對 N. patriciarum J11 而言，其無需耗費更多資源去合成相關 cellulase 進行分解以維 持其生長所需的碳源。然而，xylose 和 fructose 在其自然界的生長環境中多為木質 纖維外部組成份半纖維素的組成單元，因此，厭氣性真菌偵測到 xylose 和 fructose 的存在時，其應會啟動調控機制，生成更多相關分解酵素以利其生長。另外，好氣 性真菌 Trichoderma、Aspergillus 與 Penicillium 等 cellulase 系統的研究也指出，當
纖維雙糖濃度低時，其可誘導 celluase 的生成，而高濃度時則是抑制 cellulase 的生 合成(33, 67, 90)。因此，從結果可推測，當 N. patriciarum J11 處於較高濃度纖維雙 糖的生長前期時，其 cellulase 表現量可能受到和好氣性真菌相似的抑制調控，而使 CMCase 表現量較低。
Mountfort 等人(94)曾探討降解產物調控機制(catabolite regulatory mechanisms) 對 N. frontalis PN-1 利用各類單糖及雙糖的影響，並以氫氣產量為生長指標，此菌 異(9)。以 N. frontalis PN-1 及 N. frontalis PN-2 為例，其分別從羊及牛的瘤胃中分離 培養，當以纖維素為碳源時，其生長及所產生之 CMCase 的差異可達 2 倍(93)。由 此亦可看出，厭氣性真菌在不同的環境中已演化出各菌株自已能適應的營養方式。
當以多醣類，特別是不可溶的纖維素為碳源時，菌體一開始所產生的 cellulases 能將這些較不易分解的多醣基質分解成可溶性的寡醣、雙單或單糖，之後再藉由這 些小分子扮演誘導物的角色進而大量生產分解所需的相關分解酶(115, 126, 143)。
N. patriciarum J11 在以 CMC 培養時，其生長情況是所有測試的碳源中最差者，如 同先前研究顯示，多數厭氣性真菌對於 CMC 的利用率普遍都不理想，甚至無法以 其為碳源生長(9)。CMC 為一經羧基甲基化的纖維素，一般只有 endoglucanase 能有 效分解這類基質。主要原因為 endoglucanase 催化區的立體結構呈現裂口狀(cleft)，
它可以隨機或演進式地(processive)分解葡聚醣鏈(glucan chain)而不易受羧基甲基 團的干擾，而 exoglucanase 或 cellobiohydrolase 其立體結構呈現為一長形通道口 (tunnel)，此類酵素多以演進式連續地從還原端或非還原端切出 cellobiose、glucose 或 cello-oligosaccharide，而當其遇到羧基甲基團時，演進式會受阻因而較難分解 CMC(105);因此，CMC 已廣泛地被研究人員作為偵 endoglucanase 活性時所使用的 基質。
比較單糖、雙糖與多醣對CMCase的誘導表現，Avicel、稻桿及木聚醣對N.
patriciarum J11而言是較好的誘導基質。自然界中，微生物無法直接吸收這些巨大
(2) N. patricirum J11 cellulosome 生成
先前研究顯示，相較於半纖維分解酶對基質的專一性，在一些產生cellulase
(3) N. patricirum J11 scaffoldin 偵測
目前結果顯示， N. patricirum J11來源的 重組dockerin融合蛋白質能和其 cellulosome 中 分 子 量 約 79 kDa 之 蛋 白 質 結 合 。 與 其 它 相 關 研 究 結 果 比 較 ， Orpinomyces sp. PC-2其scaffoldins大小約66、94及116 kDa (122);而Piromyces sp.約為 97 kDa，且其木聚醣酶XylA之dockerin可與不同屬之N. patriciarum scaffoldin結合，
其大小約為116 kDa (46)。此結果亦顯現厭氣性真菌cellulosome系統能因不同物種 產生不同大小之scaffoldin進而組成具多樣性的厭氣性真菌cellulosome。厭氣性細菌 而 言 ，dockerin胺基酸序列在不同物種間具有很高之同源性，且其 dockerin與 scaffoldin的結合作用是不具種間甚至是屬間的專一性的。這些結果顯示出厭氣性真
酸之同源性重覆序列;對照厭氣性真菌系統，其為兩個由約40胺基酸組成之同源性 重覆區塊(51)，但在結合時，細菌dockerin的兩個重覆序列都必須同時存在，而真 菌之dockerin在自然界中存在兩個及三個重覆區塊，而在胞外結合作用實驗中，單 一個dockerin亦能具結合能力(111)。因此，真菌的重覆區塊與細菌的重覆序列可能 是代表著不同之結合機制。然而，結合滴定法研究結果指出，N. patriciarum J11來 源的重組dockerin，其Trp-30胺基酸有存在與scaffoldin結合具有重要關係，若與厭 氣性細菌系統比較，其結合作用可能是以疏水性作用力結合(29)。未來，我們仍可 對Tyr-5、Tyr-16與Trp-23進行相同實驗以進一步確認其結合作用力。
