厭氣性真菌Neocallimastix patriciarum J11纖維素分解酶複合體之研究

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I

國立台灣大學生命科學院生化科技學系博士論文

Department of Biochemical Science and Technology College of Life Science

National Taiwan University Doctoral Dissertation

厭氣性真菌 Neocallimastix patriciarum J11 纖維素分解酶複合體之研究

Studies of anaerobic fungus Neocallimastix patriciarum J11 cellulosome system

王惠昌

Hui-Chang Wang

指導教授：許瑞祥博士

Advisor: Ruey-Shyang Hseu, Ph. D.

中華民國 103 年 7 月

July, 2014

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I

摘要

本研究自以結晶性纖維 Avicel 為碳源的厭氣性真菌 Neocallimastix patriciarum J11 培養上清液中純化分子量大於 669 kDa 且具纖維素分解酶活性之大分子蛋白聚合物，經變性聚丙烯醯胺膠體電泳及酵素活性染色分析，結果呈現結果呈現 12 條蛋白 質，其中 8 條具纖維素分解酶活性、4 條具木聚醣分解酶活性。由此結果顯示，N.

patriciarum J11 當以結晶性纖維培養時可以誘導類似厭氣性細菌之纖維素分解酶複 合體生成。西方雜合分析結果顯示，厭氣性真菌特有之錨固區蛋白質能結合至 N.

patriciarum J11 纖維素分解酶複合體中分子量約 79 kDa 之蛋白質。因此，該複合體 組成份中應包含類似厭氣性細菌纖維素分解酶複合體之支架蛋白質而將各分解酶組合成一複合體。此外，錨固區蛋白質與相對應結合之支架蛋白質的結合作用不需鈣 離子參與。點突變錨固區蛋白質結合滴定實驗顯示，N. patriciarum J11 之纖維素分解 酶複合體系統中，保守性高的 Trp-30 應以疏水性結合力與支架蛋白質上相對應的結合區蛋白質結合。碳源誘導纖維素分解酶複合體生成的實驗結果顯示，不同碳源的 誘導可影響 N. patriciarum J11 纖維素分解酶複合體生成量及其組成份比例。本研究 藉由串連式質譜分析鑑定了 N. patriciarum J11 纖維素分解酶複合體的 6 個組成份，

其包含了內切型(endo- type)、非還原端外切型(exo-type, non-reducing end)及還原端外切型(exo-type, reducing end)三種纖維素分解酶。此三類型分解酶的組合使纖維素分解酶複合體能以有效的協同作用方式分解結晶性纖維。基於上述結果，本研究首度發表了厭氣性真菌纖維素分解酶複合體的相關組成份。

關鍵字: 厭氣性真菌、纖維素分解酶、纖維素分解酶複合體、錨固蛋白質、生質酒精

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II

Abstract

In this study, we purified the cellulosome of Neocallimastix patriciarum J11 from a broth through cellulose affinity purification. The cellulosome with molecular weight more than 669 kDa, and the cellulase and xylanase activities were detected by polyacryamide gel electrophoresis and zymogram. The cellulosome is composed of at least 12 comprised proteins, based on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Eight and four of these constituents have demonstrated cellulase and xylanase activites on zymogram analysis, respectively. Western hybridization analysis revealed that the fungal dockerin could bind to the protein with molecular weight of 79 kDa, and did not need calcium ion for mediation. This postulated fungal scaffoldin responded to the gathering of the cellulolytic components. Binding titration revealed that the high conserved Trp30 residue in fungal dockerin could participate in binding with scaffoldin by the hydrophobic interaction. The levels and subunit ratio of the cellulosome from N. patriciarum J11 might have been affected by their utilized carbon sources, whereas the components of the cellulosome were consistent. In this study, we identified six components of N. patriciarum J11cellulosome using liquid chromatography/mass spectrometry. The trypsin-digested peptides of six proteins were matched to the sequences of cellulases originating from rumen fungi, based on identification through LC/MS/MS, revealing that at least three types of cellulase, including one endoglucanase and two exogluanases, could be found in the N. patriciarum J11cellulosome. The cellulolytic subunits could hydrolyze synergistically on both the internal bonds and the reducing and nonreducing ends of cellulose. Based on our research, our findings are the first to depict the composition of the cellulosome produced by N. patriciarum J11, and this complex is composed of scaffoldin and three types of cellulase.

Keywords: anaerobic fungi, cellulase, cellulosome, dockerin, bioethanol

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圖目錄

圖 3-1 不同碳源培養及 CMCASE活性比較 ... 58

圖 3-2 培養上清液純化之纖維素分解酶複合體分析 ... 59

圖 3-3 重組融合蛋白質 DD-B-GST 純化圖 ... 61

圖 3-4 重組融合蛋白質 DD-B-GST 與纖維素分解酶複合體結合作用 ... 62

圖 3-5 重組融合蛋白質 DD-B-GST、GST 與纖維素分解酶複合體支架蛋白質之結合 ... 63

圖 3- 6 重組融合蛋白質 D-b-GST 純化圖...66

圖 3- 7 單一錨固區蛋白質 D-b 與其突變型之結合滴定圖...68

圖 3- 8 單一錨固區蛋白質 D-b 與其突變型之結合滴定圖...70

圖 3- 9 菌落分群聚合酶連鎖反應圖...74

圖3- 10 不同碳源誘導生成之cellulosome膠體過濾純化...76

圖 3- 11 不同碳源誘導生成之纖維素分解酶複合體組成分圖譜………79

圖 3- 12 纖維素分解酶複合體組成分鑑定圖譜...82

圖 3-13 J11 Cel5A 與 N. patriciarum CelD 胺基酸序列比對………87

圖 3-14 J11 Cel48A 與 Piromyces sp. E2 Cel48A 胺基酸序列比對……….88

圖 3-15 J11 Cel6C 與 Orpinomyces sp. PC-2 CelH 胺基酸序列比對………89

圖 3- 16 N. patriciarum J11 纖維素分解酶複合體...99

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表目錄

表 1-1 好氣性真菌纖維素分解酶種類與對纖維素之作用模式 ... 7

表 1-2 纖維素分解酶的工業應用 ... 9

表 1-3 木聚醣分解酶的工業應用 ... 10

表 1-4 產生纖維素分解酵複合體之厭氣性微生物 ... 14

表 1-5 厭氣性真菌的分類地位表 ... 26

表 1-6 已知的厭氣性真菌菌株 ... 27

表 2-1 基礎培養基之組成份表 ... 37

表 2-2 雙錨固區域及單一錨固區域 DNA 片段擴增之引子 ... 43

表 2-3 聚合酶連鎖反應試劑成份表 ... 44

表 2-4 聚合酶連鎖的反應條件 ... 44

表 2-5 定點突變使用之引子 ... 51

表 2-6 聚合酶連鎖的反應條件 ... 51

表 2-7KUNKEL定位突變法使用之引子 ... 52

表 3-1 單一錨固區蛋白質 D-B與其突變型之親和能力 ... 71

表 3- 2 不同碳源誘導之纖維素分解酶複合體酵素活性...77

表 3- 3 纖維素分解酶複合體組成分之蛋白質鑑定...83

表 3- 4 纖維素分解酶複合體組成分之蛋白質胺基端定序...85

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第一章前言

1.1 替代性能源與生質酒精現況

隨著人類文明發展，對於有限的化石燃料(fossil fuel)資源，如石油、煤、天然氣的需求亦與日俱增。然而，長期以來這些資源的開採與使用卻也帶給人類後續的問題，例如，溫室氣體(greenhouse gas)的增加、下游加工過程與各類產物對環境造的衝擊、不平衡的供需關係以及這些不可再生性資源的耗盡。近年來，由於各項因素的影響，使得石油價格持續高漲，近來已達每桶原油約七十美元，而這樣的現象已對高度依賴原油進口的國家形成龐大的壓力。從工業革命開始至今，人類對化石燃料資源的高度開採與使用已使人類必需面對將來這些有限資源的耗盡及其所產生的各項環境污染等問題。此外，2006 年 2 月 16 日京都議定書(Kyoto protocol)正式生效後，為達到二氧化碳減量，各國的能源政策中，替代性及再生性能源即成為焦點，因此，替代性燃料及再生能源的開發應用亦為當前各國重要議題之一。

各種替代性與再生性能源中，核能發電、風力發電、水力發電和地熱發電的技術發展已屬成熟，但仍面臨技術、安全等諸多問題，其後續開發潛力有限;太陽能發電及燃料電池 (fuel cell)其技術仍在不斷更新中，但因應用不易，在實際應用上仍是佔所有能源中極少部分。另一項替代性能源，生物燃料(biofuel)，其包含生質柴油(biodiesel)及生質酒精(bioethanol)，這種再生性能源具有穩定供應、環保、永續等優點，此外，由於這類替代性能源可直接添加或以適當比例添加於現行使用石化柴油、汽油的車輛中，而補充上述各項替代性能源不足處且在應用上較能立即解決現行需求，因此，近年來在此領域已有愈來愈多的研究發展及應用。

