可再以其它胺基酸取代的實驗 得到更進一步證實。Raghothama等人曾對P. equi endoglucanase Cel45A之 dockerin進行多位點之突變並研究其結合能力特性，結果也顯示了較保守的胺 基酸Asp-23、Trp-23與Trp-30對於結合能力的影響較為明顯(111)。
當以非極性之丙胺酸(alanine, Ala)、具最小立體空間的甘胺酸(glycin, Gly)、
以及極性的麩醯胺酸(glutamine, Gln)與絲胺酸(serine, Ser)取代Trp-30時，其野 生型與突變型的結合圖譜亦具明顯差異，如圖3-8及表3-1所示。Trp-30位點的
改變明顯地降低了N. patriciarum J11錨固蛋白質之結合能力。此結果顯示，
Trp-30 為 參 與 dockerin 與 cellulosome 結 合 作 用 的 一 個 關 鍵 胺 基 酸 ， 且 其 與 cellulosome中相對應之結合胺基酸應以疏水性作用力為其間的鍵結。
圖 3- 6 重組融合蛋白質 D-b-GST 純化圖
M:蛋白質分子量標準品(kDa); S:粗酵液; F:樣品流出液; W:緩衝液洗出液; E:
洗提液。
Figure 3-6. SDS-PAGE of recombinant fusion protein D-b-GST. M: protein marker (kDa); S: sample; F: sample flow; W: washing fraction; E: elution fraction.
(A)
(B)
圖 3- 7 單一錨固區蛋白質 D-b 與其突變型之結合滴定圖 菱形:野生型; 方形:突變型。
Figure 3-7 Binding titrations of single-dockerin and the mutants from D-b.
Diamond and square represent the wild type and the mutants, respectively.
(C)
(D)
(B) (A)
圖 3- 8 單一錨固區蛋白質 D-b 與其突變型之結合滴定圖 菱形:野生型; 方形:突變型。
Figure 3-8 Binding titrations of single-dockerin and the mutants from D-b.
Diamond and square represent the wild type and the mutants, respectively.
(C)
(D)
表3- 1單一錨固區蛋白質D-b與其突變型之親和能力
Table 3-1 Binding affinity of single-dockerin and the mutants from D-b.
D-b Y5F Y16F W23F W30F W30A W30G W30S W30Q Ka*
(10-8M) 1.62 1.68 0.73 0.85 24.76 14.66 33.18 28.77 28.2
*單一錨固區蛋白質分子量為37 kDa，其每1 mg/ml之莫耳濃度為27.03 μM。Ka以 A280吸收值與單一錨固區蛋白質濃度之雙倒數函數推算。