目前經由西方雜合分析與蛋白質結合滴定法進行dockerin結合特性的研究結果 顯示，N. patriciarum J11與其它厭氣性真菌Orpinomyces sp. PC-2、N. patriciarum、
Piromyce equi及Piromyce sp. E2相似，其cellulases和hemicellulases所具有的dockerins 能夠與胞外所純化之厭氣性真菌cellulosome結合，此系統應該具有和厭氣性纖維分 解菌系統類似的scaffoldin。至於厭氣或真菌系統dockerin與scaffoldin的結合機制和 特性以及其scaffoldin是否也有與細菌系統類似之cohesin，仍有待其scaffoldin基因的 發現並表達、純化後才能以胞外(in vitro)結合實驗得到進一步的證實。
4.2 N. patriciarum J11 支架蛋白質基因釣取
根據Harhangi等人分析Piromyces sp. E2 DNA library結果顯示，相同或相似的 celluase和hemicellulase基因是聚集在基因組中的一段區域，各基因間約有2 kb以上
4.3 N. patriciarum J11 纖維素分解酶複合體誘導生成
不同碳源培養厭氣性真菌 N. patriciarum J11 時，除了對其生長速率影響外，
對於該菌株所產胞外 CMCase 活性也有顯著差異。Barichievich 等人曾對 N. frontalis EB188 於不同碳源培養條件下探討其培養上清液中具 cellulase 活性的蛋白質差異 性(12)。從六種碳源誘導生成之 cellulosome 對 Avicel 及 CMC 分解活性結果觀察，
N. patriciarum J11 在有為碳源條件下，其仍能生成基礎數量之 cellulosome，而當單 糖及雙糖等易吸收利用之碳源受限時或者只有結晶性纖維為碳源時，此物種可能啟 動另一誘導機制而生成較多量之 cellulosome 以利有效分解結晶性碳源。如圖 3-1 所示，在以結晶性纖維為碳源時，N. patriciarum J11 於前 48 小時之生長速率較於 葡萄糖與纖維雙糖慢，此可能是因為種菌的葡萄糖碳源轉換為結晶性纖維碳源，故 其需一段生長適應期。因此，這段適應期亦可能是其誘導調控大量或更具分解效率 組合之 cellulosome 生成時期。研究指出，Avicel、稻桿為較難分解及複雜之基質，
因此，其所需之分解酵素應屬較多樣或高活性者(14)。此部份實驗中，Avicel、稻 桿及木聚醣為碳源所純化之 cellulosme 其高分子量組成分在蛋白質量比例上都高於 其它三類，故這些組成份應具有對結晶性纖維較高分解活性或其它輔助功能等特 性。
就厭氣性真菌 cellulosome 系統研究發展而言，要更深入認識這種自然界中具 高分解效率的機制，我們除了對於哪些種類 cellulase 扮演持續性表現的角色、哪 些為可誘導的以及其組成分之誘導機制需有基礎的研究外，對於 cellulosome 組成 份中，是否也包含一些不具分解活性但具其它輔助分解功能之蛋白質亦是一值得探 討的範疇。
4.4 N. patriciarum J11 纖維素分解酶複合體組成蛋白質鑑定
N. patriciarum J11 cellulosome組成份經LC/MS/MS分析後，其各個被鑑定之 cellulase的預測結構上皆具有dockerin，顯示目前所分離之組成份確實為可組裝成 cellulosome 中之組成份。六條被鑑定的蛋白質分屬糖苷水解酶GH 5、GH 6及GH 48，
根據celllulase的水解機制GH 6和GH 48屬於外切型(exotype)，且其分別從非還原端 (nonreducing end)及還原端(reducing end)進行纖維素的分解。GH 5 則屬內切型 (endotype)，其可隨機水解纖維素中葡聚醣鏈(glucan chain)的糖苷鍵結。因此，根據 cellulase對纖維素的分解機制，這三類型cellulase能以高效率的協同作用進行結晶性 纖維的分解(11)。
N. patriciarum J11 cellulosome組成份P1與P3皆被鑑定為未知功能的
hypothetical protein且其分子量大於130 kDa。由於目前已發表的厭氣性真菌cellulase
本研究於N. patriciarum J11 cDNA庫選殖到J11 Cel5A、J11 48A及J11 Cel6C三 條celluase基因。由胺基酸序列與資料庫比對結果可知此三條蛋白質皆具錨固區，
故其應為N. patriciarum J11 cellulosome組成份。此結果亦印證N. patriciarum J11 cellulosome組成份蛋白質鑑定結果，在N. patriciarum J11 cellulosome組成份確實存 在三類型之cellulase。另外，N. patriciarum J11所選殖的三條cellulase基因與Piromyce 屬及Orpinomyce屬的cellulase基因具高度同源性，此亦顯現厭氣性真菌在功能性基 因序列的演化上呈現了趨同演化。厭氣性真菌cellulase基因趨同演化的結果可使其 保有高度的相似性質，如高分解活性等特性，而使得厭氣性真菌在的自然界中保有 其競爭優勢。