生物燃料是指利用生物產生的有機物質，即生質量(biomass)，經過轉換後所獲得之可用燃料，而目前最常使用的生物燃料為生質酒精(56)。相較於汽油的使用，

以酒精做為運輸用燃料能具有下列幾項優點: (Ⅰ)若以純酒精為燃料，其產物為二氧化碳及水，較汽油燃燒產物更為環保; (Ⅱ)若與汽油混合使用亦可幫助汽油燃燒增進效能; (Ⅲ)酒精具有較高的辛烷值; (Ⅳ)減少臭氧前趨物的產生。此外，由生質酒精的發酵生產及其燃燒過程中所產生的二氧化碳將會再被植物所利用，因此，生質酒精的使用可藉由此種碳循環的方式，減少淨二氧化碳排放至大氣中，減緩大氣中二

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氧化碳等溫室氣體的累積。

就全球生產和需而言，目前全世界最大的生質酒精生產及需求國家為巴西，

其次為美國。巴西每年可以甘蔗為原料生產約 38 億加侖的酒精，其國內約有 90％

的新車使用純酒精為燃料，其餘的則以 25％純酒精與 75％汽油的混合比例做為燃料(108)。1987 年時，美國可以 8.6 公噸的玉米為原料生產 8.5 億加侖的無水酒精做為 10％酒精汽油混合比的燃料。2004 年，美國從玉米及其它高澱粉含量作物以酵母菌發酵生產方式生產 35 億加侖酒精，此量可滿足美國 1％車輛的燃料需求。2005 年時，其酒精生產量已達 40 億加侖(24)。美國能源政策法案也要求國內石油工業到 2012 年時需達到添加 75 億加侖的再生性生物燃料於汽油中(56)。現今美國也以玉米所生產的酒精取代四乙基鉛(tetraethyl lead)當做汽油辛烷值增強劑;此外，在美國許多州中，也逐漸以酒精取代 methyl tert-butyl ether (MTBE)做為氧化合物，以減少汽車廢氣排放(24)。除了巴西、美國外，其它原油產量小或非產油國家近年來也都積極投入此領域的研究及生物燃料的推廣。除了巴西主要以甘蔗為原料生產酒精外，

其它如美國多以玉米及穀類作為酒精生產的主要原料來源。

現代的生質酒精生產仍有些不利因素需進一步考量，各國為了達到減少石油進口以平衡貿易逆差並且減緩日趨嚴重的全球暖化等目的，其必需增加目前的酒精產量，但其所面對的問題不僅有技術及生產成本等方面，在原料上也是一個重要關鍵，以美國為例，其每年所生產的玉米中，有 14％是做為酒精生產的原料。對目前所使用的酒精製造原料種類如玉米、甘蔗而言，其並不是取之不盡，而且為了滿足上述供給需求，勢必須再增加這些原料的供給，如此，將來延伸的問題可能是與農業生產及糧食供應發生衡突。為了解決上述問題，近年來研究人員已把研究焦點轉移到木質纖維(lignocellulose)上，木質纖維因取得成本低以及其為地球上存量最大的再生性天然資源，若以農業廢棄物，如麥桿、稻桿和玉米莖幹，以及雜草、木屑等纖維基質為原料生產酒精，則可降低原料成本而使生質酒精更具應用性及競爭力。除了各種農、木業的纖維廢棄物外，都巿及工業活動中所產生的纖維廢棄物亦是另一項纖維基質原料來源。隨著石油價格的攀升、以玉米等作物為生質酒精生產原料所帶來的糧食衝突問題以及生質酒精生產技術的進步，就經濟及環境觀點，若以上述各種類的纖維基質為原料，生產生質酒精將是一項極具潛力的替代性能來源。

除此之外，近年有關將纖維廢棄物利用生物性轉換生產有機化合物如醇類、烯類等

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以作為工業應用原料的研究也愈來愈受重視，這方面的成果將可幫助人類降低對石油的依賴並且以此循環利用這些碳源而達到永續發展(8, 105)。

1.2 纖維素與半纖維素

植物細胞壁的組成包括不可溶性的纖維素(cellulose)、半纖維素 (hemicellulose) 及木質素 (lignin) 等結構性多醣，以及可溶性的 β- 葡聚醣 (β-glucan) 及果膠 (pectin)(39)。在組成上，纖維素為植物細胞壁的主要組成物質，其外圍藉由木質素及半纖維素的連結及包覆而緊密地堆疊成植物細胞壁的主要結構。每年陸生植物經由光合作用所產生的纖維素約為 10¹¹噸，為自然界中存在最大量的多醣類與碳源，

亦為自然界中最豐富的再生性資源(135)，而半纖維素成分中，最大量者為木聚醣，

其佔地球上可再生有機碳的三分之一，是自然界再生資源中含量第二豐富者。

纖維素(cellulose)是由葡萄糖以 β-1,4 糖苷鍵(glycosidic bond)鍵結成纖維雙糖 (cellobiose)並以此為組成單位形成 250~10,000 個葡萄糖分子的葡聚醣鏈(glucan chain)聚合物。纖維素藉由葡聚醣鏈以凡得瓦力(Van der Waals forces)及分子間、分子內氫鍵形成結晶性排列，並組成細長的結構單位，超微纖維體(micelle)。10~20 個超微纖維體會再堆壘成微纖維絲(microfibril)，微纖維絲整齊排列組成細胞壁的各薄層結構進而成為一緊密堆疊的結晶型(crystalline)纖維結構。這些結晶性的緊密結構使得纖維素在自然界中穩定存在，但也造成纖維素不易溶於水以及被大多數生物所利用的特性(124)。

半纖維素(hemicelluloses)，為五糖或六糖所組成之多醣類的通稱，其包含木聚醣（xylan)、木葡聚醣（xyloglucan）、甘露聚醣(mannan)、聚葡甘露醣（glucomannan）、

半乳葡甘露聚醣（galactoglucomannan）和阿拉伯膠聚醣（arabinogalactan）等，其中木聚醣為最主要成分。木聚醣是由木糖（xylose）為組成單位並以 β-1,4 方式鍵結構成木聚醣主要骨架。木聚醣支鏈上具有各種修飾基，目前發現的修飾基有 glucuronopyranosyl、α-L-arabino- furanosyl 4-O-methyl-D-glucuronopyranosyl、acetyl、

feruloyl 或 p-coumaroyl。隨著植物種類的差異，其即有不同種類的木聚醣組成。硬木

（hardwood）細胞壁中木聚醣含量佔 15-30 %，軟木（softwood）佔 7-10 %，一般常

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綠植物含量小於 30 %。硬木木聚醣主要為 acetyl-4-O-methyl-D-glucuronoxylan，軟木 則為 arabino-4-O-methyl-D- glucuronoxylan ，草類和一些常綠性植物木聚醣為 arabinoxylan(19, 36)。

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1.3 纖維素分解酶與木聚醣分解酶

纖維素分解酶(cellulase)為一群可以協同作用(synergism)方式分解纖維素的酵 素總稱(70)。以好氣性真菌(aerobic fungi) Trichoderma 屬的纖維素分解酶系統為例，

將不可溶性的纖維素分解成可溶性的葡萄糖(15)，至少需要三種類型的分解酶以協同作用參與 (37) ，此三類型包括 (Ⅰ) endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) 或稱為 endoglucanase (EG); (Ⅱ) exo-β-1,4-glucanase，其又可分為兩類，cellobiohydrolase (CBH) (EC 3.2.1.91)或稱為 exocellulase 以及 glucohydrolase (EC 3.2.1.74)或稱為 exoglucanase; (Ⅲ) β-glucosidase (BGL) (EC 3.2.1.21)與 cellobiase(22)。其作用機制如表 1-1 所示。第一步為 endo-β-1,4-glucanase 隨機地從纖維素的不定形區域 (amorphous regions) 切斷糖苷鍵，露出非還原端 (non-reducing end) 或還原端 (reducing edn)，接著由 exo-β-1,4-glucanase 從非還原端或還原端切除含有兩個或多個葡萄糖分子的聚合物，如纖維雙糖(cellobiose)、cellodextrin，最後由 β-glucosidase 將上述兩種酵素作用之產物分解成單一葡萄糖分子。然而，天然的纖維素除了本身具有高度結晶構造外，其外圍包裹著如木聚醣等半纖維素成份，由此可知，纖維素的分解機制是以更複雜的模式進行(71)。對大多數纖維分解菌而言，其可分泌一套由一種或多種的 CBH、EG 和 BGL 所組成的纖維素分解酶系統，但有些物種其 BGL 是以膜上或胞內的方式存在。好氣性微生物的纖維分解酶系統中，被分泌出的分解酵素游離至環境中，並藉由與基質的結合而進行分解，由於此結合作用是依賴酵素與基質間的碰撞機率，故分解效率低。再者，三大類型酵素亦需共同參與分解作用 始能達成協同作用效果，因此，自然界中，此種機制的分解效率應是較試管(in vitro) 實驗差。

半纖維素分解酶(hemicellulase)為數種可以協同作用方式分解 hemicellulose 的分解酵素統稱。由於 xylan 組成複雜，故其必須有一套完整的木聚醣分解酶(xylanase) 系統才能將 xylan 完全分解。作用於 xylan 短鏈的木寡糖（xylo-oligosaccharide），

再由β-D-xylosidase（EC 3.2.1.37）將木寡糖和雙木糖（xylobiose）分解成單糖。支鏈部分則分別由α-L-arabinofuranosidase（EC 3.2.1.55）、α-D-glucuronosidase （EC 3.2.1.139）、acetylxylan esterase（EC 3.1.1.72）、ferulic acid esterase（EC 3.1.1.73）

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和 p- coumaric acid esterase（EC 3.1.1.-）將各種取代基從 xylan 上切除(2)。

目前研究已顯示，cellulase 及 hemicellulase 為結構模組化的酵素(modular enzyme)，其由具酵素催化功能的催化區(catalytic domain)及能與各類碳水化合物結合的碳水化合物結合區(carbohydrate binding module, CBM)組成，現在亦有很多文獻沿用其先前的名稱纖維素結合區(cellulose binding domain, CBD)。這兩種功能區中間通常以一富含絲胺酸(serine, Ser)、蘇胺酸(threonine, Thr)及脯胺酸(proline, Pro)的胜肽鏈連接(55)。以結構模組化的 cellobiohydrolase (CBH)為例，其分解纖維素的過程可包含四個步驟: (Ⅰ)吸附(adsorption); (Ⅱ)鏈端定位(location of chain end); (Ⅲ)酵素-基質複合物的形成; (Ⅳ)糖苷鍵結的水解(11)。

依據酵素的分類，cellulase 及 hemicellulase 屬於水解酶(hydrolase)，而根據催化區胺基酸序列的相似度，這些相關分解酵素可被分類在 133 個糖苷水解酶族群 (glycosyl hydrolase families)中(62, 63) (http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html)。同樣

的分析方式， CBD 也可分類成 69 個族群

(http://www.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.htm)。

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表 1- 1 好氣性真菌纖維素分解酶種類與對纖維素之作用模式

Table 1-1 Components of aerobic fungal cellulases and their mode of action on the cellulose chain (22).

Enzyme type EC number Synonym Mode of action

Endo-β-1,4-glucanase EC 3.2.1.4 Endoglucanase (EG)

Endocellulase

--G--G--G--G--

Cleaves linkages at random

Exo-β-1,4-glucanase EC 3.2.1.91 Cellobiohydrolase (CBH)

Exocellulase

G--G--G--G--G--

Release cellobiose neither from reducing or

non-reducing end

Exo-β-1,4-glucanase EC 3.2.1.74 Glucohydrolase

Exoglucanase

G--G--G--G--G--

Release glucose from non-reducing end

β-glucosidase (BGL) EC 3.2.1.21 Cellobiase G--G ,

G--G--G--G

Release glucose from cellobiose and short chain cello-oligosaccharides

↑ ↑

↑

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1.4 纖維素分解酶與木聚醣分解酶的應用

Cellulase 為目前廣泛應用的酵素之一，其在工業上的應用如表 1-2 所列(3)。

除了在造紙、紡織工業有較多運用外(38, 68)，另一受矚目的應用為當作飼料的添加劑，添加在飼料中的 Cellulase 可提升雞隻生長速率及換肉率、降低糞便排放、提高

雞蛋中Ω-3 脂肪酸的比例等，以達到降低飼養成本、減低雞糞污染與提升產品價值

的目的。Cellulase 除了可以單獨使用之外，亦可與其它水解酶合併使用，例如環保用或水產養殖用的微生物製劑中，均含有 cellulase 成份(4)。因此，cellulase 已成為農業及工業上重要的酵素之一。全球工業酵素市場，從 1995 年的十億美金，到 2001 年成長至二十億美金。工業用酵素市場的主要部份為清潔劑、紡織和燃料用酒精等技術工業，飼料與食品業約佔 35%。工業用酵素市場中 75%為水解酵素，醣水解酵素位居第二，木聚醣分解酶是醣水解酵素中半纖維分解酶的主要酵素，應用範圍非常廣，包含動物飼料添加、食品、紡織與造紙等工業，如表 1-3 所列。目前，日本、

芬蘭、德國、愛爾蘭、丹麥、加拿大和美國等國皆有多家公司進行木聚醣酶的工業化大量生產(2)。此外，每年經光合作用所產生的纖維素約為 10¹¹噸(135)，如何將其水解成葡萄糖，作為低成本葡萄糖來源或轉化成永續性的生物燃料，以取代有限的石油資以及減緩溫室氣體的產生，是目前許多研究單位極欲研究開發的項目，亦是 cellulase 另一項具有潛力的應用。現階段第二代生質酒精生產仍以游離形式之好氣性微生物纖維素分解酶系統為主要分解酶來源，另外，亦藉由不同類型及來源之分解酶以不同比例混合使用。然而，目前對於結晶性木質纖維的分解效率仍是不理想。因此，若要提高其分解效率、降低生產成本以提高其應用的可行性，我們應從自然界其它具潛力的纖維分解族群尋找更高結晶性纖維分解活性之纖維素分解酶基因，或是仿效自然界相關物種之高效率分解機制，如纖維素分解酶複合體，以利此產業的發展。

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表 1- 2 纖維素分解酶的工業應用

Table 1-2 The applications of cellulases in industries(3).

產業別 作用與效果

紡織、

纖維素加工業

1.去除羊毛上的植物性物質

2.幫助面巾及浴巾的生化精鍊(bio-scouring)處理 3.牛仔布的生化老化(bio-aging)處理

4.亞麻布的生化軟化(bio-retting)處理

清潔劑工業分解嵌在衣物纖維素間的食物纖維素粒污垢

農產加工業 1.降低高濃度纖維素製品的黏度

2.提升油、香料等植物抽出物的回收量 3.去除果汁中的混濁纖維素

造紙工業 1.提升木材漿的散漿性(beating)

2.藉部分分解纖維素，脫除廢紙上的油墨、塗料及色料 (125)。

3.去除紙漿中的導管(vessel)，以提升紙張的可印刷性。

4.提升衛生紙的吸水性

5.漂白紙漿，減少電力的使用量。

6.改良紙漿濾水性(filterability)

飼料工業幫助反芻動物消化纖維素，進而提升動物飼料的可消化性。

果汁工業分解、去除水果的二級細胞壁(secondary cell wall)。

環保工業 1.清除排水管

2.添加在環保用、養殖用水的微生物製劑中。

3.甲烷發淨化促進劑

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表 1- 3 木聚醣分解酶的工業應用

Table 1-3 The applications of xylanases in industries(2).

產業別 作用與效果

紡織工業 1.去除植物纖維中的半纖維質，生產打包麻布（hessian）

或麻布（linen）。

2.減少漂白劑使用量，讓木質素不致氧化，避免纖維顏色的變深

紙漿、造紙工業 1.降低漂白劑使用量，減少廢液處理量。

飼料工業 1.分解 arabinoxylans，可以降低飼料的黏滯度，提高動物對飼料中營養分的吸收，降低非需要殘餘物排放，進而減少環境汙染。

烘培、飲料及食品工業

1.木聚醣酶添加於麵粉，可分解半纖維可增加麵糰的體積和吸水度，並改善麵糰的發酵狀況。

2.改進蔬果的液化、增加果汁的產率和穩定性，並提高香氣與其他營養成分的回收，降低果汁的黏滯度。

製藥與化學用品工業

1.木聚醣酶配合其他酵素(半纖維質分解酵素和蛋白酶)，可做為消化不良的飲食補充品。

2.特定水解程度後的低聚合程度木聚醣，可做為藥劑的運送劑或保護劑，或腸道微生物益生劑。

3.木聚醣完全水解生產木糖，可以繼續轉換成乙醇、有機溶劑和人工的低卡路里甜味劑（木糖醇，xylitol）等高經濟價值物質。

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1.5 纖維素分解酶與木聚醣分解酶來源

自然界中纖維素被 cellulase 所分解而成為其它生物生長所需之碳源，目前已知具有纖維素分解能力的生物包括細菌、真菌、原生動物與植物。在細菌方面，

Bacillus 屬細菌、土壤中的放線菌、厭氣性細菌 Clostridium 屬及瘤胃厭氣性細菌 (rumen anaerobic bacteria)中 Ruminococcus、Fibrobacter 等屬為細菌族群中具較強纖 維素分解能力的物種(78, 98, 100, 116)。Bacillus 屬細菌的 cellulase 具有較好的耐鹼 性(45)，而放線菌所產生的 cellulase 多具有較高的耐熱性及耐鹽性(59)。真菌方面，

Trichoderma、Aspergillus 與 Penicillium 等屬是目前常見具有纖維素分解能力的真菌 (21, 112, 130)，也是現今 cellulase 的主要工業生產菌株，而其中 Trichoderma 屬真 菌所產生的 cellulase 最常被使用並受到廣泛的研究，包括 cellulase 基因分離、作用機制與蛋白質結構分析。

自然界中，木聚醣主要為微生物所分解，在含有植物性纖維體累積的環境，

即可篩選到分解木聚醣的微生物，如腐生（saprophytic）、土壤、水中、厭氣性、室溫、高溫、或是生長於瘤胃動物的瘤胃或食用木頭昆蟲的腸道中，都有分解木聚醣 的微生物存在(127)。好氣性真菌 Trichoderma 和 Aspergillus 能分泌高濃度且多樣性 的木聚醣分解酶，能將聚合物分解成單糖或是雙糖。一般真菌來源木聚醣分解酶的反應最適 pH 值為偏酸性，小於 pH 5.5，且多含有纖維質分解酶的活性(57)。好氣性細菌木聚醣分解酶一般具有嗜鹼性和熱穩定特性，是工業上耐鹼性木聚醣分解酶的生產來源(66)。

由於目前從好氣性真菌，如 Trichoderma 屬所得之較強 cellulase 多屬內切型式 的 endoglucanases，其僅能對纖維素中非結晶性 (amorphous)區域進行水解，但對於具高度結晶的天然纖維素分解效率並不高(78)，此種現象亦為目前許多 cellulase 應用時效果不佳的原因(20)。在 cellulase 研究範疇中，另一項重要課題即為尋找能分解結晶性纖維素的高活性 cellulase 來源，以提升 cellulase 的應用價值。在自然界中，

另一個能利用纖維素質並以其作為能量來源的族群為草食動物(herbivores)。

草食動物雖可食入植物體作為能量來源，但其本身消化道並不能分泌可分解植物結構性多醣的相關酵素，而是依賴生存於其消化道中的微生物產生相關的酵素

(21)

將植物殘體分解以供草食動物利用(135)。

在草食性動物中，反芻動物，如偶蹄動物羊、牛的前消化道中除了食道外，

還包括四個胃，連接於食道後的第一個胃為瘤胃(rumen)。以牛為例，瘤胃與連接在後的蜂巢胃形成一個體積約為 100~150 公升的發酵腔(fermentation vessel)，且含有高密度的微生物族群(65)。一般瘤胃的酸鹼值會隨著攝食狀況而略有變動，但都可維持在 pH 5.8~6.8 之間;而在溫度方面，因微生物發酵生熱的原因，其溫度會略高於體溫，而且也會隨著飲水與內部物質發酵情況而有變化，一般而言，其溫度會維持在 39℃。由於瘤胃的存在，使得反芻動物吃入草料後能使植物殘體停留於瘤胃約 60~90 小時，相較於一般單胃的草食性動物，如奇蹄動物中的馬，其植物殘體停留在消化道約 30~40 小時的時間更長，因此更能有效分解植物殘體(65)。反芻動物提供一個穩定的場所供微生物生長，而微生物幫助其宿主分解植物殘體，在此種互利共生的狀態下，反芻動物消化道中的微生物演化成對植物結構性多醣具有高效率分解能力的族群，因此，存在於反芻動物消化道中的厭氣性微生物可成為 cellulase 及 hemicelluase 的另一潛力來源(135)。

近年研究顯示，多數瘤胃纖維素分解細菌 Ruminococcus、Butyrivibrio 屬等和 一些環境中的厭氣性纖維素分解細菌如 Clostridium 屬在 cellulase 系統類似，這些 物種的纖維分解酶多以形成複合體形式並附著或分泌至環境中(78)。這種複合體形式系統也是目前已知自然界存在最具纖維素分解能力的機制(15)。近年研究亦顯示，

在其它好氣性微生物如 Paenibacillus curdlanolyticus 中可發現類似的纖維分解機制 (103)。

(22)

1.6 纖維素分解酶複合體-Cellulosome

(1) Cellulosome

1983 年 Lamed 及 Bayer 等人於 Clostridiales 屬的纖維素分解細菌中發現其可 產生高分子量具有 cellulase 活性的蛋白質(16, 75)，並於培養上清液中發現，這些具高分子量的 cellulase 及 hemicellulase 是由多種酵素組成之多次單元複合體，並稱此複合體為纖維素分解酶複合體(cellulosome)(74)。Cellulosome 如同核糖體一樣，像是一個巨分子機器，它能組織、聚集各種次單元體，如 cellulase 和半纖維分解酶，

並能以協同作用(synergism)方式有效地分解纖維基質，此亦是厭氣性纖維利用菌有別於好氣性微生物所發展出的特有纖維基質分解機制。Cellulosome 直徑約為 18 nm，

其分子量約為 2 ×10⁶至 6 ×10⁶ Da，由 14 至 50 個分子量約 37 kDa 至 210 kDa 的蛋 白質所組成，在某些物種，如 Clostridium thermocellum 及 Acetivibrio cellulolyticus，

其 cellulosomes 可再組成分子量達 5×10⁷ 至 8 ×10⁷ Da 稱為 supercellulosomes (polycellulosomes)的複合體(17, 18, 75)，其在菌體表面像是一突出細胞表面之胞器。

相較於好氣性微生物所產生的 cellulase 系統，雖然此系統可產生包括 exo-β -1,4-glucanase、endo-β -1,4-glucanase 以及 β –glucosidase 等三大類的 cellulase，並以協同作用方式有效地分解纖維素，但因這些酵素都以自由游離(free form)的形式(7) 存在於環境中，需靠著各類酵素與基質的碰撞、結合才有機會進行完整的纖維素分解作用。而在厭氣性細菌的 cellulosome 中，與分解纖維素及半纖維素相關的酵素 藉由其錨固區(docking domain, dockerin)與一稱為支架蛋白質 (scaffolding protein, scaffoldin)的非催化性蛋白質中結合區(cohesive domain, cohesin)結合而成為一 cellulosome，由於這些分解酶藉此結合機制而聚集一起，故能有效率地獲得並分解各步驟產物。此外，這種複合體藉由支架蛋白質中與纖維基質有強結合力的纖維素 結合區 (cellulose binding domain, CBD) or carbohydrate-binding module, CBM)而與 纖維基質結合，故能在動態的環境中存留更久且更有效地分解纖維素(16)，目前已知可產生 cellulosomes 之厭氣性微生物如表 1-4 所示。

(23)

表 1- 4 產生纖維素分解酵複合體之厭氣性微生物

Table1-4 Cellulosome-producing anaerobic microorganism(14).

Microorganism Source

Anaerobic bacteria

Acetivibrio cellulolyticus Sewage Bacteroides cellulosolvens Sewage Butyrivibrio fibrisolvens Rumen Clostridium acetobutylicum Soil Clostridium cellobioparum Rumen Clostridium cellulolyticu Compost

Clostridium cellulovorans Wood fermenter

Clostridium josui Compost

Clostridium papyrosolvens Paper mill Clostridium thermocellum Sewage soil

Ruminococcus albus Rumen

Ruminococcus flavefaciens Rumen

Anaerobic fungi*

Neocallimastix patriciarum Rumen

Orpinomyces joyonii Rumen

Orpinomyces PC-2 Rumen

Piromyces equi Rumen

Piromyces E2 Faeces

* 厭氣性真菌其纖維分解酶具有非催化活性之重覆序列，

但到目前為止，其支架蛋白質基因尚未被發表。

(24)

(2) 支架蛋白質-Scaffoldin

Scaffoldins 是 cellulosomes 中的骨架，其本身不具酵素活性。C. cellulovorans 的 scaffoldin 基因是第一個被定序的支架蛋白質基因，但當時只知此蛋白質對纖維素具有高吸附能力，而對其蛋白質序列上一些重覆性的片段之性質卻不了解(118)。

一直到了 C. thermocellum scaffoldin (CipA)的序列及其與各種酵素間的關係被研究 後，研究者們才確定了 scaffoldins 在這個龐大的複合體中是扮演骨架的角色(14)。

之後在其它厭氣性細菌物種中也陸續發現了各類型的 scaffoldin 基因。就目前發表的 scaffoldins 而言，可依其組成及特性分為兩大群。第一群 scaffoldins 其組成包含了 5 至 9 個數目不等稱為 cohesin 的結合區(即第一型 cohesin)、一個碳水化合物結合區 CBM 及數量不等稱為 X domain 的未知功能區。這些 cohesins 的胺基酸序列具有高同源性(homology)，其可與各類 cellulase 及 hemicellulase 中稱為錨固區的 dockerins (即第一型 dockerin)結合。目前已知產生此類 scaffoldins 的物種包括嗜溫 厭氣性細菌 C. cellulolyticum、C. cellulovorans、C. josui 及 C. acetobutylicum。第二 群 scaffoldins 可再分為三類。第一類 scaffoldins 的組成如同第一群 scaffoldins 的組成，但多了一個 dockerin (即第二型 dockerin)，一般亦稱此種可結合多個酵素且具有 dockerins 的 scaffoldins 為 primary scaffoldins，但現已有部份文獻也將第一群之 scaffoldins 稱為 primary scaffoldins。第二類 scaffoldins 稱為 anchoring scaffoldins，

其組成中的 cohesins (即第二型 cohesin)有別於 primary scaffoldins 中的第一型 cohesins，其只能與 primary scaffoldins 上的第二型 dockerins 結合，此外，anchoring scaffoldins 的另一特徵為其具有稱為 SLH (S-layer homology)的區塊，其功能為使 anchoring scaffoldins 與菌體表面結合，而讓 cellulosomes 存在於菌體表面(77, 87)。

第三類 scaffoldins 稱為 adaptor scaffoldins，其組成份如同 anchoring scaffoldins，但缺乏 SLH domains，亦即就能產生第二群 scaffoldins 的物種而言，各類纖維素及半 cellulase 組合至 primary scaffoldins 後，這些 primary scaffoldins 會再接至 adaptor scaffoldins ，最後再由這些 adaptor scaffoldins 與連接於菌體表面的 anchoring scaffoldins 結合而成為 polycellulosomes。能同時產生 primary 和 anchoring scaffoldins 的物種包括嗜熱厭氣性細菌 C. thermocellum、瘤胃厭氣性細菌 R. flavefaciens、B.

cellulosolvens 及 A. cellulolyticus，而目前已知物種中，只有 A. cellulolyticus 可同時 產生三種 scaffoldins(140)。相對於可產生 anchoring scaffolds 而藉由其 SLH domains

(25)

作為與菌體表面結合的媒介，嗜溫厭氣性細菌目前為止尚未發現 anchoring scaffolds 的存在，其所產生的 cellulosomes 與菌體間的結合媒介為何，目前仍為此類研究的 重點之一，但近年有關 C. cellulovorans 的 cellulosome 系統研究發現，其所產生的 cellulosomes 主要藉由 primary scaffoldins 上的 HLD (hydrophilic domain，一種 X domain)及主要酵素 EngE (endoglucanase E)上的 SLH domains 與菌體表面結合(72, 128)。

大部分的糖苷水解酶(glycosyl hydrolase)都含有 CBM，研究顯示，CBMs 的存在能使這些水解酶增加對不可溶性基質的分解能力。CBMs 與糖苷水解酶一樣，依其胺基酸序列相似度可分為 64 個族群 (families)(23) ( http://www.cazy.org/fam/acc_CBM.html)，若依其構型摺疊的相似性，則其可分為 7 個 superfamilies;然而就其功能性而言，CBMs 可分為三大類型。Type A CBMs 以位於同一平面上的芳香族胺基酸(Trp, Tyr, His)專一性地與結晶性纖維基質表面結合;

type B CBMs 則只與單一條多醣鏈(polysaccharide chain)結合;而 CBMs 中與其相連的催化區具有相同碳水化合物結合專一性者皆稱為 type C CBMs，而此類 CBMs 只能與可溶性的基質結合。就目前已知的各類型 scaffoldins 而言，其組成中的 CBM 則屬於 CBM family-3 或為 type A。Scaffoldins 藉由此種 CBMs 與結晶性纖維基質結合以及其與菌體表面的連結而將菌體帶至基質並分解之(14)。

(26)

(3) 結合區-Cohesin

根據 C. thermocellum 的 cohesins 胺基酸序列同源性及其與 dockerins 的結合專 一性研究顯示，位於 primary scaffoldins 和 anchoring scaffoldins 上的 cohesins 是具有差異性的(76, 113)，並將其分別分類為第一型(type I)和第二型(type II)。然而，當 瘤胃細菌 R. flavefaciens 的 cohesins 序列及結合特性被研究後，由於其與已知的 cohesin 系統差異大，故將其 primary scaffoldins 以及 anchoring scaffoldins 上的 cohesins 歸類為第三型(type III)。另一個特殊例子為 B. cellulosolvens，其 primary scaffoldins 上的 cohesins 與其它物種 anchoring scaffoldins 上的 cohesins 在胺基酸序 列上相似度較高，故其 cohesins 的分類上與其它物種相反(43)。C. thermocellum 的 scaffoldin CipA 含有九個 cohesins，由胺基端(N-terminal)開始的第 3 至第 8 個位置的 cohesins (cohesin-3 至 cohesin-8)彼此間具有較大的序列相同度，約為 95％。第 2 和第 9 個位置的 cohesins (cohesin-2、 cohesion-9)其與第 3 至第 8 個位置的 cohesins 序列相同度較低，只具有 75％相同度，而第 1 個位置(cohesin-1)與第 3 至第 8 個位置的差異度則更大，約只有 63％相同度。這樣的序列差異性普遍存在於同一 scaffoldin 上的 cohesins，如 C. cellulovorans 的 scaffoldin CbpA，其 cohesins 間的相 同度約介於 42-90％間。就不同菌種間的差異而言，其 cohesins 序列相同度約在 30-50

％間;而各物種中，第一型與第二型 cohesins 間的差異更大，只有 15-26％相同度。

有關 cohesins 的蛋白質立體結構研究中，目前已有第一型及第二型 cohesins 的立體 結構被發表。第一型的例子包括 C. thermocellum scaffoldin CipA 上的 cohesin-2 (PDB code 1ANU)(117)和 cohesin-7 (PDB code 1aoh)(129)以及 C. Cellulolyticum scaffoldin CipC 上的 cohesin-1 (PDB code 1G1K)(120)，其立體結構構型相似，為一似捲心蛋 糕(jelly-roll)構形。以 C. thermocellum scaffoldin CipA 上的 cohesin-2 為例，其包含 138 個胺基酸，而由 9 個 β-strands 形成的 β-sandwich 結構;此結構可分為兩部份，

其一為由 4 個 strands 形成的 antiparallel β-sheet (β-strand 8,3,6,5)，另一個為由 5 個 strands 形成的 mixed β-sheet (β-strand 9,1,2,7,4)，在結構的中心位置則是由以苯丙胺酸(phenylalnine)為主要組成的疏水性中心。

第二型 cohesin 立體結構研究亦顯示其彼此間具有相似的 jelly-roll 構形，此結 果和第一型結構相似，但其間仍存有幾個明顯的差異處。以 B. cellulosolvens Bc-cohesin-II (PDB code 1TYJ)(97)為例，這些結構上的差異包括(Ⅰ) 第二型 cohesin

(27)

具有一個 α-helix 插入 β-strand 6 和 7 間; (Ⅱ) 第二型 cohesin 具有兩個稱為 β-flap 的二級結構，其分別插入 β-strand 4 和 8 中間部份，但這兩個 β-flaps 並不會改變 β-strand 原本在空間中延伸的方向。這兩種差異性也成為胺基酸序列差異外，第一型與第二型 cohesins 最大的鑑別處。另外，在這些結構研究中亦發現 cohesins 在結晶過程中會形成二元體(dimer)。研究顯示，這些二元體間存在著互補性界面 (complementary interface)關係，靠著其間的作用力，包括鹽橋作用(salt bridge)、氫鍵(hydrogen bond)以及疏水性作用力(hydrophobic interaction)，使其二者結合，而這些作用力主要是發生在 β-strand 8,3,6,5 界面中較保守的胺基酸上。此種二元體在生理功能上的角色仍需進一步探討，目前研究者推測其可能是和 cellulosomes 組裝調節有關。尚未有適當的酵素至結合位置時，scaffoldins 可藉由 cohesins 形成二元體的機制關閉 scaffoldins 與其它酵素的非專一性結合(97, 117)。

(28)

(4) 錨固區-Dockerin

參與 cellulosome 的各種 cellulase 及 hemicellulase 都具有一段稱為 dockerin 的錨固區，這些酵素藉由 dockerins 與 scaffoldins 上的 cohesins 結合而組合至 cellulosomes 中。Dockerin 由約 70 胺基酸組成，通常出現在酵素的羧基端(carboxyl terminal)，目前研究亦顯示有些 scaffoldins 也具有 dockerins，而此種 dockerins 的出現也使得不同類型的 scaffoldins 能再組合成 multicellulosome(14)。如同 cohesins 依胺基酸序列同源性及結合專一性所作的分類，dockerins 依胺基酸序列同源性及相對應的 cohesins 結合類型，其亦可分為三型。第一型 dockerins 通常位於各種參與 cellulosome 組合的 cellulase 及 hemicellulase 之羧基端;第二型 dockerins 則是位於 scaffoldins 上;第三型則屬於 R. flavefaciens 系統。Dockerins 的胺基酸序列分析及生 化特性研究顯示，一個 dockerin 序列中存在兩個高相似度約由 22 胺基酸組成的重覆序列(duplicated sequence)，而在這兩個重覆序列中間的是一段約 9-16 個胺基酸組成的連結區(linker)(101)。經由截切形式的 dockerins 結合實驗結果顯示，只有單一個重覆序列時，重組 dockerins 會失去與 cohesins 結合的能力，若將這兩個序列的順序調換或以同樣序列之重覆式出現，則其與 cohesins 間的親和力並未受到影，由此可知 dockerins 中的兩個重覆序列在與 cohesins 結合作用中扮演著關鍵性的角色 (50)。有關 dockerins 序列方面的研究指出，dockerins 每個重覆序列中的前 12 胺基酸，其在序列上與已知的 EF-hand motif 中鈣離子結合環(calcium-binding loop)構形相似，但是其缺少了 E-helix 構形，立體結構與 EF-hand motif 相異(85, 101)。經與 cohesins 胞外(in vitro)的結合實驗證實，cohesin-dockerin 的結合作用需有鈣離子的 參與(34, 142)，鈣離子的作用為誘使 dockerins 在結合過程改變構形以利與 coehsins 的結合，並穩定此結合複合物的立體結構(6, 86)。

(29)

(5) 結合區與錨固區結合作用-Cohesin-dockerin interaction

以 C. thermocellum xylanase 10B (Xyn 10B)之 dockerin 與其 CipA cohesion-2 之 結合作用為例，Xyn 10B 的 dockerin 由 3 個 α-helix 組成，這 3 個 helix 以 loop-helix motif 及 helix-loop-helix motif 出現在立體結構中，而 helix-1 和 helix-3 為一般 dockerins 中保守的結構，其位置分別位於 dockerins 的兩個重覆序列中; helix-2 則為 dockerins 中較不保守的結構，並非所有 dockerins 都具有。Dockerins 在溶液中時，

其構形是較具彈性的(flexible)，而當 dockerins 和 cohesins 結合時，helix-1 和 helix-3 的位置會比未結合之前更為靠近且整個 dockerin 在結構上也更穩定。若將 dockerins 與 cohesins 在結合及未結合時的構形重疊比較，可看出 dockerins 在未與 cohesins 結合時，其 helix-3 距離 cohesins 較遠而無法有結合作用力的產生，因此 dockerins 與 cohesins 結合時，dockerins 需有構形上的改變才能達成結合作用(29)。Xyn 10B dockrein 與 CipA cohesion-2 結合之異質二元體(heterodimer)立體結構中，其 dockerin 主要以 helix-3 與 cohesin 的 8,3,6,5 β-sheet 間的疏水性作用力與分子間氫鍵鍵結進 行結合，而 helix-1 與 8,3,6,5β-sheet 間的作用力則較少。C. thermocellum CipA cohesion-7 的定點突變研究顯示，cohesin-7 的 Asp39、Tyr74、Glu86 和 Gly89 在與 dockerin 結合或形成 cohesin 二元體時扮演著關鍵角色(91);而有關 C. thermocellum、

C. josui 及 C. cellulolyticum 其 cohesins 與 dockerins 間的結合作用研究顯示，此種蛋 白質間親和力其結合常數 KA≧10⁹ M^-1(50, 69)，相當於抗原與抗體間的親和力(KA

10⁷-10¹¹ M^-1)(136)。在 CipA cohesin-2 中，若將其相對應於 cohesin-7 Asp39 的 Asp34 替換成 Asn34，則其與 dockerin 間的親和力會降低 1000 倍(58)。Cohesin-2 相對應於 cohesin-7 的 Asp39、Tyr74 和 Glu86 胺基酸與 cohesin-7 的結合方式相同，這些胺基酸都直接與 dockerin 上的胺基酸進行鍵結，然而，Gly89 則需有一個水分子的 調節才能與 dockerin 中的 Arg53 連結。此外，目前研究顯示，C. thermocellum 和 C. cellulolyticum 的第一型 cohesins 可以和其本身酵素所含的 dockerins 結合，亦即 在種內 cohesins 和 dockerins 的結合是非選擇性的(nonselective)(84, 102)。雖然此兩物種的 dockerins 在胺基酸序列上有高同源性，但在與 cohesins 結合上卻有著物種間的差異性，亦即 cohesins 和 dockerins 的結合作用是具有種的專一性(species specificity)(101);而在同一物種內，同一 dockerin 可與同一 scaffoldin 來源的不同 cohesins 結合，但其間的親和力差異可達 10 倍，因此，cellulosomes 在組成過程中，

(30)

其 cellulase 及 hemicellulase 可能是以隨機方式結合至 scaffolinds 上的 cohesins(69, 106)。C. josui 和 C. thermocellum 亦有相同現像，表示 cohesin-dockerin 的結合作用 在 Clostridium 屬中普遍存在種的專一性。然而，最近的研究卻顯示，C. thermocellum Xyn 11A 可與 C. josui 的 cohesin 結合(69)，另外，Xyn 11A 和 Xyn 11B 亦可與 C.

thermocellum 和 C. cellulolyticum 的 cohesins 結合。從序列分析結果顯示，C.

cellulolyticum 和 C. josui 彼此的 cohesins 與 dockerins 具有高相似度，而 C.

thermocellum Xyn 11A 與 Xyn 11B 能與 C. cellulolyticum 的 cohesins 結合，應與 Xyn 11A 能和 C. josui cohesin 結合一樣，是一種非典型 (untypical)的 cohesin-dockerin 結合作用，至於是什麼因素使得 Xyn 11A 與 Xyn 11B 能產生交叉反應(crossreactivity) 現像，目前尚未得到進一步研究探討，這可能是 scaffoldins 中，其 cohesins 專一性結合的多樣化現像，但仍有待更多物種來源的 cohesins 序列被分析、研究進一步證實。經由各物種來源的不同 dockerins 其胺基酸序列分析及定點突變實驗結果顯示，

dockerins 的每個重覆序列中，calcium-binding motif 的第 10、11、17、18 及 22 位 置和其與 cohesins 專一性結合的辨識有關，(14, 88)，當 C. thermocellum CelS 與 C.

cellulolyticum CelA 的 dockerin 其辨識位置胺基酸互換時，此兩酵素即可與對方的 cohesins 進行結合作用(89)。由 cohesin-dockerin 結合體的結構分析得知，cohesins 中共有 16 個胺基酸參與結合作用，以 C. thermocellum CipA 的 cohesin-2 為例，共 有 4 個胺基酸藉由水分子與 dockerin 鍵結，5 個氫鍵結以及 7 個疏水性作用力，其 中 Ala36、Asn37 及 Glu131 為其辨識位置(29)。C. thermocellum CipA 的 8 個 cohesins 中，直接參與 cohesins 和 dockerins 結合作用的氫鍵鍵結胺基酸是相同的，也因此 dockerins 可與同一物種來源之 scaffoldin 上的 cohesins 產生專一性的結合(101)。

(31)

(6) 纖維素分解酶複合體基因群-cellulosome gene clusters

Cellulosomes 各組成分基因大部分以基因群(gene cluster)形式存在於物種基因組(genome)中，一般可將其分成兩大類(14)。一類為由兩個或兩個以上的 scaffolidin 基因所組成，稱為多支架蛋白質基因群 (Multiple-scaffoldin gene clusters)，這些 scaffoldins 包含具有第二型 dockerins 的 primary scaffoldins、anchoring scaffoldins 以 adaptor scaffoldins;另一類則由第一群 scaffoldin(不含第二型 dockerins 之 primary scaffoldins)基因及 cellulosmes 中各種分解酶基因所組成，稱為酵素連結基因群 (Enzyme-linked gene clusters)。對於 C. thermocellum、R. flavefaciens、B. cellulosolvens 及 A. cellulolyticus 等具有多支架蛋白質基因群的物種而言，其與纖維基質分解相關 分解酶基因大部分也是以基因群的形式存在於基因組中，然而，這些基因群所包含的基因除了屬於 cellulosome 組成者外，亦包含了不屬於 cellulosome 組成的分解酶 基因。以 C. thermocellum 為例，目前已有包含 celC-celT、celI-cseP、celA-orfZ、

celk-cbhA、xynB-xynA 等基因群被發表，在 celI-cseP 和 celA-orfZ 基因群中，CelI 及 CelA 因不具有 dockerins，故其不屬於 cellulosome 組成中的分解酶(145)。另外，

celk-cbhA 及 xynB-xynA 基因群，由於各具有兩個相似度高之基因，因此被認為其是 由基因複製 (gene duplication)所產生(61)。

(32)

(7) 重組纖維素分解酶複合體-Cellulosome chimeras

80 年代開始已有許多屬於 cellulosme 組成的 cellulase 及 hemicellulase 基因被選殖、表達及分析，其中 cellulase 多屬於包含了外切型 (exo-)及內切型(endo-)作用機制的糖苷水解酶第 5、8、9、48 族群。這些分解酶對於水溶性或結構較鬆散的非結晶性或不定型(amorphous)纖維素都具有高分解效率，但對結晶性纖維素的分解效率則非常低;研究顯示，在這些分解酵素中，有些組合可以對結晶性纖維素進行分 解，如 C. cellulolyticum 的纖維分解酶 Cel48F 及 Cel9G，當其以游離形式(free form) 同時存在於纖維分解反應中，其可得到較分解酵素單獨作用時更高的分解效率，而這樣的作用即稱為協同式(synergistical)分解作用。然而，這樣的分解效率仍比天然的 cellulosomes 對結晶性纖維素分解的效率還低 40 倍(48)。自然界中，這些分解酶利用 cellulosome 的機制使得對結晶性纖維素進行分解時能得到最大的協同作用及效率;相對於其它蛋白質複合體(如 proteasome、ribosome)，cellulosmes 的各次單元體在與 scaffoldins 結合時並沒有固定的排列位置，而且這些物種同時分泌出的 cellulosmes 各次單元體在個數比例、組成、排列及大小等複雜性問題都使得對 cellulosme 的整合機制及其協同催化作用的研究產生困難，因此，建立一套簡化、

具同質性及已知組成分的重組 cellulosome(cellulosme chimeras)或迷你纖維素分解酶複合體 (minicellulosme)，為此一研究領域的關鍵。目前研究者已經成功地建立多個完整的 scaffoldin chimeras，其組成包含一個 CMB (family-3)及兩個分別來自 C. thermocellumpux 及 C. cellulolyticum 的 cohesins (type I)，另亦有具兩個 CBMs 或 不具 CBM 之 scaffoldin chimeras，其主要設計原理是根據不同種間 cohesin 與 dockerin 的專一性結合特性，以確定能在胞外得到預期的 cellulosome chimears 組合 (48, 49)。這樣的 cellulosome chimeras 組合現已被利用於各類型 CBMs、不同分解酵 素組合對於結晶性纖維素分解的機制探討以及其在生物體內 (in vivo)調控的研究 (95)。此外，近年亦有以基因工程改造菌株生產 cellulosome chimera 的相關研究，

目的在於使一非纖維利用菌株藉由 cellulosome chimera 的產生，而能以廢棄的纖維基質為碳源以達到降低成本及其它生物技術的應用(107)。

關於 cellulosmes 的研究發展至今已超過二十年，在此範疇中仍有許多方面持 續地發展，包括: (Ⅰ)隨著 C. thermocellum 的基因組解碼以及其它物種 cellulosome 相關基因的陸續發表，研究者可獲得愈來愈多的資訊及資源以利探究各物種間

(33)

cellulosome 這種纖維素分解機制的調控、多樣性及系統差異 ; ( Ⅱ ) 為了了解 cellulosome 的作用機制及提高其應用性，建構 cellulosme chimeras 是一可行且便利方法，而為了能在胞外調控其各次單元體的組成、樣式、結合與分離，仍需更多各次單元體或功能區塊(domains)在其序列、結合專一性與親和力、立體結構以及其它生化、蛋白質工程方面的研究基礎; (Ⅲ)具可調控性的 cellulosome chimeras 不僅可以應用於和纖維基質分解相關的領域中，其中 scaffoldin chimeras 的概念在蛋白質 (或酵素)固定化及多蛋白質(酵素)作用機制的應用亦具發展潛力。

(34)

1.7 厭氣性真菌

自然界中，厭氣性真菌 (anaerobic fungi)目前只被發現分佈於反芻動物與單胃草食性動物的消化道中，故又稱為瘤胃真菌(rumen fungi)或是腸道真菌(gut fungi)，

其在瘤胃的族群密度約為 10⁵~10⁶/g rumen digesta(9)。第一株厭氣性真菌為 Orpin 於 1975 年自綿羊的瘤胃液中分離出，命名為 Neocallimastix frontalis Orpin(99)，到 目前為止，共有分屬六個屬的 18 株厭氣性真菌菌種被分離鑑定並且完成命名，由 於 N. frontalis 與 N. patricarum 在形態上不易辨別，另外，環境的改變及生長壓力常 造菌株在形態上的變異，不同實驗室對動孢子顯微構造的觀察也不易比較。Ho 等 人在認為 N. patricarum 應是 N. frontals 的同義株(synonymy)(64)。至目前為止仍有 許多研究視這兩株菌為不同物種，因此，在這兩物種在分類上尚有爭議。核糖體基因已廣泛被利用做為分子分類指標，而厭氣性真菌的此分類上，目前只能以內部轉 錄區(internal transcribed spacer 1, ITS1)區分 Neocallimastix 屬與其它四個屬(26)。厭 氣性真菌的分類地位及已知菌種分別整理如表 1-5 與表 1-6(4)。

(35)

表 1- 5 厭氣性真菌的分類地位表

Table 1-5 The classification of anaerobic fungi(25, 80).

Kingdom Fungi

Phylum Chytridiomycota

Class Chytridomycetes

Order Neocallimastigales

Family Neocallimastigaceae

Generus Neocallimastix、Piromyces Caecomyces、Orpinomyces Anaeromyces、Cyllamyces

(36)

表 1- 6 已知的厭氣性真菌菌株

Table 1-6 The known species of anaerobic fungi(4, 32).

Genera Species Host

Neocallimastix N. frontalis

=N. variabilis N. patricarum N. hurleyensis

Sheep

Sheep Piromyces P. communis

P. mae

P. dombonica P. spiralis P. minutus P. citronii P. rhizinflatus P. polycephalus

Sheep Horse Elephant Katjang goat Sika deer Pony

Saharian ass Water buffalo Orpinomyces O. joyonii

=O. bovis

=N. joyonii O. interalaris

Sheep

Water buffalo Anaeromyces A. elegans

A. mucronatus

Cow Sheep Caecomyces

(Sphaeromonas)

C. communis C. equi

C. sympodialis

Sheep Horse Cow Cyllamyces C. aberensis Cow

(37)

1.8 厭氣性真菌纖維素分解酶系統研究

(1) 纖維素分解酶

自 1975 年瘤胃厭氣性真菌被發現後，已有許多厭氣性真菌的分離鑑定、其在瘤胃纖維素分解上所扮演的角色及其所產生的 cellulase 的相關研究(9, 25, 79, 82, 110, 132, 137)。一般纖維素分解菌如 Trichoderma 與 Clostridium 屬被認為對纖維素 具有較強的分解能力(130)，而 Trichoderma 屬中的 T. reseei 與 T. viride 對於纖維素 不定形區域有高的水解能力，但對於結晶性部份則是非常低(20)。根據目前的研究顯示，厭氣性真菌 cellulase 對於結晶性纖維素的分解能力高於已受到廣泛研究的 Trichoderma 與 Clostridium 屬來源 cellulase(40)。由於分子生物學的進展，已有許多 厭氣性真菌來源的 cellulase 基因被選殖(cloning)、轉形(transformation)至原核生物中表達(expression)與進行酵素特性分析(10, 30, 31, 35, 40, 44)。在厭氣性真菌 cellulase 基因選殖方面，目前已有 79 條與分解纖維素相關的酵素基因登錄在基因資料庫中，

其分屬糖苷水水解酶族群 1、3、5、6、9、45、48 族群中，這些基因序列在組成上具有兩個特色，第一、大多數厭氣性真菌 cellulase 基因並不存在插入子(intron)(144)，

第二、厭氣性真菌 cellulase 基因的 G+C 百分比低於 20％，遠低於其它真菌(28, 110)。

以胺基酸序列的結構組成而言，好氣性真菌 cellulase 的一級結構中除了催化區域(catalytic domain)外，其還包含了用以與催化基質(substrate)結合的纖維素結合區域(CBD)(55)，文獻報告中將這種組合形式的分解酶歸類為游離形式(free form) cellulase。目前有少數被選殖與表達的厭氣性真菌 cellulase 具有 CBD，所以厭氣性真菌 cellulase 系統亦類似好氣性纖維分解微生物，具有游離式的系統(30, 35, 40)。

然而，更多的研究報告指出，厭氣性真菌的 cellulase 及 hemicellulase 的一級結構為 催化區域與錨固區域的組合，此與厭氣性細菌如 Clostridium 屬與 Ruminococus 屬等 cellulase 一級結構的組成類似，因此，一般推測厭氣性真菌的纖維素分解系統應該還具有與厭氣性細菌類似的複合形式的系統，cellulosome(46, 52, 122)。

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(2) 纖維素分解酶複合體

在厭氣性真菌的 cellulase 系統中，除了可產生與好氣性微生物相同的游離式分解酵素外，其也具有與厭氣性細菌相似的大分子 cellulosome 系統。早期研究顯 示，在厭氣性真菌 Neocallimastix、Orpinomyces 和 Piromyces 屬中可發現能產生類 似 cellulosome 系統的菌種(7, 42, 46, 131, 138)，以 Piromyces sp. E2 為例，Teunissen 等人從此菌培養上清液純化 endoxylanase 的過程中發現一個分子量約 1200 kDa 且具有木聚醣酶活性的蛋白質複合體，後來 Dijkerman 等人對此複合體的研究發現，

其亦具有 avicelase、endoglucanase、β-glucosidase 的活性，經過界面活性劑處理後，

發現其至少由 10 個多肽鏈組成。類似的情形亦在 P. equi 的研究中被發現，其複合 體的分子量約 670 kDa，由至少 10 個分子量從 50 至 190 kDa 的多肽鏈組成，這些多肽鏈中包含了 endoglucanase、xylanase 及 mannanase 的活性。Wilson 等人比較 N. frontalis、C. thermocellum 的 cellulosome 及 T. reesei 的纖維素分解系統對結晶性 棉花纖維的分解能力結果顯示，C. thermocellum cellulosome 對此基質的分解能力遠 優於 T. reeseicellulase 系統，約有 5 倍差異，而 N. frontals cellulosome 則又優於 C.

thermocellum cellulosome 的分解能力，因此，厭氣性真菌的 cellulosome 系統為一具 潛力的 cellulase 系統來源。1995 年，Fanutti 等人從 Piromyces xylanase A、mannanase A 以及其它厭氣性真菌 cellulase 及 hemicellulase 的一級結構分析，發現其組成除了催化區外，另具有高相似度、約 40 個胺基酸組成的重覆序列，且其不能與纖維素 結合。此外，這兩個酵素分別可與來自 Piromyces 和 N. patriciarum 複合體中分子量 約 97 及 116 kDa 的組成分結合(46)。這些重覆性序列出現在大部份已發表之厭氣性真菌 cellulase 及 hemicellulase 中，且實驗證實其與基質結合無關，因此，相關研究者認為此重覆序列的功能與厭氣性細菌分解酶中的 dockerins 相似，這些研究結果也更進一步對厭氣性真菌存在著 cellulosome 系統提供佐證。然而，截至目前為止，

有關厭氣性真菌纖維素複合體中假定的 scaffoldin 基因仍未被發表。2011 年 3 月美國能源部(U. S. Department of Energy, DOE)所屬的基因組研究中心，DOE Joint Genome Institute (DOE JGI)已經完成厭氣性真菌 Piromyces sp. 的基因組草圖 (http://www.jgi.doe.gov/genome-projects/)，未來此基因組序列資訊可為厭氣性真菌 cellulosoem 系統的研究提供更有利的研究基礎。

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1.9 研究動機

cellulase 於應用時效果不佳的原因主要在於纖維素具有高度結晶性、鍵結組成多樣且其外層有各種半纖維素的包覆。因此對纖維素要有效分解，除了需要有高結晶性纖維素分解能力的酵素外，亦需要其它不同型式的 cellulase 及 hemicellulase 互相配合。具高結晶性纖維分解能力的厭氣性細菌 cellulosome 系統，其相關研究仍持續在發展，目前已有許多研究探討其調控機制以及 minicellulosome 合成與應用方面。然而，關於另一具高結晶性纖維分解能力的厭氣性真菌系統研究卻相對不足，

目前研究範疇仍以相關基因的選殖及異源表達為主。對於該系統組成分生成、調控 以及其與細菌系統的比較仍相當缺乏。本研究以厭氣性真菌 N. patriciarum J11 為對 象，探討其 cellulosome 系統誘導生成、相關組成分鑑定與基因選殖，並試圖探究此 cellulosome 系統在分解結晶性纖維時，其關鍵組成份的類型。期望相關成果能做為未來厭氣性真菌 cellulosome 系統調控機制研究與應用之基礎。

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1.10 實驗架構及流程

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第二章材料與方法

2.1 藥品、試劑與儀器

(1) 藥品與試劑

Ethanol absolute (Sigma, 32221) Liquid nitrogen

PCI (Phenol: chloroform : isoamyl alcohol = 25 : 24 : 1)

(Amresco, K169) Ethidium bromide (200μg/ml)(Sigma, E8751)

Formamide (Sigma, F9037) Isopropanol (Sigma, 33539) Phenol (Merck, 100206) Chloroform (Sigma, C5312) Glycogen (Sigma, G1508) Mineral oil (Sigma, M8410) Formaldehyde (Sigma, F8775) Agarose (Amresco, J234) Ampicillin (MDBio, GB1046) Tetracycline (Sigma, T3258) Kanamycin (Sigma, K1377) Chloramphenicol (Sigma, S-0378) Streptomycin (Sigma, S-9137) Penicillin-G (Sigma, PEN-NA)

IPTG (isopropylβ-D-thiogalactopyranoside) (Sigma, I6758)

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10 ×PCR buffer (Protech, PTM526) dNTP (2.5mM each, Protech, PTM526) MgCl2 (50mM, Protech, PTM526)

Super-Taq DNA polymerase (Protech, P5a) Taq DNA polymerase (Protech, PTM526) Restriction enzyme: BamHⅠ(NEB) Avicel (Merck, 102330)

Carboxymethyl cellulose (CMC) (Sigma, C4359) Barley β-glucan (Megazyme, 10401)

Oat-xylan (Sigma, X0627) Lichenan (Sigma, L6133) Laminarin (Sigma, L9634) Pachyman (Megazyme, 71001)

10× Formaldehyde gel-loading buffer (Ambion, 8552)

10×MOPS electrophoresis buffer (Ambion, 8671) Agarose gel containing 2.2 M formaldehyde (Sigma, F8775)

TRIZOL^® Reagent (GIBCO BRL, 15596-026) 20×SSC buffer (Amresco, 0918S-2-20XPTM2L) 10× lambda dilution buffer:

1M NaCl, 0.1M MgSO₄‧7H₂O, 0.35 M Tris-HCl (pH7.5).

1× lambda dilution buffer:

100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄,35 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.01﹪(w/v) gelatin.

Britton and Robinson’s universal buffer:

50 mM phosphoric acid, 50 mM boric acid, 50 mM acetic acid.

DNS (dinitrosalicylic acid) solution:

1%(w/v) DNS, 0.2%(w/v) pheno, 0.05%(w/v) sodium sulfate, 20%(w/v) Rochelle salt, 1%(w/v) NaOH.

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Low molecular weight protein marker (LMW) (Pharmacia Biotech, 17-0446-01) Prestained molecular weight marker (MBI, SM0441)

PolyATtract mRNA Isolation Systems Kit (Promega, Z5300)

SMART^TM cDNA Library Construction Kit (BD Biosciences, K1051-1) Gigapack® Ⅲ plus Packaging Extract kit (Stratagene, 200204)

QIAGEN PCR purification kit (QIAGEN, 28106) Gel-extraction kit (QIAGEN, 28706)

pGEM^®-T vector (Promega, A3600) pET21a vector (Novagen, 69740-3)

B-PER^®Bacterial Protein Extraction Reagent (PIERCE, 78266) BCA Protein Assay Kit (PIERCE, 23221)

T7-Tag Affinity Purification Kit (Novagen, 69025-3) Ni-NTA agarose (QIAGEN, 1018244)

Amicon Ultra-15 (Millipore, UFC9 010 08)

(2) 儀器

PE Biosystems DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer ) 核酸計算儀 GeneQuantⅡ (Pharmacia Biotech)

ELISA 光度計 VERSA max microplate reader (Molecular Devices) 高效液相層析儀 AKTA purifier 100 (GE Healthcare Life Sciences)